1DNA重組技術(shù)的基本工具(王凱輝)

1、生物選修3現(xiàn)代生物科技專題1目 錄專題1 基因工程專題2 細(xì)胞工程專題3 胚胎工程專題4 生物技術(shù)的安全性和倫理問題專題5 生態(tài)工程2專題1 基因工程3 是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。一、基因工程的概念 由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。4基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基 因DNA分子水平定向地改造生物的遺傳性狀，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物剪切 拼接 導(dǎo)入 表達(dá)基因重組5二、基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程 20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得

2、了重大突破1.DNA是遺傳物質(zhì)的證明2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立3.遺傳密碼的破譯6二、基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程 20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破1.DNA是遺傳物質(zhì)的證明2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立3.遺傳密碼的破譯7技術(shù)發(fā)明使基因工程的實施成為可能1.基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2.工具酶的發(fā)現(xiàn)3.DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4.DNA體外重組的實現(xiàn)5.重組DNA表達(dá)實驗的成功6.第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7.PCR技術(shù)的發(fā)明8問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲

3、棉1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具想一想：需要做哪些關(guān)鍵工作？9基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金桿菌提取抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具10基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：從蘇云金桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出抗蟲基因關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具11準(zhǔn)確切割DNA的工具 “分子手術(shù)刀”DNA片段的連接工具 “分子縫合針”基因轉(zhuǎn)移工具 “分子運(yùn)輸車”基因的大小以納米計算，要對它進(jìn)行剪切、拼

4、接等操作，沒有非常精細(xì)的工具是不行的。進(jìn)行基因操作最少需要以下三種工具：DNA重組技術(shù)的基本工具1213思考：1.在自然界中有一些生物的DNA可能進(jìn)入另一種生物的細(xì)胞中。我們有沒有學(xué)過相關(guān)的實例？2,現(xiàn)今存在的生物為什么沒有在長期的進(jìn)化過程中被外源DNA的入侵而滅絕，仍能保持一種穩(wěn)定狀態(tài)？ 原核生物細(xì)胞中的限制酶會將外源DNA切割掉，使之失效，以保證自身的安全，但是不會切割自身的DNA，這是原核生物在長期進(jìn)化過程中形成的一套防御機(jī)制。143.怎樣才能使外來的DNA失效從而保護(hù)自身？ 限制酶常常伴隨一到兩種修飾酶(甲基化酶)出現(xiàn). 后者的作用是保護(hù)細(xì)胞自身的DNA不被限制酶破壞.修飾酶識別的位點

5、與限制酶識別位點相同,但只甲基化每條鏈中的一個堿基,而不是切開DNA鏈,甲基化的DNA無法被限制酶作用. 注:限制酶與修飾酶在不同的情況下,可能是兩種不同的蛋白質(zhì),也可能是同一蛋白質(zhì)的不同功能部位.15一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”來源：主要從原核生物中分離純化出來。種類：已從近300種微生物中分離出約4000種限制酶。作用：1.能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列2.使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。16磷酸二酯鍵：17具有特異性。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子，作用特點：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序列由

6、4、5或8個核苷酸組成限制酶的識別序列：一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”形成兩種末端粘性末端平末端EcoRI限制酶的切割：SmaI限制酶的切割18 1.大腸桿菌的一種限制酶（EcoR）能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開形成黏性末端。 2.Sma能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切割形成平末端 。19G A A T T C C T T A A G 中軸線C T T A A G A A T T C G C C C G G G G G G C C C C C C G G G G G G C C C 黏性末端平末端大腸桿菌的一種限制酶（EcoR)能識別GAATTC序列，Sma識別CCCG

7、GG序列:20磷酸二酯鍵即脫氧核糖、磷酸之間的連接ATGGCATCTTCGAA21切割DNA分子時產(chǎn)生的兩種不同末端22 限制酶切割DNA后形成的末端黏性末端、平末端是如何形成的？思考：23什么叫黏性末端？ 當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線兩側(cè)切開時，被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。24什么叫平末端？ 當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。25切割位點和之間和之間未端類型平末端黏性末端264、切割后的形式：2種末端注：1.限制酶是一大類酶，不是一種酶。 2.限制酶大多可以

8、專一性識別雙鏈DNA分子上的某種特定核苷酸序列，限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ，重復(fù)排列的。3.如果所識別的序列是奇數(shù)如5個堿基,則中軸線在中間的堿基對上,除了中軸線外,兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ黏性末端平末端271.要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。3.如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？ 會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?2.切下

9、的特定片段上有幾個黏性(平)末端?如果直接用DNA連接酶連接會出現(xiàn)什么情形?兩個黏性(平)末端;會出現(xiàn)自身環(huán)化現(xiàn)象4.如何避免自身環(huán)化現(xiàn)象?分別用不同的限制酶切割兩個部位,這樣就不會出現(xiàn)相同的黏性(平)末端.28思考與探究為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？ 通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。 29DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的核酸

10、片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板二、DNA連接酶“分子縫合針”30二、DNA連接酶“分子縫合針”1、作用：形成磷酸二酯鍵恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。312、類型：EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別二、DNA連接酶“分子縫合針”32DNA聚合酶33將外源基因送入受體細(xì)胞。載體的作用：三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

11、 “分子運(yùn)輸車”34作為載體的必要條件：有切割位點供外源DNA片段(基因)插入。能自我復(fù)制并能帶著插入的目的基因一起復(fù)制有遺傳標(biāo)記基因供重組DNA的鑒定和選擇。載體DNA必需是安全的不會對受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。載體DNA分子大小應(yīng)適合以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。35質(zhì)粒： 裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”質(zhì)粒36質(zhì)粒：能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有

12、切割位點有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別。三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”說明沒有危害，大腸桿菌是非致病菌，且分裂快，也便于從大量復(fù)制個體中分離出來。37質(zhì)粒噬菌體的衍生物動植物病毒等載體的種類：三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”38小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4 DNA連接酶運(yùn)載工具條件結(jié)構(gòu)小而穩(wěn)定能自我復(fù)制具多個限制酶切位點具標(biāo)記基因等質(zhì)粒、噬菌體衍生物、動植物病毒等39隨堂練習(xí)1、關(guān)于限制酶的說法中，正確的是（ ）A、限制酶是一種酶，只識別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是GA之間的氫鍵C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中答案：C402. （多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是 A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種 B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體答案