實(shí)驗(yàn)93RedET同源重組ppt課件

1、Red/ET同源重組技術(shù)2021年3月25日 內(nèi) 容一、 什么是Red/ET同源重組二、 技術(shù)的特點(diǎn)三、 作用機(jī)制四、 功能元件五、操作流程及關(guān)鍵要素六、在基因工程中的主要運(yùn)用七、 新技術(shù)的開展八、在其他細(xì)菌中的運(yùn)用 遺 傳 重 組基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必需維持一個(gè)恰到益處的平衡，這樣才干使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。染色體的遺傳差別主要由兩種 機(jī)制產(chǎn)生，一種是突變，一種是遺傳重組。 重組可分為四類DNA序列、蛋白質(zhì)因子 狹義遺傳重組：涉及到DNA分子內(nèi)斷裂-復(fù)合的基因交流 遺傳重組與重組DNA技術(shù) 異常廣義遺傳重組：任何呵斥基因型變化的基因交流過程一、 什么是Red/ET同源重

2、組1. 概念 Red/ET重組是新近出現(xiàn)的一種利用來自E. coli中 噬菌體的重組酶Red/Red 或者是來自 Rac 噬菌體的重組酶RecE/RecT 進(jìn)展基因同源重組的DNA工程技術(shù)。2. 原理 首先重組酶沿53方向消化雙鏈DNA，顯露粘性末端15-50bp。隨后重組酶介導(dǎo)單鏈退火修復(fù)single- strand annealing，即載體和插入片段的黏性末端15-50bp 互補(bǔ)構(gòu)成穩(wěn)定的帶缺刻的環(huán)狀重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后能自動(dòng)被修復(fù)為閉合的環(huán)狀質(zhì)粒3. 特點(diǎn)： Red同源重組技術(shù)具有同源序列短(1550bp)、重組效率高、操作簡單、快速的特點(diǎn)。4. 運(yùn)用 這種技術(shù)可在DNA靶標(biāo)分子的

3、恣意位點(diǎn)進(jìn)展基因敲除、敲入、點(diǎn)突變等操作,無需運(yùn)用限制性內(nèi)切酶和銜接酶。此外,這種新型重組技術(shù)可直接將目的基因克隆到載體上,目的基因既可來源于細(xì)菌人工染色體也可是基因組DNA。Red同源重組技術(shù)使難度較大的基因工程實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)展,大大推進(jìn)功能基因組研討的開展。g b al phageETRac phage Rac recE/recT 支配子 = red 支配子, 支配子中的重組酶Red/Red 或者RecE/RecT協(xié)同配合完成重組作用； recE = red ：53 dsDNA核酸外切酶； recT = red ：ssDNA結(jié)合和退火蛋白； red： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBC

4、D對外源線性DNA片段的消化。噬菌體的pL支配子表示圖 Reda(RecE)Red同源重組原理表示圖Single-strand annealingStrand invasion35Digestion Binding35Redb(RecT)Repair/ReplicationSelectionRecE/RecT和Red/Red兩重組系統(tǒng)的差別 “線狀DNA線狀DNA重組，選用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)； “線狀DNA環(huán)狀DNA重組，選用Red/Red重組酶系統(tǒng)； 根據(jù)需求選擇含不同抗生素抗性基因Ampr、Hygr、Tetr和不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pBAD、pTet的重組酶系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒。 質(zhì)粒: p

5、SC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)RecE/RecT和Red/Red兩重組系統(tǒng)對不同類型底物重組效率的差別 Red同源重組技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)Nature Genetics (1998)Nature Biotechnology (2000)1. 不依賴RecA蛋白，在重組酶系統(tǒng)Red/Red或RecE/RecT的相互配合下，含短同源臂1550bp的供體DNA分子能直接重組到受體DNA分子上

6、，實(shí)現(xiàn)交換、插入、刪除、突變等；2. 不受靶標(biāo)DNA分子大小的限制；3. 不受內(nèi)切酶切位點(diǎn)的限制；4. 準(zhǔn)確性：不依賴RecA蛋白，減少了引入非預(yù)期的突變、 缺失、交換等的幾率； 5. 簡便快捷：省去了中間質(zhì)粒的構(gòu)建，減少實(shí)驗(yàn)步驟、縮短實(shí)驗(yàn)周期。二、Red/ET同源重組技術(shù)的特點(diǎn)三、 Red/ET重組的作用機(jī)制Red/ET重組鏈入侵模型1.鏈入侵方式Red/ET同源重組鏈退火模型2.鏈退火模型四、 Red/ET重組中的功能元件1. Red、Red和RedRed：以三聚體的方式構(gòu)成“漏斗型活性的蛋白， 5-3外切酶活性。Red構(gòu)造A和與DNA相互作用的方式B圖片來自Subramanian et

7、al. 2003 Red：與ssDNA結(jié)合構(gòu)成絲狀體，催化與互補(bǔ)ssDNA之間的退火。 Red：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶對外源DNA的降解。 2. RecE和RecTRecE：C端39kDa的部分才是5-3外切酶活性必需，對5端為羥基的底物也有活性。 RecT：與ssDNA結(jié)合構(gòu)成絲狀體，催化與互補(bǔ)ssDNA之間的退火。3. RecA 個(gè)亞基構(gòu)成有活性的RecA蛋白，細(xì)菌中廣泛存在且高度保守，有同源重組酶、DNA損傷修復(fù)、DNA依賴ATPase活性等功能。 可誘導(dǎo)SOS反響、挽救DNA復(fù)制叉等，提高電擊后細(xì)胞的活力，添加電轉(zhuǎn)化效率。五、 Red/ET重組操作流程引物設(shè)計(jì)合成線性

8、供體dsDNA底物的制備線性載體的制備重組反響重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞重組子挑選重組子檢測1. 設(shè)計(jì)合成引物 設(shè)計(jì)引物時(shí)要遵照普通引物設(shè)計(jì)的根本原那么，但是上下游引物要加上15-20bp的載體同源序列。載體同源序列如何添加主要分以下兩種情況：1載體酶切后是5端突出或平末端，那么引物上的同源序列包括5端突出序列的同源序列。2載體酶切后是3端突出，那么引物上的同源序列不包括3端突出序列的同源序列。引物設(shè)計(jì)方法同源臂長度對Red/ET重組效率的影響數(shù)據(jù)來自Zhang et al. 1998 同源臂的長度在1550bp時(shí)，重組效率就能滿足實(shí)驗(yàn)要求，重組效率隨著同源臂長度的添加而添加。2. 線性供體ds

9、DNA底物的制備 選用保真度高的DNA聚合酶如Phusion、Pyrobest等，減少PCR反響中的突變；擴(kuò)增GC含量較高的DNA片段時(shí)，選用Triplemaster、HotStarTaq 等，用合成的引物PCR擴(kuò)增獲得dsDNA底物； 純化PCR產(chǎn)物： 1減少模板背景對挑選任務(wù)帶來的難度； 2降低其剩余引物與靶標(biāo)DNA片段的結(jié)合，提高重組效率； 3去處PCR產(chǎn)物中的鹽離子，提高轉(zhuǎn)化效率。 降低模板對挑選任務(wù)帶來的難度； 1純化回收PCR產(chǎn)物； 2內(nèi)切酶消化處置模板； 3運(yùn)用R6K復(fù)制子。 線性化載體可以經(jīng)過酶切或PCR擴(kuò)增兩種方法獲得。1酶切 選取適宜的位點(diǎn)，單酶切或雙酶切皆可,質(zhì)粒的線性化

10、不徹底，將導(dǎo)致陰性克隆的產(chǎn)生，為了提高陽性率，建議經(jīng)過雙酶切進(jìn)展質(zhì)粒線性化。2PCR擴(kuò)增 選取適宜的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)正向和反向引物，引物長度普通在18-20bp左右，建議用高保真的聚合酶擴(kuò)增。為了防止模板質(zhì)粒DNA對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，建議用Dpn I內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，降低背景，提高陽性率。 不論采取哪種方法，最終線性化載體的濃度需50ng/ul，高濃度的載體有利于提高效率。 3. 線性載體的制備4. 同源重組反響試劑加量10 x Buffer1ulRecombination Enzyme1ul線性化載體（50ng/ul） 50-100ng插入片段（50ng/ul）150-200ngdd H2O補(bǔ)足

11、至10ul1配置反響體系 將目的DNA片段和線性化載體以一定的摩爾比加到管子中進(jìn)展重組反響摩爾比可計(jì)算方法見附錄，10 ul體系(見下表) 留意：1.目的片段與載體的摩爾比在2:1-5:1之間，摩爾比低于2:1效率會(huì)降低；2.反響時(shí)間在15-30分鐘，時(shí)間太短不利于重組反響2短暫離心混勻，37孵育15分鐘。3反響終了后，取5-10ul反響液立刻進(jìn)展轉(zhuǎn)化，剩余反響液可在4或-20保管待用。 5.重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞冰上融化一管100 l的DH5感受態(tài)細(xì)胞。參與5-10l反響液到感受態(tài)細(xì)胞中，悄然混勻，冰上孵育30分鐘。42水浴中熱激45-90秒后，冰浴3分鐘。留意：所運(yùn)用的感受態(tài)細(xì)胞效率11

12、08cfu/g.參與890l SOC液體培育基，37復(fù)蘇45-60分鐘。6. 重組子挑選 復(fù)蘇培育物8000rpm離心1分鐘搜集菌體，根據(jù)需求將一定量的菌體均勻的涂布在含抗生素平板上,37倒置培育12-16h后察看菌落生長情況。 運(yùn)用抗生素的最低抑菌濃度，有利于獲得更多的重組子：在10g/mL的卡那霉素平板上重組子的數(shù)目是60g/mL的卡那霉素平板上重組子的數(shù)目的6倍。 抗生素運(yùn)用濃度與Red/ET重組效率的關(guān)系 常用抗生素的任務(wù)濃度7. 重組子的檢測 檢測方法：酶切分析、PCR檢測、平板雙劃線、測序等； 普通采用菌落PCR進(jìn)展陽性克隆鑒定。為防止假陽性結(jié)果，鑒定引物選擇一條為載體特異性引物，

13、另一條引物為目的片段特異性引物。 高拷貝質(zhì)粒修飾存在“質(zhì)粒多聚體 景象； “質(zhì)粒多聚體問題處理方法： 采用“線性DNA+線性DNA重組方式； 利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)； 減低質(zhì)?？截悢?shù)。卡那霉素抗性基因Kan交換pUC19中的氨芐抗性基因Amp“質(zhì)粒多聚體 景象處理方法： 采用“線性DNA+線性DNA重組方式； 利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)； 減低質(zhì)?？截悢?shù)。六、 Red/ET重組技術(shù)的主要運(yùn)用1. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 2. 染色體的修飾 3. 亞克隆Subcloning 4. 直接克隆Direct cloning1. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 (1) 傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)的缺陷 傳統(tǒng)克隆技術(shù)依賴限

14、制性酶切位點(diǎn)和內(nèi)切 酶的消化，當(dāng)短少適宜的酶切位點(diǎn)或者某個(gè)酶切位點(diǎn)在目的片段中大量存在時(shí)，利用內(nèi)切酶消化難以得到相應(yīng)的產(chǎn)物。 方法看似簡單，但實(shí)驗(yàn)周期長。 大片段難以與載體正確銜接。 無法同時(shí)銜接多個(gè)2個(gè)以上的DNA片段。限制性內(nèi)切酶銜接酶步驟1：酶切目的片段步驟2：酶切載體步驟3:目的片段與載體銜接同源重組克隆步驟傳統(tǒng)克隆步驟步驟4:重組子轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞同源重組克隆傳統(tǒng)克隆克隆片段長度50bp-10kb50bp-2kb一次克隆片段數(shù)1-5個(gè)1個(gè)感受態(tài)效率要求1108cfu/ug以上1107cfu/ug以上所用的酶重組酶T4連接酶片段的插入位點(diǎn)任何位點(diǎn)特定位點(diǎn)片段酶切不需要需要載體線性化方法

15、酶切或PCR酶切同源重組克隆與傳統(tǒng)克隆比較插入選擇標(biāo)志插入無選擇標(biāo)志的DNA片段2. 染色體的修飾 E. coli染色體上插入抗性基因 傳統(tǒng)基因工程技術(shù)A和Red/ET重組技術(shù)B修飾E.coli染色體實(shí)驗(yàn)步驟比較B 不同復(fù)制子能承載外源 DNA片段的大小3. 亞克隆Subcloning 4. 直接克隆Direct cloningA亞克隆和直接克隆表示圖Red/ET subcloning亞克隆 pGB-15A載體抗性基因簇直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇3 mg基因組DNA用EcoR V消化Mx unknown PKS gene cluster (36kb)p15A oriCmPKS from other bacteria：Photorhabdus lumineciensPsedumonas flurescencse異源表達(dá)七、