基因結(jié)構(gòu)與表達分析的基本策略ppt課件

1、1基因構(gòu)造與表達分析的根本戰(zhàn)略Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes分子生物學(xué)系22分子生物學(xué)的三大中心技術(shù)DNA序列分析DNA測序，1977聚合酶鏈?zhǔn)椒错慏NA擴增，1985DNA重組技術(shù)基因克隆，19733一、DNA序列分析二、核酸分子雜交三、聚合酶鏈?zhǔn)椒错懰?、基因芯片和微陣列五?Western免疫印跡主要內(nèi)容4一雙脫氧末端終止法 (Sanger ,1977)一、DNA序列分析二DNA自動化序列分析三化學(xué)降解法(Gilbert ,1977)5Frederick Sanger1918 Walter Gilbert193

2、2 The Nobel Prize in Chemistry 1980Paul Berg19266DNA測序技術(shù)根底：高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE技術(shù)，可分別差別僅1個堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。 7(一雙脫氧末端終止法dideoxy chain termination 8ATP、dATP和ddATP的構(gòu)造ATPAOHOHHHdATPddATPNTP: 核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合稱；dNTP: 脫氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP；ddNTP: ddATP、ddGTP、d

3、dCTP 、ddTTP；9摻入N個核苷酸DNA合成反響方式圖10DNA單鏈模板引物 摻入ddNTP延伸的新合成鏈 末端終止111. 雙脫氧末端終止法原理 DNA合成反響中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能與下一個核苷酸的5-磷酸基團構(gòu)成3，5-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA新鏈的延伸提早終止于ddNTP 。12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPA G C T5 T4711G A A T G A 3ACGCT132. DNA測序主要步驟14A反響管G反響管G反響管T反響管C反響管T反響管1516 G A T C17 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 單鏈DNA模板的制備

4、DNA模板與測序引物退火 摻入法標(biāo)志反響 延伸-終止反響 放射自顯影 閱讀測序結(jié)果測序步驟 18二DNA測序自動化原理 采用4種不同的熒光分別標(biāo)志4種ddNTP終止反響產(chǎn)物，替代放射性同位素標(biāo)志是實現(xiàn)DNA測序自動化的根底。19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5 TG A A T G A 3ACGCT2021表示一個SNP位點，該位點出現(xiàn)了雙峰，對應(yīng)的核苷酸分別為C和T,因此該位點為CT雜合型，假設(shè)該位點只需一個峰C或者T，那么該位點基因型為CC或TT純合型22DNA自動測序步驟 4種不同熒光染料標(biāo)志終止物ddNTPsSanger測序反響反響產(chǎn)物同一泳道

5、電泳分別 激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光 熒光信號采集、計算機分析與DNA自動排序23Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 24 與末端終止法不同，化學(xué)降解法是建立在對原有DNA的化學(xué)降解過程根底上。 三化學(xué)降解法25 將待測DNA片段3或5端進展同位素標(biāo)志，標(biāo)志的DNA片段分成五個反響，分別用不同的化學(xué)試劑處置，呵斥堿基特異性切割，使DNA片段分別于某一種類堿基處斷裂。電泳分別5組DNA混合物，放射自顯影檢測末端標(biāo)志的DNA鏈的電泳區(qū)帶位置?；瘜W(xué)降解法原理26 化學(xué)降解G反響方式圖 硫酸

6、二甲酯哌啶MetMetMetMet27最新測序技術(shù)454技術(shù)(Roche )焦磷酸測序Pyrosequencing Solexa測序技術(shù)(Illumina )SOLiD技術(shù)(ABI )銜接法測序28舉例：Solexa測序HiSeq 200029Solexa 測序：在一個反響中同時參與 4 種核苷的標(biāo)簽，采用邊合成邊測序 SBS sequencing by synthesis 。 完成人類基因組草圖不同測序儀的比較圖30二、核酸分子雜交Nucleic Acid Hybridization 一Southern印跡雜交：檢測DNA (Southern blot hybridization) Sout

7、hern EM , 1975二Northern印跡雜交：檢測RNA (Northern blot hybridization) Stark GR，197731核酸分子雜交原理 標(biāo)志的單鏈核酸探針與待檢測的靶單鏈DNA或RNA部分互補結(jié)合構(gòu)成雜交雙鏈。 運用：核酸靶DNA或RNA序列的定性與定量分析。323333印跡技術(shù) 利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。 這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting, 譯為印跡技術(shù)。3434探針技術(shù) 用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)志其末端或全鏈的知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針。 探針可以

8、與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判別能否有同源的核酸分子存在。 35Southern印跡雜交原理 將電泳分別的待測DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)志的核酸探針進展雜交的過程。 一Southern印跡雜交運用：DNA基因組DNA分子的定性或定 量分析。361. 制備基因組DNA2. 用限制性內(nèi)切核酸酶消化基因組DNA 3. 瓊脂糖凝膠電泳分別DNA酶切片段4. 凝膠預(yù)處置如強堿，DNA雙鏈變?yōu)閱捂?5. Southern 印跡轉(zhuǎn)移 6. 標(biāo)志核酸探針、探針與DNA片段雜交7. 雜交結(jié)果顯示 Southern印跡雜交根本過程37Southern印跡雜交表示圖38 將電泳分別的

9、待測DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)志的核酸探針進展雜交的過程。 3940地中海貧血的Southern blot 基因診斷1僅一條染色體上的一個基因缺失或缺陷，那么鏈的合成部分受抑制，稱為+地貧；2每條染色體上的2個基因均缺失或缺陷，稱為0地貧； (3) 1、2序列根本一致；基因不同程度的缺失可引起不同類型的地中海貧血。12+ + +0 + 0 0 041BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe地中海貧血的直接基因診斷42 / /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺414kb10kb43二Northern印跡雜交

10、(Northern blot hybridization) 指將RNA變性及電泳分別后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反響來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 用于mRNA進展定性和定量分析。 44RNA瓊脂糖凝膠電泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S運用舉例45GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 雜交分析mRNA的表達靶 mRNA3-磷酸甘油醛脫氫酶 4646三、其他雜交技術(shù)1. 斑點雜交 (dot blot hybridization 將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或

11、尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量研討。47472.原位雜交in situ hybridization 用標(biāo)志的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測核酸互補序列雜交，可對核酸進展定性、定位和相對定量分析。 48 3核酸酶S1 維護分析法 (nuclease S1 protection assay 單鏈DNA探針與待測RNA構(gòu)成DNA/RNA雜交雙鏈，參與核酸酶S1專注性地降解未構(gòu)成雜交體的DNA或RNA單鏈，DNA/RNA雜交雙鏈那么遭到維護而不被降解。 494RNA酶維護分析法 RNase protection assay，RPA50RPA根本程序：待測RNA的分別體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)志R

12、NA探針待測RNA與探針RNA進展液相雜交 RNA酶消化不同大小雜交片段凝膠電泳分別51三、聚合酶鏈?zhǔn)椒错?Polymerase Chain Reaction, PCR)一PCR技術(shù)原理二耐熱DNA聚合酶三PCR引物及設(shè)計原那么四PCR條件的優(yōu)化 五PCR改良技術(shù)六其它PCR技術(shù)52聚合酶鏈?zhǔn)椒错?PCR) :一PCR技術(shù)原理 Mullis K. 1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸體外擴增技術(shù)。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 53The replication of DNA54 原理：PCR是模擬天然DNA復(fù)制過程，利用DNA 聚合酶催化一對

13、引物間特異DNA片段合成的體外擴增技術(shù)。 其主要熱循環(huán)過程為：變性、退火、延伸三個步驟。551. PCR循環(huán)由三步組成： 變性denaturation退火annealing延伸extension高溫適宜溫度適宜溫度5657582. PCR擴增終產(chǎn)物大小: 介于兩條退火引物5末端之間的雙鏈DNA片段。循環(huán)一59循環(huán)二60循環(huán)三61一對引物：正向和反向限制了PCR擴增的片段的范圍5/5/3/3/5/5/3/3/62 5CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACA

14、TGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG 3GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT 3. 引物設(shè)計實例63

15、 Y=A1+En Y: 擴增產(chǎn)物的量 A: 最初靶DNA分子數(shù) E: PCR擴增效率 n: 循環(huán)次數(shù)3. PCR產(chǎn)量 當(dāng)E100, A=1時 Y=2n 2n(引物延伸產(chǎn)物的量64二平臺期與平臺效應(yīng)1. 平臺效應(yīng)plateau effect： PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是進入線性增長期或靜止期，即平臺效應(yīng)。影響要素： 引物及dNTP底物濃度降低。 酶與模板比例下降。65PCR平臺效應(yīng)66二耐熱DNA聚合酶Taq DNA聚合酶實現(xiàn)了PCR自動化 從嗜熱水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分別出來。 95的半衰期: 40 min 最適溫度: 72 8

16、0 催化反響速率: 150300核苷酸 / 秒/ 酶分子6768Taq DNA聚合酶特性： 53聚合酶活性； 53外切酶活性； 較弱的非模板依賴性； 缺乏35外切酶活性。69PCR thermal cycler70PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR產(chǎn)物71無機離子及抑制劑的影響 Taq DNA聚合酶的活性對Mg 2+ 濃度和單價離子K+或NH4+的性質(zhì)和濃度較敏感。 最適Mg 2+濃度：2 mmol/L K+濃度：50 mmol/L72 幾種高保真的耐熱DNA聚合酶 1. Tth DNA聚

17、合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶73三PCR引物設(shè)計原那么引物的化學(xué)本質(zhì)是什么？單鏈寡核苷酸DNA或RNA片段。DNA復(fù)制引物：單鏈RNA片段PCR引物： 單鏈DNA片段74PCR引物設(shè)計原那么：1.引物與模板的序列要完全互補2.引物與引物之間防止構(gòu)成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾構(gòu)造3.引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反響(錯配)755CACTGAACGTAGGCCT3 3GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5特異擴增5CACTGAACGTAGGCCT33GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5錯誤引發(fā)1. 引物與模

18、板的序列要嚴(yán)密互補2. 引物不能在模板的非目的位點引發(fā) DNA聚合反響(錯配)76引物之間應(yīng)防止3端互補3.引物與引物之間防止構(gòu)成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾構(gòu)造77引物本身不應(yīng)構(gòu)成發(fā)夾構(gòu)造784.其它原那么: 引物長度: 1030 nt 堿基分布: A、T、G、C 隨機分布 G+C含量：40 60% Tm=4(G+C)+2(A+T) 引物3末端堿基：最好選T、C、G，不選A 防止出現(xiàn)3個以上的延續(xù)堿基，如GGG或CCC 引物5末端堿基可不與模板DNA互補791 A260 oligo DNA33gN: 引物堿基數(shù)X：合成的oligo DNA A260單位Y：引物的pmol數(shù) 106 Ypmol= X33

19、 330 . N X = 105 N 2. 引物用量計算80模板引物Taq DNA聚合酶dNTPMg2+退火變性延伸PCR反響81四PCR條件的優(yōu)化1. Taq DNA聚合酶濃度： 1.02.5 U/100 l反響液 2. dNTP濃度：20200 mol/L 3. Mg2+濃度：0.52.5 mmol/L 4. 引物濃度：0.10.5 mol/L82五PCR改良技術(shù)1. RT-PCR (reverse transcription PCR) 以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進展PCR反響。83RT-PCR原理84逆轉(zhuǎn)錄酶 AMVavian myeloblastosis

20、virus 酶活性最適溫度42 MMLVMoloney murine leukemia virus：最適溫度37 852. 定量RT-PCRQRT-PCR半定量RT-PCR 以樣本mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在不同引物對引導(dǎo)下共同PCR擴增“看家基因和目的基因cDNA 。86 選擇內(nèi)對照基因 組織中普遍表達、表達量比較恒定的“看家基因mRNA。如GAPDH和 -actin mRNA等。 半定量規(guī)范 計算PCR 產(chǎn)物 ： 靶cDNA /GAPDH cDNA87 KPNA2在正常生理形狀東方田鼠和小鼠體內(nèi)表達分析88893. 實時熒光定量RT-PCRReal-time fluorescent

21、 quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR PCR擴增指數(shù)期內(nèi)極小的擴增效率改動會極大地影響產(chǎn)量。 運用：用于基因DNA拷貝數(shù)和mRNA表達定量分析。 90熒光染料9192 每構(gòu)成一個DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去，染料一結(jié)合就產(chǎn)生熒光信號，信號強度與DNA分子總數(shù)目成正比。93 TaqMan Probe 一種水解式熒光標(biāo)志探針。寡核苷酸探針的5端標(biāo)志一個熒光報告基團reporter ，3端標(biāo)志一個熒光淬滅基團quencher 。94 每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針，每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位信號，信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比。95。 分子信標(biāo)探針Molecular Beacon Probe 該探針具有發(fā)夾構(gòu)造，5端標(biāo)志熒光報告基團，3端標(biāo)志淬滅基團。96探針與靶序列雜交結(jié)合，報告熒光染料與淬滅染料分別，發(fā)出熒光。97實時熒光定量PCR計算原理PCR擴增效率的差別使一樣的樣品最終產(chǎn)量有很大差別9899CT或Tc或Ct值： 臨界點循環(huán)Threshold cycle ，即從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)100101 傳染病診斷、監(jiān)測與療效預(yù)后評價： 提示疾病發(fā)病機制102 熒光定量 PCR儀 帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，配有電腦系統(tǒng)