基因工程原理及技術思考題

1、-. z.Chapter I Introduction什么是基因？基因有哪些主要特點？基因是一段可以編碼具有*種生物學功能物質的核苷酸序列。不同基因具有相同的物質基礎.基因是可以切割的。基因是可以轉移的。多肽與基因之間存在對應關系。遺傳密碼是通用的。基因可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代。翻譯并解釋下列名詞genetic engineering遺傳工程gene engineering基因工程：通過基因操作，將目的基因或DNA片段與合適的載體連接轉入目標生物獲得新的遺傳性狀的操作。gene manipulation基因操作：對基因進行分離、分析、改造、檢測、表達、重組和轉移等操作的總稱。rebi

2、nant DNA technique重組DNA技術gene cloning基因克?。菏侵笇蜻M行分離和擴大繁殖等操作過程，其目的在于獲得大量的基因拷貝，在技術上主要包括載體構建、大腸桿菌遺傳轉化、重組子篩選和擴大繁殖等環(huán)節(jié)。molecular cloning分子克隆什么是基因工程？簡述基因工程的基本過程？p2 p4簡述基因工程研究的主要容？p5簡述基因工程誕生理論基礎p2和技術準備有哪些p3？基因表達的產(chǎn)物中，氨基酸序列相同時，基因密碼子是否一定相同？為什么？否，密碼子簡并性舉例說明基因工程技術在醫(yī)學、農業(yè)、工業(yè)等領域的應用。醫(yī)學:人胰島素和疫苗農業(yè):抗蟲BT農藥工業(yè):工程釀酒酵母Chapt

3、er The tools of trade什么是限制性核酸切酶？簡述其主要類型和特點？是一種核酸水解酶，主要從細菌中分離得到。類型特點p11 II型核酸切酶的基本特點有哪些p12-14？簡述影響核酸切酶活性的因素有哪些p14？解釋限制酶的信號活性？抑制星號活性的方法有哪些？什么是DNA連接酶p15？有哪幾類p16？有何不同p16？什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何應用價值？同裂酶：識別位點、切割位點均相同，來源不同。在載體構建方面往往可以取得巧妙的應用。應用較多的同裂酶比如Sma1和*ma1，它們均識別CCCGGG，但前者切后產(chǎn)生鈍末端，后者切后產(chǎn)生粘性末端同尾酶：來源各異，識別序列

4、各不相同，但切割后產(chǎn)生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)產(chǎn)生的 DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補作用彼此連接起來的。什么是DNA聚合酶？根據(jù)DNA聚合酶使用的模板不同，可將其分為哪兩類？各有什么活性？p17-18聚合酶：在引物和模板的存在下，把脫氧核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。依賴于DNA的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶Taq DNA聚合酶：是一種從水生嗜熱菌中分離得到的一種耐熱的dna聚合酶，具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。逆轉錄酶：RNA指導的DNA聚合酶，Klenow片段的特性和

5、用途有哪些？舉例說明。p17名詞解釋：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、甲基化酶:甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主DNA不被相應的限制酶所切割。什么是末端脫氧核苷酸轉移酶？舉例說明其應用之一。P19加p什么是堿性磷酸酶？其在基因工程領域中有哪些用途？p19減p質粒單酶切點的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？目的基因片段與載體由相同的單一限制性核酸切酶消化酶切后，兩者的兩端均具有相同的黏性末端，成為單酶切位點的黏性末端。為了防止載體的自我環(huán)化，通常用堿性磷酸酶去除載體的粘性末端的5p以抑制DNA的自我環(huán)化。若構建表達載體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的

6、基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組，以便定向克隆。gap缺口和nick裂口的區(qū)別？用寡核苷酸和銜接物DNA的短片段連接時為使基因部的切點保護，常用何種辦法解決？哪些酶可用于DNA片段的末端標記？KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合酶在對 DNA片段進行末端補平反應或末端的置換反應時可引入標記的核苷酸。Chapter Host and vectors根據(jù)來源和性質不同，可將基因工程載體分為哪些種類？質粒載體、噬菌體載體、黏粒載體、噬菌粒載體、病毒載體、人工染色體什么是克隆質粒載體？什么是表達質粒載體？什么是穿梭質粒載體？克隆載體是指專用于基因或DNA片段無性繁殖的質粒載體。表達質粒載體是

7、指專用于在宿主細胞中高水平表達外源蛋白質的質粒載體。穿梭質粒載體是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而可以在兩種不同的宿主細胞中存活和復制的質粒載體?；蚬こ讨袑d體的基本要求具有復制子，能在宿主細胞進行獨立和穩(wěn)定的自我復制。具有合適的限制性切酶位點。具有合適的選擇標基因。具有較多的拷貝數(shù)，易于宿主細胞的染色體DNA分開，便于分離提純。具有較小的相對分子質量，易于操作。什么是質粒？質粒分哪幾種？有哪兩種復制類型，質粒的分子生物學特性有哪些？質粒是染色體外能自我復制的小型DNA分子。嚴緊型和松弛型。不親和性轉移性質粒存在的三種形式是什么？共價閉合環(huán)狀DNA開環(huán)DNA線性DNA解

8、釋質粒的不親和性和轉移性？不親和性：兩種不同質粒不能夠在同一宿主細胞系中穩(wěn)定地共存。轉移性：質粒從一個細胞轉移到另一個細胞的特性。接合型質粒和非接合型質粒。接合性質粒和非接合性質粒有何區(qū)別？接合型質粒：相對分子量大，除了攜帶自我復制遺傳信息外，還帶有一套控制細菌和質粒接合轉移的基因，嚴緊型質粒。非接合型質粒：相對分子量小，不能攜帶接合轉移基因。理想的質粒載體應具備哪些條件？具有較小的相對分子質量和較高的拷貝數(shù)。具有多個單一限制性切酶酶切位點。具有兩種以上標記基因。具有安全性。簡述pBR322質粒載體的主要特征？P25構建噬菌體載體的主要容有哪些？為什么野生型的噬菌體DNA不宜作為基因工程載體該

9、如何改造？p28插入型和取代型基因組大而復雜何為-互補，在載體構建中有何作用？-互補：指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶（-galactosidase，由1024個氨基酸組成）陰性的突變體之間實現(xiàn)互補。-互補是基于在兩個不同的缺陷-半乳糖苷酶陰性的突變體之間可實現(xiàn)的功能互補而建立的。將缺失編碼第11-41位氨基酸的-半乳糖苷酶基因稱為lacZM15基因而將半乳糖苷酶基因(lacZ) 的調控序列和編碼-半乳糖苷酶N端140個氨基酸的序列稱為lacZ.這兩個基因的產(chǎn)物單獨存在時都無酶學活性,但混合在一起時卻有酶學活性.所以在載體上加lacZ/(MSC

10、),并在受體菌中引入lacZM15即可實現(xiàn)-互補.IPTG是lac操縱子的誘導物,底物*-gal被-半乳糖苷酶分解后可以產(chǎn)生藍色.如果質粒載體中插入了外源DNA,lacZ的產(chǎn)物則不能與lacZM15基因的產(chǎn)物實現(xiàn)-互補，在IPTG誘導下不能產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，菌落便不可能呈現(xiàn)藍色。白色菌落便是含有插入了外源DNA的重組質粒。因此可利用菌落顏色變化來篩選插入外源DNA的重組質粒。這種方法是根據(jù)組織化學的原理來篩選重組體。主要是在載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌 -半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的載體轉入lac的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（*-gal

11、）平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍色噬菌斑。將外源性DNA克隆到-半乳糖苷酶失活的插入型入噬菌體上后，如何篩選重組噬菌體？簡述單鏈DNA噬菌體M13在基因工程中的主要用途？什么是Cos質粒？簡述其基本特點。什么是酵母人工染色體、細菌人工染色體、哺乳動物人工染色體？從哺乳動物中分離出復制起始區(qū)、端粒及著絲粒構建載體可以克隆大于1000Kb的DNA什么叫插入失活，舉例說明之。名稱來源特點用途M13噬菌體載體M13mp1是構建的第一個M13噬菌體載體，隨后構建的一系列M13載體都是在此基礎上經(jīng)改建派生出來的。可用來克隆具有不同限制末端的外源DNA片段，而且克隆片段插入方向是固定的。1.可

12、以制備單鏈DNA進行DNA序列分析。2.可以制備只與外源DNA的任意一條鏈互補的DNA探針。3.可以在寡核苷酸介導的基因定點突變來制備含有目的基因的單鏈DNA模板。黏粒載體（cosmid vector）先用特定的限制性核酸切酶局部消化真核生物的DNA，產(chǎn)生出高相對分子質量的外源DNA片段，與經(jīng)同樣的限制性核酸切酶切割過的黏粒載體線性DNA分子驚醒體外連接反應。1.具有噬菌體的體外包裝、高效感染特性。2.具有質粒載體的易于克隆操作。3.具有高容量的克隆能力。4.具有與同源序列的智力進行重組的能力?？梢钥寺⊥庠碊NA分子比較大的。酵母人工染色體由酵母的自主復制序列、著絲粒、四膜蟲的端粒、以及酵母的

13、選擇性標記組成的能自我復制的酵母線性克隆載體。目前克隆最大DNA片段的載體。目前克隆最大DNA片段的載體。細菌人工染色體以細菌F因子為基礎構建的細菌克隆載體。除去了F因子的轉移去及整合區(qū)等非復制必須片段，并引入了多克隆位點及選擇標記BAC克隆容量可以達到300kb.可用于真核生物重要基因及全基因組物理作圖、重要性狀基因的圖位克隆、基因結構及功能分析。Chapter The technical principle of genetic manipulation簡述提取基因組DNA的主要步驟和原理？分離純化質粒的方法有哪幾種？簡述CsCl密度梯度分離法、堿變性法的原理，如何選擇合適的分離方法？簡述

14、提取RNA常用的兩種方法和相關原理？列舉三種常用的核酸檢測方法和基本原理？簡述瓊脂糖-EB電泳法分離純化DNA的基本原理？名詞解釋：分子雜交、核酸雜交探針切口平移標記探針的主要步驟有哪些？簡述Southern印跡雜交的基本原理及其主要步驟？簡述Northern印跡雜交的基本原理及其應用？簡述Western印跡的基本原理及其主要步驟？簡述Sanger堿基順序分析法的基本原理？簡述酵母雙雜交技術的基本原理和在基因工程中的應用？簡述酵母單雜交技術的基本原理和操作過程？什么是噬菌體展示技術？簡述其基本操作過程？什么是DNA遷移率變動試驗？簡述其基本原理？什么是DNase I足跡實驗？簡述其基本原理？C

15、hapter Polymerase Chain Reaction Technology and Application什么是PCR技術？簡述其基本原理？簡述PCR 反應體系的主要成分與反應流程？簡述PCR引物設計的目的和一般原則？簡述提高PCR反應特異性的因素和措施？什么是巢式PCR、降落PCR、反轉錄PCR？它們分別有哪些應用？簡述熒光定量PCR的基本原理？為什么在定量PCR中要引入Ct值的概念？Chapter RNAi and miRNA regulation什么是RNA干擾技術？簡述利用RNA干擾技術沉默基因的基本原理和一般操作流程？什么是siRNA？如何選擇siRNA靶位點？簡述獲得s

16、iRNA的途徑有哪些？Chapter Obtaining of target gene目的基因克隆時常用哪些方法分離和獲得基因？什么是基因文庫？簡述構建基因文庫常用的載體有哪些？什么是基因組文庫？簡述構建基因組文庫的一般步驟？什么是cDNA文庫？簡述構建cDNA文庫的主要步驟？目的基因與載體的連接方法有哪些？各有哪些優(yōu)點？基因重組時在兩個酶切位點中其中有一個不相匹配時，你如何解決連接問題？如果目的基因的基因結構中有含子存在，而且要采用原核表達系統(tǒng)，你應如何分離克隆基因？Chapter Rebination and gene transfer cDNA克隆較之基因組克隆的優(yōu)越性體現(xiàn)在哪里試述T-

17、A克隆法的原理和用途？基因工程宿主菌必需具備哪些特性？名詞解釋：受體細胞、感受態(tài)細胞、轉化、轉染、轉導簡述將重組DNA導入原核細胞的方法有哪些？簡述將重組DNA導入真核細胞導的方法有哪些？外源基因導入植物的方法？Ti 質粒的結構特點？Ti 質粒介導植物基因轉移的過程？Chapter Screening and identification of rebinant clones 如何從所克隆到的基因重組載體中鑒定目的基因的存在和正確性重組子的篩選與鑒定主要有哪些方法？重組子的遺傳學檢測法主要包括哪兩類？簡述根據(jù)載體表型特征進行重組子篩選的常用方法及其基本原理？如何利用抗性標記基因篩選陽性克??？名

18、詞解釋：插入失活效應LacZ 基因通常用于構建質粒載體的目的和原理？如何利用LacZ標記基因篩選陽性克??？報告基因檢測法篩選重組子對報告基因有哪些基本要求舉例說明重用的報告基因有哪幾種？Chapter E*pression of cloning gene大腸桿菌作為基因工程受體菌有哪些優(yōu)缺點？實現(xiàn)真核基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)的正確表達需要哪些基本條件？名詞解釋：啟動子、終止子、SD序列、包涵體蛋白質包含體復性的方法有哪些？可使外源基因在大腸桿菌中高水平表達的啟動子應具備哪些條件？常用大腸桿菌表達載體有哪些？簡述PL啟動子表達載體和T7噬菌體RNA聚合酶/啟動子表達載體的主要特征？原核表達系統(tǒng)常采用的啟動子有哪些？ Lac、Tac、trp啟動子各自有何特點？在大腸桿菌中表達外源基因的表達載體需具備哪些條件？利用大腸桿菌進行外源蛋白質主要有哪幾種表達部位？采用相應表達形式有何優(yōu)缺點？名詞解釋：融合基因、融合蛋白提高外源基因表達效率一般從那幾個方面進行考慮？從提高轉錄啟動效率及翻譯起始效率角度考慮，可通過哪些措施構建高效率表達載體，提高外源基因表達效率？避免外源基因表達蛋白被宿主細胞源蛋白水解酶降解的