免疫組織化學(xué)ppt課件

1、免疫組織化學(xué)報(bào)告人：傅琦博指點(diǎn)教師：胡翊群何謂免疫組化 免疫組織化學(xué)是指在組織細(xì)胞原位經(jīng)過(guò)抗原抗體反響和組織呈色反響，借助可見(jiàn)的標(biāo)志物，對(duì)相應(yīng)的抗原或抗體進(jìn)展定位、定性和定量檢測(cè)的一種免疫檢測(cè)方法。免疫組化的全過(guò)程抗原的提取與純化免疫動(dòng)物或細(xì)胞交融，制備特異性抗體及純化標(biāo)志物與抗體集合構(gòu)成標(biāo)志抗體標(biāo)本的處置抗原抗體反響和呈色反響顯微鏡下察看結(jié)果組織抗原抗體標(biāo)志物 標(biāo)志抗體1 熒光2 酶3 親和技術(shù)4 金標(biāo)組織抗原 免疫細(xì)胞化學(xué)反響原理：標(biāo)志抗體標(biāo)志的抗原抗體復(fù)合物間接法 直接法 兩種免疫細(xì)胞化學(xué)反響方法標(biāo)本的處置標(biāo)本的主要來(lái)源：活體組織、各種體液、穿刺液、培育細(xì)胞標(biāo)本的固定與保管酶消化處置 組

2、織資料處置是獲得良好免疫細(xì)胞組織化學(xué)分析的保證，必需保證要檢測(cè)的細(xì)胞或組織取材新穎、固定即使及時(shí)、形狀保管良好、抗原物質(zhì)的抗原性不被破壞。標(biāo)本的固定與保管 固定的目的：是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止胞內(nèi)酶活化反響，防止細(xì)胞自溶，堅(jiān)持細(xì)胞固有形狀與構(gòu)造，防止細(xì)胞零落，去除干擾抗原抗體反響的類脂，最主要的是保管組織細(xì)胞的抗原性，在染色和反復(fù)清洗的過(guò)程中使抗原不致釋放。好的固定劑：1能快速固定抗原2防止抗原物質(zhì)分散3固定后的抗原能被抗體識(shí)別，不影響抗原抗體反響標(biāo)本的固定與保管抗原固定劑固定溫度與時(shí)間蛋白質(zhì)95乙醇室溫，315min免疫球蛋白丙酮4，30min酶四氯化磺4 ，30min激素1聚甲醛4 ，45

3、h細(xì)菌丙酮、甲醇室溫，310min病毒丙酮，無(wú)水乙醇室溫，510min四氯化磺4 ，3060min類脂質(zhì)10甲醛室溫，310min細(xì)胞懸液1聚甲醛室溫，2min各種抗原的固定標(biāo)本的固定與保管 冰凍切片和石蠟切片時(shí)免疫組化中最常用的制片方法。 冰凍切片制片方法簡(jiǎn)單，可防止石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟呵斥的抗原損失。迅速冷凍可防止冰晶的構(gòu)成，防止組織細(xì)胞構(gòu)造的破壞。 石蠟切片是察看組織細(xì)胞構(gòu)造的理想方法，可用于陳舊石蠟包埋資料的回想性免疫組化研討，切片薄，有延續(xù)性，蠟塊可長(zhǎng)期保管，但是抗原的保管量不如冰凍切片。酶消化處置 石蠟包埋資料大都用甲醛固定保管，固定過(guò)程中由于醛鍵構(gòu)成致使某些抗原決議簇

4、被封鎖，染色不理想，甚至出現(xiàn)假陰性，因此在進(jìn)展免疫組化反響之前，需求酶消化處置切片，可使抗原決議簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等?？贵w處置與保管抗體是免疫組化技術(shù)的首要試劑，通常選用的高特異性、高效價(jià)的第一抗體為多克隆抗體?？贵w稀釋的原那么是陽(yáng)性抗原物質(zhì)著色應(yīng)鮮明，背景應(yīng)錢或不著色。抗體效價(jià)越高，孵育時(shí)間越長(zhǎng)，方法越敏感抗體稀釋度應(yīng)越高。免疫染色標(biāo)志抗體與標(biāo)本中抗原反響并構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物；用緩沖液沖洗去未結(jié)合的成分；直接在顯微鏡下察看結(jié)果免疫熒光直接法，或待標(biāo)本顯色后再用顯微鏡察看結(jié)果免疫酶直接法免疫染色是免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵步驟。免疫染色 對(duì)一些特殊的標(biāo)本需進(jìn)一步進(jìn)展

5、處置來(lái)添加檢測(cè)的敏感性和特異性，減少非特異性干擾。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，添加細(xì)胞和組織的通透性，以利于抗體與抗原最大限制的結(jié)合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶等。2.非特異吸附法免疫組化技術(shù)中非抗原抗體反響出現(xiàn)的陽(yáng)性染色成為非特異性染色。防止非特異性染色的有效方法是采用與第二抗體一樣的動(dòng)物源血清非免疫血清吸附封鎖底物煮至上的帶電荷物質(zhì)，然后再進(jìn)展抗原抗體結(jié)合反響，必要時(shí)也可采用2%左右的?；蛉税椎鞍追馄瑴p少非特異性染色。免疫組化染色中標(biāo)識(shí)物的選擇用量微小，容易在光鏡或電鏡下識(shí)別機(jī)體內(nèi)無(wú)同一物質(zhì)或類似物質(zhì)物理或化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可與抗原或抗體結(jié)合，其結(jié)合物也穩(wěn)

6、定 目前常用標(biāo)識(shí)物質(zhì)有熒光色素、放射性同位素、重金屬、微粒子、酶等設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn) 為確定結(jié)果的可靠性，在實(shí)驗(yàn)中必需設(shè)置對(duì)照。通常是針對(duì)第一抗體設(shè)立對(duì)照，包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、替代對(duì)照、空白對(duì)照、本身對(duì)照和吸收實(shí)驗(yàn)等。1陽(yáng)性對(duì)照用不斷抗原陽(yáng)性的切片與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)展免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)呈陽(yáng)性結(jié)果，即為陽(yáng)性對(duì)照。2陰性對(duì)照用不含不斷抗原的標(biāo)本作對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，即為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照中還包括空白對(duì)照、替代對(duì)照、吸收和抑制對(duì)照等，用以排除假陽(yáng)性結(jié)果。免疫組化的結(jié)果判別染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)均勻染色或更強(qiáng)顯色定位特定，具有結(jié)構(gòu)性無(wú)特定部位，無(wú)結(jié)構(gòu)性顯色程

7、度同一部位呈不同程度顯色無(wú)分布規(guī)律，某一片均勻著色 免疫組織化學(xué)的結(jié)果判別應(yīng)非常嚴(yán)謹(jǐn)，陽(yáng)性細(xì)胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細(xì)胞核型和細(xì)胞膜外表型。陽(yáng)性細(xì)胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的根據(jù)。 陽(yáng)性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并于陰性細(xì)胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，兩者可由顯著區(qū)別。幾種常用的免疫組化檢測(cè)技術(shù)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)免疫標(biāo)志電鏡技術(shù) 免疫熒光技術(shù)將 熒光素作為標(biāo)志物使組織細(xì)胞中構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見(jiàn)，從而顯示抗原物質(zhì)的定位 免疫熒光技術(shù) .異硫氰酸熒光素 FITC .四乙

8、基羅達(dá)明 .四甲基異硫氰酸羅達(dá)明 .藻紅蛋白 呈現(xiàn)不同的熒光： 綠色熒光 (FITC) 橙色熒光 橙紅色熒光 紅色熒光等 熒光素 作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物 熒 光： 在激發(fā)光熒光顯微鏡提供的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)光并隨照射停頓而消逝 熒光顯微鏡： 熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，如 紫外光、藍(lán)紫光有不同的波長(zhǎng)范圍， 使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出發(fā)射光海馬細(xì)胞 微管蛋白 綠色(胞體、樹(shù)突) 軸突終末蛋白 紅色(突觸) 培育的成纖維細(xì)胞 微管呈綠色 核呈藍(lán)色免疫組織化學(xué)技術(shù)的運(yùn)用 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)主要用于病原體感染的早期診斷，本身抗體檢測(cè)，分析淋巴細(xì)胞外表標(biāo)志物

9、質(zhì)及抗原、抗體的免疫組化定位等；在病原生物學(xué)方面，主要用于菌種的堅(jiān)決和抗原構(gòu)造的分析；在細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)中，用以檢測(cè)拎包細(xì)胞外表的各種CD抗原、免疫球蛋白受體、HLA抗原和各種膜受體等。 酶免疫組織化學(xué)技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定位檢測(cè)。組織切片中的各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細(xì)胞、病毒、腫瘤抗原、姜細(xì)胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細(xì)胞外表標(biāo)志等均可檢測(cè)。 免疫標(biāo)志電鏡技術(shù)由于需求電子顯微鏡，目前仍較多用于科研分析。免疫組化在臨床病理診斷中的運(yùn)用 標(biāo)志淋巴造血組織及其腫瘤的細(xì)胞來(lái)源和細(xì)胞分化程度; 協(xié)助腫瘤良惡性的診斷;鑒別低分化癌和肉瘤;鑒別轉(zhuǎn)移癌的性質(zhì); 協(xié)助發(fā)現(xiàn)骨髓、淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移癌灶; 鑒別小細(xì)胞惡性腫