基因重組及遺傳分析ppt課件

1、第五章 細(xì)菌基因重組及遺傳分析基因重組gene recombination是指不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)移和交換而重新組合的過(guò)程。高等動(dòng)植物和許多產(chǎn)生有性孢子的真核微生物的基因重組都是經(jīng)過(guò)有性世代來(lái)完成。在細(xì)菌中，提供部分遺傳物質(zhì)或少數(shù)基因的一方稱(chēng)為供體donor，而獲得基因的另一方稱(chēng)為受體recipient。第一節(jié) 轉(zhuǎn)化Transformation轉(zhuǎn)化：是指某一基因型的細(xì)胞從周?chē)橘|(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型細(xì)胞的DNA而使受體的基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的景象。轉(zhuǎn)化景象的發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化因子的證明對(duì)促進(jìn)現(xiàn)代分子生物學(xué)的誕生和開(kāi)展產(chǎn)生了宏大的推進(jìn)作用。 在實(shí)驗(yàn)室條件下，通常用CaCl2、cAMP、低溫培育、

2、PEG介導(dǎo)及電脈沖等方法轉(zhuǎn)化細(xì)菌或其它微生物。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過(guò)程大體可分為三個(gè)階段：感受態(tài)的出現(xiàn)DNA的吸附和進(jìn)入DNA的整合感受態(tài)的出現(xiàn) 感受態(tài)competence：是指受體菌細(xì)胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理形狀。一、轉(zhuǎn)化過(guò)程和機(jī)制 細(xì)菌細(xì)胞在特定時(shí)期產(chǎn)生一種稱(chēng)為感受態(tài)因子的小分子蛋白5-10 kD。這種感受態(tài)因子可與細(xì)胞外表受體蛋白結(jié)合，使細(xì)胞產(chǎn)生感受態(tài)特異蛋白，其中包括細(xì)胞壁自溶素。自溶素使細(xì)胞外表的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸顯露來(lái)，使其具有與DNA結(jié)合的活性。因此，當(dāng)細(xì)菌外表出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，就意味著細(xì)菌出現(xiàn)了感受態(tài)。 4. 進(jìn)入細(xì)胞的單鏈與寄主DNA同源區(qū)重組并

3、整合到染色體上革蘭氏陽(yáng)性菌1. 雙鏈DNA片段在DNA結(jié)合蛋白黑色點(diǎn)的協(xié)助下吸附到細(xì)胞外表并由核酸酶紫色橢圓切成缺口2. 由核酸酶降解其中一條單鏈3. 未被降解的單鏈與感受態(tài)特異蛋白相互作用并進(jìn)入細(xì)胞DNA的吸附和進(jìn)入 在流感嗜血菌中，其感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)成一種結(jié)合雙鏈DNA的膜構(gòu)造，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化小體transformasome。該小體吸附DNA后，與細(xì)胞的內(nèi)外膜相交融而轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)側(cè)，再將雙鏈變成單鏈DNA。 轉(zhuǎn)化小體雙鏈DNA被轉(zhuǎn)化小體攝取轉(zhuǎn)化的雙鏈DNA30-50kb結(jié)合到膜受體上很快進(jìn)展同源重組使外源DNA整合到染色體上革蘭氏陰性菌DNA在進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞之前，要經(jīng)過(guò)可逆性吸附和不可逆性吸附?？赡嫖?/p>

4、附的DNA對(duì)DNA酶敏感，并可以洗脫下來(lái)。隨著感受態(tài)細(xì)胞膜蛋白的參與，可逆性吸附逐漸向不可逆吸附轉(zhuǎn)化，不可逆吸附DNA對(duì)DNA酶不敏感。吸附到細(xì)胞外表是雙鏈DNA，而不是單鏈DNA實(shí)驗(yàn)證明：肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化因子在100下逐漸失去轉(zhuǎn)化活性(DNA發(fā)生變性)。在逐漸冷卻過(guò)程中活性逐漸恢復(fù)(單鏈DNA復(fù)性成雙鏈)。闡明完好的DNA雙鏈構(gòu)造對(duì)于轉(zhuǎn)化活性來(lái)說(shuō)是必要的，轉(zhuǎn)化的第一步，需求雙鏈DNA才干結(jié)合到細(xì)胞外表的結(jié)合位點(diǎn)上。當(dāng)DNA吸附后，被酶解開(kāi)成單鏈DNA，只需單鏈DNA才干進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與受體染色體DNA進(jìn)展整合。 流感嗜血菌特異性攝取序列： 5AAGTGCGGTCA 3淋病奈瑟球菌特異性攝取序列

5、：5GCCGTCTCAA 3在流感嗜血菌的染色體上有600個(gè)拷貝的攝取序列。攝取序列雖然只需10-12bp，但很少隨機(jī)地出如今其他物種的DNA序列中，因此這些細(xì)菌對(duì)外源DNA的吸收具有選擇性。為什么有些細(xì)菌對(duì)攝取的DNA有特異性要求呢？近年來(lái)的研討闡明，G-菌和G菌對(duì)單鏈DNA也能進(jìn)展有效轉(zhuǎn)化，但普通是在較低的pH值下進(jìn)展的。外源DNA片段在受體細(xì)胞中的命運(yùn)：外源DNA紅色轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)同源重組整合到染色體上，否那么被降解成核苷酸。 DNA的整合 轉(zhuǎn)化為一樣或相近物種之間的同源重組提供了能夠性，是自然界中基因交換的一條重要途徑，在生物變異和進(jìn)化中起著重要作用。轉(zhuǎn)化的效率決議于以下三個(gè)內(nèi)

6、在要素：受體細(xì)胞的感受態(tài)，決議轉(zhuǎn)化DNA能否進(jìn)入細(xì)胞受體細(xì)胞的限制系統(tǒng)，決議轉(zhuǎn)化DNA在整合前能否被分解供體和受體DNA的同源性，決議轉(zhuǎn)化DNA的整合。由于轉(zhuǎn)化DNA總是與順序一樣或類(lèi)似的受體DNA配合，所以親緣關(guān)系越近的其同源性也越強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率也越高。二、人工轉(zhuǎn)化 經(jīng)過(guò)二價(jià)陽(yáng)離子處置，大腸桿菌等部分G-細(xì)菌能產(chǎn)生感受態(tài)經(jīng)過(guò)制備原生質(zhì)，大多數(shù)細(xì)菌特別是某些G+細(xì)菌 知許多細(xì)菌包括大腸桿菌均無(wú)自然轉(zhuǎn)化的才干，但經(jīng)人工誘導(dǎo)可使它們構(gòu)成感受態(tài)。如：1970年Mandel和Higa首先發(fā)現(xiàn)DNA在含有高濃度Ca2+的條件下可以被受體細(xì)胞攝入和轉(zhuǎn)化，隨后的實(shí)驗(yàn)證明由Ca2+誘導(dǎo)的人工轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中，其

7、轉(zhuǎn)化DNA必需是一種獨(dú)立DNA復(fù)制子。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化隨著研討技術(shù)的改良和閱歷的積累，人們?cè)?jīng)建立了用Ca2+、Mg2+等誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的規(guī)范程序，能對(duì)大腸桿菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等進(jìn)展有效的轉(zhuǎn)化。先將大腸桿菌培育至OD600=0.51接著用50-100mmolL CaCl2處置制備成感受態(tài)細(xì)胞然后將DNA與感受態(tài)細(xì)胞混合在冰浴中反響20-40min進(jìn)展42熱擊可添加DNA的吸收107個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA 最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法是：由于異源的質(zhì)粒DNA分子可以進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，所以大腸桿菌攝取DNA是非選擇性的。PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化不能自然構(gòu)成感受態(tài)的G+細(xì)菌如枯草芽孢桿菌和放線菌

8、，可經(jīng)過(guò)聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，普通用PEG 6000)的作用實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。這類(lèi)細(xì)菌必需首先用細(xì)胞壁降解酶完全除去它們的肽聚糖層，然后使其維持在等滲的培育基中，在PEG存在下，質(zhì)粒或噬菌體DNA可被高效地導(dǎo)入原生質(zhì)體。電脈沖法電穿孔法 在許多細(xì)菌和真核系統(tǒng)中，它們既無(wú)自然的感受態(tài)呈現(xiàn)也不能用上述的方法建立感受態(tài)。因此人們開(kāi)展了一種新的將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞的方法，最突出的是電穿孔(electroporation)法和基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化法。 電穿孔法：是用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜或?qū)⒓?xì)胞膜擊成小孔，使各種大分子(包括DNA)能經(jīng)過(guò)這些小孔進(jìn)入細(xì)胞，所以又稱(chēng)電

9、轉(zhuǎn)化。 電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖的長(zhǎng)度和DNA濃度基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化 基因槍轉(zhuǎn)化法首先由Sanford報(bào)道，該方法是將包裹有DNA的鎢顆粒像子彈一樣用高壓射進(jìn)細(xì)胞并使DNA留在細(xì)胞內(nèi)，特別是留在細(xì)胞器中。用這種方法初次勝利地將DNA導(dǎo)入酵母線粒體并引起線粒體遺傳變化?；驑屴D(zhuǎn)化如今被廣泛地運(yùn)用于植物的轉(zhuǎn)化中三、建立轉(zhuǎn)化方法的戰(zhàn)略 被轉(zhuǎn)化對(duì)象轉(zhuǎn)化受體轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建目的轉(zhuǎn)化方法選擇四、轉(zhuǎn)化運(yùn)用 在轉(zhuǎn)化中，假設(shè)轉(zhuǎn)化因子的兩個(gè)基因是連鎖的，那么它們可以同時(shí)被轉(zhuǎn)化，也稱(chēng)為共轉(zhuǎn)化，連鎖的兩個(gè)基因間隔越近，其共轉(zhuǎn)化頻率越高，反之那么低。利用共轉(zhuǎn)化率和連鎖的二基因間的間隔的反比關(guān)系可進(jìn)展基因定位的任務(wù)

10、。1. 連鎖檢測(cè)2. 遺傳圖譜的繪制基因型數(shù)目trp2his2tyr1+11940+3360+685+418+2600+107+1180trp2+his2+tyr1+供體 trp2-his2-tyr1- 受體的轉(zhuǎn)化類(lèi)型trp2-his2重組率= 2600+107+3660+418 100% = 34% 11940+1180+ 2600+107+3660+418 trp2-tyr1重組率= 2600+1180+3660+685 100% = 40% 11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重組率= 418+1180+685+107 100% = 13% 1194

11、0+3660+418+1180+685+107trp2 his2 tyr1 3413403. 基因中斷4. 插入基因第二節(jié) 接協(xié)作用conjugation 接協(xié)作用：是指在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程，也稱(chēng)細(xì)菌雜交 。 一、接合景象的發(fā)現(xiàn)與證明 Lederberg和Tatum1946年建立了用大腸桿菌K12的兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在根本培育基上能否生長(zhǎng)，來(lái)檢驗(yàn)細(xì)菌雜交或重組存在的方法。在此以前，沒(méi)有人證明細(xì)菌雜交景象。細(xì)菌雜交有別于典型的有性雜交，故稱(chēng)為細(xì)菌接協(xié)作用。A菌株B菌株混合培育后在根本培育基中出現(xiàn)的原養(yǎng)型菌落能否是雜交的結(jié)果？必需求排除以下幾種解釋?zhuān)阂?/p>

12、是細(xì)菌細(xì)胞并沒(méi)有接合，而是交換了DNA(轉(zhuǎn)化作用)二是細(xì)胞并未接合，而是經(jīng)過(guò)培育基交換了養(yǎng)料(互養(yǎng))三是細(xì)菌細(xì)胞并未接合而是親本發(fā)生了回復(fù)突變當(dāng)時(shí)Lederberg和Tatum曾經(jīng)證明，當(dāng)把A菌株的培育液經(jīng)過(guò)滅菌，再參與到B菌株的培育液中，沒(méi)有原養(yǎng)型菌落，這闡明上述實(shí)驗(yàn)并非轉(zhuǎn)化的結(jié)果。1950年，Davis經(jīng)過(guò)他的U形管實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持了Lederberg和Tatum的結(jié)論。1. 轉(zhuǎn)化作用的排除營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞經(jīng)過(guò)培育基交換養(yǎng)料而生長(zhǎng)的景象亦稱(chēng)為互養(yǎng)。2. 互養(yǎng)的排除在A- B+ T1s和A+ B- T1r的雜交中，將基因型A- B+ T1s和A+ B- T1r兩種細(xì)菌在根本培育基上混合培育，接觸

13、較短的一段時(shí)間以后，噴上噬菌體T1，把A- B+ T1s細(xì)菌殺死。經(jīng)培育以后仍有原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)，這闡明原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)并非由于互養(yǎng)。 由于大腸桿菌的突變率普通都10-8，假設(shè)兩個(gè)基因同時(shí)回復(fù)突變，那么其能夠性只需10-1610-810-8，這種幾率在平板上是很難檢測(cè)到的，所以混合培育能出現(xiàn)10-510-6頻率的菌落一定是重組的結(jié)果。3. 回復(fù)突變的排除4. 遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移 正交實(shí)驗(yàn)AStrsBStrr用鏈霉素將A菌株殺死重組體的數(shù)目變化不大(A) Strr (B) Strs將B菌株殺死一個(gè)重組體也沒(méi)有出現(xiàn)反交實(shí)驗(yàn)Amet- bio-Strr或Strs Bthr- leu- thi-Strs

14、或StrrHayse1952用正反雜交實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)菌重組的發(fā)生只是染色體一方向的轉(zhuǎn)移，而且染色體的轉(zhuǎn)移往往不完全。 把A菌株以為是供體，而B(niǎo)菌株是受體A菌株作為遺傳物質(zhì)的供體，當(dāng)鏈霉素對(duì)它進(jìn)展滅活以后，并未影響它傳送遺傳物質(zhì)的才干。B菌株作為遺傳物質(zhì)的受體，一旦被鏈霉素殺死以后，必然不能出現(xiàn)重組體。供體菌株又稱(chēng)為雄性細(xì)胞，受體菌株又稱(chēng)為雌性細(xì)胞StrrA突變型不育變種置冰箱1年后供體的A菌株Strr B菌株Strs可育的StrsA菌株共培育，一同繁衍不能得到雜交子StrrA菌株 B菌株Strs恢復(fù)了StrrA突變型的可育性F質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn) (Hayes) 大腸桿菌的供體或雄性細(xì)胞(如A菌株)記為F

15、+，帶有一個(gè)性因子或致育因子F (fertility factor)，而另一個(gè)不帶性因子F的受體或雌性細(xì)胞(如B菌株)叫做F-； 雜交F+F-是可育的，雜交F-F-是不育的； F因子可以傳送，從F+到F-細(xì)菌，但必需經(jīng)過(guò)細(xì)胞接觸 F因子可以自發(fā)喪失，一旦喪失就不能再恢復(fù)，除非從另一個(gè)F+細(xì)胞再把它傳送過(guò)來(lái)。分析結(jié)果：F因子是染色體外的一種遺傳構(gòu)造，也就是質(zhì)粒(plasmid)。 F+是一種遺傳性狀F 因子的存在使細(xì)菌成為F+F 因子的喪失使細(xì)菌成為F-F+ 細(xì)菌分裂仍得到F+細(xì)胞二、F質(zhì)粒的構(gòu)造及其在細(xì)胞中的存在形狀 F質(zhì)粒的遺傳構(gòu)造 F質(zhì)粒的基因組由三個(gè)主要區(qū)段組成：轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制區(qū)、插入?yún)^(qū)。

16、長(zhǎng)度為33 kb，由23個(gè)基因組成，構(gòu)成一個(gè)tra支配子(tra operon)。tra ABCEFGHKLQUVW與性菌毛的構(gòu)成有關(guān)tra YZMIGD等與F因子的轉(zhuǎn)移有關(guān) traG、traN 影響雜交對(duì)的配對(duì)構(gòu)成與否 traI、traM 決議DNA轉(zhuǎn)移起始 traI 編碼解旋酶I(helicase) traD 控制DNA轉(zhuǎn)移； traY、traZ 編碼的核酸內(nèi)切酶能在轉(zhuǎn)移起始區(qū) oriT上切開(kāi)一個(gè)缺口。1轉(zhuǎn)移區(qū)(transfer region)復(fù)制區(qū)擔(dān)任F質(zhì)粒的自我復(fù)制F質(zhì)粒自主復(fù)制區(qū)為oriVVegetative origin of replication，在oriV中包含有復(fù)制起點(diǎn)。F

17、質(zhì)粒的復(fù)制是按型方式進(jìn)展復(fù)制，它是一種嚴(yán)緊型質(zhì)粒。F質(zhì)粒的拷貝數(shù)能被準(zhǔn)確地控制，一個(gè)寄主細(xì)胞約有12個(gè)F質(zhì)粒。repF replicative protein編碼一組與F質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)。incincompatibility基因產(chǎn)物使細(xì)胞具有不相容性。2復(fù)制區(qū)replication regionF質(zhì)粒插入?yún)^(qū)包含4個(gè)插入順序：2個(gè)IS31個(gè)IS21個(gè)Tn1000它們與F質(zhì)粒的整合、切除、易位有關(guān) 3插入?yún)^(qū)insertion region2. F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在方式 根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有無(wú)F質(zhì)粒及F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在形狀可將細(xì)胞分為4種類(lèi)型：F-、F+、Hfr、F。F-：是細(xì)胞內(nèi)不含F(xiàn)質(zhì)粒；

18、F+：是細(xì)胞內(nèi)含有F質(zhì)粒且獨(dú)立染色體外；Hfr菌株(high frequency recombination strain)：高頻重組菌株：是F質(zhì)粒整合到宿主的染色體上，隨著宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制；F是指攜帶了宿主的一部分染色體的F質(zhì)粒。 三、F質(zhì)粒與接協(xié)作用 1. F+F-雜交有F質(zhì)粒的細(xì)胞在形狀學(xué)上可以與F-明顯區(qū)別。除了共有的大量外表菌毛以外，F(xiàn)+還有少量通常在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中只需13根性菌毛。纖細(xì)的蛋白質(zhì)性菌毛有的長(zhǎng)數(shù)毫米，直徑約為8nm。性菌毛在細(xì)菌的接合過(guò)程中起著非常重要的作用。 2. HfrF-雜交 Hfr菌株是怎樣構(gòu)成的呢? F質(zhì)粒有兩種方式整合到染色體上：同源重組、質(zhì)粒和染色

19、體共有插入序列和轉(zhuǎn)座子。大腸桿菌染色體基因組有7個(gè)IS1、13個(gè)IS2及6個(gè)IS3；F質(zhì)粒有1個(gè)IS2和2個(gè)IS3。 3. FF-雜交 F質(zhì)粒在脫離Hfr細(xì)胞的染色體時(shí)也會(huì)發(fā)生過(guò)失，從而構(gòu)成帶有細(xì)菌染色體基因的F質(zhì)粒。而F因子又可經(jīng)過(guò)交換交融到細(xì)菌染色體的原來(lái)位置上，回復(fù)到原來(lái)的Hfr形狀。由于在FF-接合運(yùn)用中能專(zhuān)注性地向F-轉(zhuǎn)移F質(zhì)粒攜帶的供體基因，因此經(jīng)過(guò)F因子的轉(zhuǎn)移而使受體菌改動(dòng)其遺傳性狀，這種景象也被稱(chēng)為F 因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。四、中斷雜交實(shí)驗(yàn)和基因定位 中斷雜交：就是將兩個(gè)菌株例如Hfr a+ strsF- a strr在培育液中進(jìn)展通風(fēng)培育，每隔一定時(shí)間取樣，把菌液放入組織搗碎器里攪拌以中

20、斷雜交，經(jīng)過(guò)稀釋接種到鑒別培育基上，待構(gòu)成菌落后鑒定它們的基因型。 1957年Wollman和Jacob初次進(jìn)展中斷雜交實(shí)驗(yàn)：供體菌：HfrH strs thr+ leu+ azis tons lac+ gal+受體菌： F- strr thr leu- azir tonr lac- gal-0 azi ton lac gal F0 thr lac trp his thy arg str F2 8 27 45 61 69 73Peptide-induced transfer of Enterococcus faecalis plasmid pCF10. (A) Peptide pheromon

21、e cCF10 (triangles) is expressed from the chromosome of both plasmid-containing donor cells and plasmid-free recipient cells. Inhibitor peptide (stars) is expressed from pCF10 and secreted into the medium to prevent pheromone from the donor cell from inducing itself, probably through competitive bin

22、ding to the pheromone binding protein PrgZ. (B) Pheromone from a nearby recipient cell is detected by PrgZ. PrgZ imports the peptide pheromone using the chromosomally encoded Opp (Oligopeptide permease) system. (C) Imported cCF10 induces expression of transfer genes, including the cellsurface adhesi

23、n PrgB. (D) PrgB mediates aggregation of the donor and recipient cells. A mating channel is then formed and single-stranded pCF10 is transferred to the donor cell via a rolling circle mechanism. After pCF10 has established itself in the recipient cell, the inhibitor peptide and another mechanism of

24、negative control, PrgY, is expressed to prevent self-induction by endogenous cCF10.第三節(jié) 轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction) 轉(zhuǎn)導(dǎo)：是利用噬菌體為媒介，將供體菌的部分DNA轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的景象。由于絕大多數(shù)細(xì)菌都有噬菌體，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)作用較普遍。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA位于噬菌體蛋白外殼內(nèi)，不易被外界的DNA水解酶所破壞，所以比較穩(wěn)定。 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：被轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段僅僅是那些接近染色 體上溶源化位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：任何供體的染色體都可以轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞1952年Lederberg和他的學(xué)生Zinder把鼠傷寒沙門(mén)菌的

25、一個(gè)突變菌株LT22(trp-)和另一個(gè)突變菌株LT2(his-)在根本培育基上進(jìn)展混合培育，結(jié)果在107細(xì)胞中得到大約100個(gè)原養(yǎng)型菌落。 一、轉(zhuǎn)導(dǎo)景象的發(fā)現(xiàn) LT2菌株LT22菌株中間用濾板隔開(kāi)U形管實(shí)驗(yàn) 可過(guò)濾因子并不由于DNA酶的處置而失活； 可過(guò)濾因子和從溶源性的LT22菌株得來(lái)的噬菌體(稱(chēng)為 P22)具有一樣的大小和質(zhì)量； 可過(guò)濾因子加熱后失活，用抗P22血清處置后也失活； 把P22與 LT2和LT22菌株分別混合培育，在根本培育基上不出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。結(jié)果證明了可過(guò)濾因子是溫暖噬菌體P22。這就是最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)景象。 經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，證明可過(guò)濾因子具有以下一些特性：轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有三

26、個(gè)組成部分，即供體、噬菌體和受體。這種導(dǎo)致基因重組的方式不同于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化需求供體DNA和受體細(xì)胞接觸，而轉(zhuǎn)導(dǎo)那么是以噬菌體為媒介將供體遺傳物質(zhì)傳給受體，無(wú)需DNA和受體細(xì)胞接觸。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)又可分為完全轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。二、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)1. 完全轉(zhuǎn)導(dǎo)P1 供體 搜集子代噬菌體菌苔計(jì)數(shù)噬菌體完全培育基受體缺陷型大腸桿菌選出重組子轉(zhuǎn)導(dǎo)子根本培育基侵染 裂解 侵染野生型轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率= 轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù) 100% = 轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù) 100% 侵染受體的P1顆粒數(shù) 噬菌斑數(shù)+轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)2. 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)3. 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研討中的運(yùn)用 (1)共轉(zhuǎn)導(dǎo)： 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要運(yùn)用之一是經(jīng)過(guò)

27、測(cè)定共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率進(jìn)展基因定位，所謂共轉(zhuǎn)導(dǎo)(cotransduction)是指兩個(gè)處在一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)片段上的基因一同整合進(jìn)受體染色體中。 被共轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩個(gè)基因之間的間隔不能超越轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體所能包裝的DNA長(zhǎng)度，而且越是嚴(yán)密連鎖的基因其共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率也越高。F為共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，d 為基因間間隔，L為轉(zhuǎn)導(dǎo)片段長(zhǎng)度這里指噬菌體基因組長(zhǎng)度，用分鐘表示F = (1 d/L)3 d = L (13F)以thr+leu+為供體，以thr-leu-為受體的P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，得到1%的thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，計(jì)算thr和leu之間的遺傳圖距。P1噬菌體基因組約為大腸桿菌染色體長(zhǎng)度的2.4% d = 2.4 (130.01) =

28、 2.4 (1-0.215) = 1.883 (2)三點(diǎn)雜交法：P1噬菌體所進(jìn)展的共轉(zhuǎn)導(dǎo)被廣泛運(yùn)用于大腸桿菌的基因定位中。1955年Lennox用P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主大腸桿菌染色體，研討基因連鎖關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，thr和leu有時(shí)能、有時(shí)不能與第三個(gè)基因ara共轉(zhuǎn)導(dǎo)。 實(shí)驗(yàn)選擇基因測(cè)定的基因 1 ara+75% leu+, 0% thr+ 2 thr+ leu+85% ara+他用P1噬菌體感染供體(thr+ leu+ ara+)，用所得到的噬菌體裂解液去感染受體菌(thr- leu- ara-)，得到的結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)1可知：ara基因與leu基因靠得較近，而與thr基因相距較遠(yuǎn)，陳列順序應(yīng)是thr-a

29、ra-leu或thr-leu-ara。假設(shè)是前一種情況，那么thr+ leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該大多數(shù)含有ara+基因；假設(shè)是后一種方式，那么thr+ leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該很少含有是ara+，或者根本沒(méi)有。而由實(shí)驗(yàn)2可知，thr+ leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子同時(shí)又是ara+的占85，所以上述3個(gè)基因的陳列順序是第1種。三、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specialized transduction) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：是指以噬菌體為媒介，只能將供體菌特定的一個(gè)或幾個(gè)基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的轉(zhuǎn)導(dǎo)景象。導(dǎo)致局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的普通都是溫暖噬菌體，它們?cè)诠w菌染色體上具有特定的整合位點(diǎn)。在某些條件下，當(dāng)這種整合狀的原噬菌體脫離寄主染色體時(shí)，偶爾會(huì)將整合位

30、點(diǎn)兩端相鄰的基因錯(cuò)誤地切離下來(lái)，并組裝到噬菌體顆粒中。當(dāng)這種噬菌體感染另一細(xì)菌時(shí)，就將原寄主的基因轉(zhuǎn)移到另一細(xì)菌中。1高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的原理不正常環(huán)出構(gòu)成特殊性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒這種缺陷噬菌體亦是轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，它具有感染才干，能整合到寄主染色體一樣的位點(diǎn)上構(gòu)成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。所得轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率約為10-6，稱(chēng)為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)攜帶有g(shù)al基因的缺陷噬菌體和正常的噬菌體在同一細(xì)胞時(shí)，正常噬菌體整合到寄主的染色體上后，產(chǎn)生兩個(gè)雜合(細(xì)菌/噬菌體)att位點(diǎn)，dgal缺陷噬菌體就可以整合到該位點(diǎn)上。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子的構(gòu)成雜基因子重組性轉(zhuǎn)導(dǎo)再次整合導(dǎo)致溶源性轉(zhuǎn)導(dǎo)正常噬菌體協(xié)助dgal缺陷噬菌體整合和繁衍，因此被稱(chēng)為助手噬菌體helpe

31、r phage。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)子不穩(wěn)定，由于原噬菌體很容易被誘導(dǎo)切離下來(lái)。在這種切離的裂解物中，有一半是正常噬菌體，另一半為dgal缺陷噬菌體。假設(shè)用這種裂解物去轉(zhuǎn)導(dǎo)另一個(gè)Gal-菌株，其轉(zhuǎn)化頻率實(shí)際上可達(dá)50%，所以也稱(chēng)之為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。CRISPR構(gòu)造及作用機(jī)理CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)為規(guī)律成簇間隔短回文反復(fù)，是一類(lèi)廣泛分布于細(xì)菌和古菌基因組中的反復(fù)構(gòu)造。CRISPR經(jīng)過(guò)與一系列相關(guān)蛋白、前導(dǎo)序列一同，為原核生物提供對(duì)抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫才干。 這種構(gòu)造最早于1987年在大腸桿菌(Es

32、cherichia coli) K12的iap基因側(cè)翼序列中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)，科學(xué)家利用這個(gè)小片段找到了一種操作簡(jiǎn)單、可對(duì)多種生物的基因組進(jìn)展遺傳改造的工具CRISPRCas系統(tǒng)。 后續(xù)的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)也證明，這些CRISPR序列與很多病毒或者質(zhì)粒的DNA序列是互補(bǔ)的，很有能夠是生物體抵御病毒等外來(lái)人侵者的一套特異性防御機(jī)制，就像是另外一套順應(yīng)性免疫反響系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)根本構(gòu)造 CRISPR系統(tǒng)由前導(dǎo)序列l(wèi)eader sequence，LS、 CRISPR基因座以及一系列Cas CRISPR-associated蛋白組成。Leader序列： Leader序列前導(dǎo)序列由300500b

33、p堿基組成，位于CRISPR的5端，與第一個(gè)反復(fù)序列直接相連，是一段在物種內(nèi)相對(duì)保守的AT富集的區(qū)域。有研討闡明前導(dǎo)序列是新插入序列的識(shí)別位點(diǎn)，也有研討指出，它可以作為啟動(dòng)子，啟動(dòng)CRISPR基因座的轉(zhuǎn)錄。CRISPR基因座：CRISPR基因座由簡(jiǎn)短穩(wěn)定的同向反復(fù)序列(direct repect，DR)和長(zhǎng)度相近的非反復(fù)的間隔序列(spacer)間隔陳列而成，稱(chēng)為R-S構(gòu)造。其中反復(fù)序列的片段長(zhǎng)度在2148b，且含有57 bp的回文序列，通常能構(gòu)成穩(wěn)定的莖環(huán)構(gòu)造，間隔序列的長(zhǎng)度在2672 bp，能夠來(lái)源于噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA序列。Cas基因：cas基因是存在于CRISPR位點(diǎn)附近的一系列基因，cas基因簇通常由410個(gè)保守基因組成，它表達(dá)出的cas蛋白對(duì)CRISPR防御機(jī)制的實(shí)現(xiàn)不可或缺。cas基因根據(jù)其保守程度可分為中心cas基因、亞型特異