植物相關(guān)軟件與方法emsa

1、2.2.8 凝膠遷移率實驗（EMSA）2.2.8.1 探針的生物素標記探針的標記方法參照 EMSA 探針生物素標記試劑盒（Beyotime, GS008）。2.2.8.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳10TBE bufferTris硼酸55.00g7.44g108.00gNa2EDTA2H2OddH2O 定容至PH1L8.3配制 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠：10TBE30% Acr-0.8% Bis100%甘油 ddH2O TEMED10%（W/V）過硫酸銨0.5mL2.0mL5.0L4.2mL150.0L155.0mLTotal7.0mL以 4預(yù)冷，0.5TBE 為緩沖液，100V 預(yù)電泳 3060mi

2、n。期間準備：2.0L1.0L0.5L10.0L6.5L10EMSA Binding buffer（A） 1g/L Poly（dI.dC）（E）生物素標記探針白提取物ddH2O20.0LTotal室溫反應(yīng) 30min。加入 5L 5loading buffer，“輕輕混勻”后上樣，100V 電泳至膠 2/3 處。2.2.8.3 聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)膜帶正電荷的尼龍膜在 0.5TBE 中至少泡 10min；以預(yù)冷的 0.5TBE 為電轉(zhuǎn)緩沖液 100V 轉(zhuǎn)膠于尼龍膜上，45min，用干凈的墊，盡量避免用 western blots 用過的墊；（3）380mA（100V）電轉(zhuǎn) 30min，一般轉(zhuǎn) 30

3、60min（880.1cm 膠）；（4）電轉(zhuǎn)完成后，將有藍色的一面向上放置干燥；（5）紫外膠連使 DNA 膠連在膜上，紫天，下次檢測前不要讓膜變濕。254nm 照射 4560sec。交連后的膜可干燥保存數(shù)2.2.8.4 核酸（DNA）固定檢測方法以下試劑體積以膜 1010cm 計算，試劑反應(yīng)要在干凈的器皿中，輕輕震蕩。（1）封閉液（blocking buffer）和 4洗脫液（wash buffer）在 3750水中溶解，使沉淀完全溶解；加 20ml 封密液，輕搖 15min；準備封密液中加鏈霉卵白素過氧化物酶（streptarion-horseradish peroxidase）66.7L（

4、1:300）入 20mL 封密液；輕輕倒掉封密液，把 3 配好的溶液倒入膜上，輕輕振蕩 15min；準備 1wash solution（洗脫液） 4洗脫液：40mL 用 ddH2O 稀釋至 160mL；把膜轉(zhuǎn)移入新的容器中，加入 20mL 1wash solution；重復(fù) 6 步驟三次，每次加入 20mL 洗液，每次 5min；把膜轉(zhuǎn)入新容器中，加 30mL SE 感光反應(yīng)平衡液，輕輕振蕩 5min；準備 chemiluminescent substrate working solution6mL Luminol/Enhanser 與 6mL stable peroxide 等體積混合，避光操作，長時間光線可影響結(jié)果；把膜輕輕的從 SE 感光平衡液中取出，輕輕用濾紙吸膜的一端，去除剩余溶液把膜放入一個干凈的平面的容器中；（11）將 9 中溶液倒至膜上，沒過膜。注：帶探針的一面向下，靜置 5min，勿搖。取出膜，在濾紙上