生物分離技術(shù)生化重點(diǎn)

1、發(fā)酵液特點(diǎn)：含水多、產(chǎn)物含量低、粘度大、成分復(fù)雜預(yù)處理包括：發(fā)酵液雜質(zhì)去除改善培養(yǎng)液處理能力雜質(zhì)中對提取影響最大的是高價無機(jī)離子和雜蛋白預(yù)處理高價無機(jī)離子的去除Ca2+ 草酸Mg2+ 三聚磷酸鈉Fe3+ 黃血鹽 （普魯士藍(lán)）蛋白質(zhì)去除加熱調(diào)(無機(jī)酸或堿)蛋白沉淀劑絮凝：某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的作用凝聚：在中性鹽的作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定現(xiàn)象常用絮凝劑：化學(xué)結(jié)構(gòu)上分為三類高聚物、無機(jī)鹽、有機(jī)化合物和表面活性劑人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀亞胺的衍生物無機(jī)高分子聚合物：聚合鋁鹽、聚合鐵鹽天然有機(jī)高分子絮凝劑：殼聚糖、

2、葡聚糖、明膠、骨膠微生物絮凝劑：糖蛋白，粘多糖，素，核酸影響絮凝劑的絮凝劑的加量 絮凝劑的分子量溶液的攪拌速度攪拌時間絮凝劑應(yīng)用優(yōu)化用量控制控制.固體濃度與粒子尺寸分布。電解質(zhì)含量。后續(xù)工藝要求混凝先加入無機(jī)電解質(zhì)，使懸浮粒子間的相互排斥能降低，脫穩(wěn)而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝劑。無機(jī)電解質(zhì)的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而，提高了絮凝效果。這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，常稱為混凝錯流過濾：在泵的推動下料液平行于過濾面，與死端過濾不同的是料液流經(jīng)膜面時產(chǎn)生的剪切力把膜面上滯留的顆粒帶走，從而使污染層保持在一個較薄的水平。特點(diǎn) a 介質(zhì)阻力不得到干濾餅 c 需要大的膜面積 d

3、 收率高 e 質(zhì)量好 f 減少處理步驟在過濾操作中，為了降低過濾阻力，增加過濾速率或得到更澄清的濾液所加入的輔助性的粉粒狀物質(zhì)，稱為助濾劑膨脹床技術(shù)：兼有固定床和流化床的優(yōu)點(diǎn)。流化的固相介質(zhì)基本可以懸浮在床內(nèi)的固定位置，流體態(tài)流經(jīng)床層集料液澄清，目標(biāo)產(chǎn)物濃縮和分離純化為一體的生物集成分離技術(shù)狀泡載分離技術(shù)：泡載分離是通過鼓泡使細(xì)胞或溶質(zhì)在氣 液界面，借助浮力上升至溶液主體上方形成富集層，以達(dá)到分離，濃縮溶質(zhì)和凈化液相主體的目的，特別適于低濃度產(chǎn)物的富集。泡載、氣浮分離有 2 種形式1. 形成較大氣泡，目標(biāo)物質(zhì)附著在氣泡上上浮2. 先向料液中加入絮凝劑產(chǎn)生絮凝，然后從底部通碰到絮凝體并吸附其上，

4、使其上浮到液體表面氣浮法的關(guān)鍵在于微氣泡的產(chǎn)生體分配頭放出大量微細(xì)氣泡，這些小氣泡在上浮過反膠束：如果在非極性的中，表面活性劑的濃度達(dá)到一定程度，表面活性劑也會在一起成聚集體，稱為反膠束，是透明的、熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。表面活性劑是反膠束溶液形成的關(guān)鍵超臨界流體 SCF 或 SC：是指高過物質(zhì)本身的臨界溫度和臨界壓力狀態(tài)時的流體。超臨界流體既有液體對溶質(zhì)有較大溶解度的特點(diǎn)，又具有氣體易于擴(kuò)散和運(yùn)動，傳質(zhì)速率快的特點(diǎn)。超臨界萃取的特點(diǎn)萃取時間短:由于超臨界流體強(qiáng)萃取徹底力和高溶解度,它能快速地將提取物從載體中萃出。(3)溶劑回收簡單無殘留，無三廢產(chǎn)生。 (4)條件溫和:在較低溫度下萃取。萃取劑的溶解

5、能力易于通過調(diào)節(jié)溫度和壓力控制。節(jié)省能源，無需大量的蒸餾濃縮等操作固相微萃取(SPME)是二十世紀(jì)九十年代初提出并發(fā)展起來的快速、靈敏、方便、無溶劑、易于實(shí)現(xiàn)自動化并適用于氣體、液體和固體樣品分析的新穎技術(shù)主要由兩部分組成:一是由 1 cm 長的融熔石英和涂在其表面的色譜固定液或吸附劑的萃取頭。二是控制桿。測定時旋轉(zhuǎn)控制桿 ，推出萃取頭，浸于樣品中或置于樣品上空進(jìn)行萃取，待吸附達(dá)到平衡后，將萃取頭收納于鞘內(nèi)，進(jìn)入氣相色譜儀汽化室 ，再推出萃取頭，熱解吸后靠分離、濃縮、測定相將其導(dǎo)入，完成提取、固相萃取的一般操作程序如下1）活化吸附劑2）上樣3） 脫附SPME 有三種基本的萃取模式：直接萃取:涂

6、有萃取固定相的石英定相中被直接到樣品基質(zhì)中，目標(biāo)組分直接從樣品基質(zhì)中轉(zhuǎn)移到萃取固頂空萃取:、被分析組分從液相中先擴(kuò)散到氣相中；、被分析組分從氣相轉(zhuǎn)移到萃取固定相中膜保護(hù)萃取:是通過一個選擇性的膜將樣品與萃取頭，膜允許分析物通過而阻塞干擾物。可實(shí)現(xiàn)樣品的粗分離，增加選擇性，還可保護(hù)萃取頭，防止被基質(zhì)污染優(yōu)點(diǎn)：在無溶劑條件下可一步完成取樣、萃取和濃縮 ,與氣相色譜、高效液相色譜等儀器聯(lián)用 ;可以快速有效的分析樣品中痕量有機(jī)物;重現(xiàn)性好、操作簡便、易于實(shí)現(xiàn)自動化;檢出限達(dá)g/L ；克服了傳統(tǒng)的液液萃取、索氏萃取等具有大量使用物的分析等缺點(diǎn)和樣品處理時間長、難用于揮發(fā)性有機(jī)氣相色譜原理 氣相色譜法系采

7、用氣體為相（載氣）流經(jīng)裝有固定相的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測器，并形成色譜信號。特點(diǎn) 氣相色譜采用氣體作為相，由于物質(zhì)在氣相中的擴(kuò)散速比在液相中快得多，氣體又比液體的滲透性強(qiáng)，因而相比液相色譜，氣相色譜柱阻力小，傳質(zhì)速度快，可以迅速達(dá)到分配平衡，分離效率高。高效液相色譜法（HPLC）采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點(diǎn)HPLC 的組成高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱：可以分為填充柱和4.檢測器，但通常較氣相色譜柱短，在柱前還可備一個前置柱氣相色譜與 HPLC 的比較1. 氣相

8、色譜采用相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中相可選用不同極性的液體，并參與組分的分離。氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則通常在室溫條件下工作。分析對象的區(qū)別柱長，柱形的區(qū)別HPLC 與液相色譜比較固定相但體和粒度的區(qū)別操作壓力的區(qū)別色譜柱長，柱內(nèi)徑，柱效的區(qū)別樣品用量、分析時間的區(qū)別正相色譜：采用極性固定相，非極性相的層析方法，根據(jù)樣品分子的極性大小而與固定相發(fā)生不同的吸附作用從而實(shí)現(xiàn)分離。反相色譜：與正相色譜相反，采用極性較小的固定相和極性的相。凝膠色譜（排阻色譜）凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大

9、小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱凝膠層析原理：l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3 大小分子分開： 4 大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中凝膠層析的特點(diǎn)凝膠層析操作簡便，所需設(shè)備簡單分離效果較好，重復(fù)性高。樣品回收率高，接近 100分離條件緩和應(yīng)用廣泛分辨率不高，分離操作較慢分子印跡聚合物的特點(diǎn)1. 預(yù)定性：人們可以根據(jù)不同的目的不同的MIP2. 實(shí)用性：它與天然的識別系統(tǒng)如酶和底物,抗體和抗原相比，具有抗惡劣環(huán)境的能力，表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性和長的使用，且簡單。3. 特異識別性：MIP 是根據(jù)印跡分子定做的，它具有特殊的分

10、子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，能選擇性地識別印跡分子分子蒸餾又叫短程蒸餾，是基于一定溫度和真空度下不同物質(zhì)的分子平均新型液液分離技術(shù)程的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種分子運(yùn)動程一個分子在相鄰兩次分子碰撞之間所經(jīng)過的路程微波加熱的選擇性：體系的極性越大，對微波的吸收越大，極性小溶劑吸收微波能力也較弱，所以加熱效應(yīng)也相對較差，若樣品和溶劑均不吸收微波,則微波加熱過程無法進(jìn)行。電泳：是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。凝膠電泳制膠方法方法：瓊脂糖是從瓊脂中提取的膠狀多糖，常態(tài)下為白色粉末，使用時按一定比例加入緩沖液，加熱熔化成均勻液態(tài)膠體，倒入電泳槽冷凝后即可使用。等速電泳快離子和慢離子間形成一個穩(wěn)定

11、的遷移界面，形成三種離子移動界面，蛋白質(zhì)離子夾在中間，被濃縮成一薄層。分別引入先導(dǎo)離子(具有最大電泳淌度的離子)，樣品和尾隨離子(具有最小電泳淌度的離子)，在電場影響下，各種離子根據(jù)它們的電泳淌度差別重新按序排隊，具有較大淌度的離子則靠近先導(dǎo)離子，具有較小淌度的樣品則落在近尾隨離子一側(cè)，達(dá)到分離等電聚焦電泳等電聚焦就是在電泳介質(zhì)中放入兩性載體電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)形成一個由陽極到陰極逐步增加的梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)移動到其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，就不再遷移，也就是說被聚一個狹窄的區(qū)帶中， 稱為聚焦電泳毛細(xì)管電泳(CE)又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE),是指帶電粒子以毛細(xì)管為分離室

12、，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的液相分離分析技術(shù)包涵體復(fù)性原理由外源在宿主細(xì)胞中表達(dá)的不溶性蛋白聚合體稱為包涵體。1. 使原本緊密的蛋白包涵體分散開成蛋白單體。2. 使分散開的蛋白單體重新正確折疊為具有生物活性的蛋白質(zhì)。通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵重新正常形成。步驟：1.包涵體的提取 2. 洗滌 3. 溶解 4.變性劑 5.去垢劑 6.蛋白提取7.還原劑由于反膠團(tuán)內(nèi)存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子，為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境。因此，反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等