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1、紫外-可見(jiàn)分子吸收光譜法特征和應(yīng)用第一節(jié) 概述一、分子吸收光譜分析的發(fā)展概況可見(jiàn)-紫外-目視比色-光電比色-分光光度光聲光譜-長(zhǎng)光程吸收光譜-傳感器二、分子吸收光譜的分類和特征紫外-可見(jiàn)電子光譜Ee =1 - 20 eV紅外振動(dòng)光譜遠(yuǎn)紅外轉(zhuǎn)動(dòng)光譜電磁波區(qū)域電磁波可分為高頻、中頻及低頻區(qū)。高頻對(duì)應(yīng)放射線(g射線,C射線),涉及原子核,內(nèi)層電子;而中等頻率指紫外-可見(jiàn)光,近紅外、中紅外和遠(yuǎn)紅外光,涉及外層電子能級(jí)的躍遷,振動(dòng)及轉(zhuǎn)動(dòng)。低頻指電波(微波,無(wú)線電波),涉及轉(zhuǎn)動(dòng),電子自旋,核自旋等。 光的本質(zhì)是電磁輻射,光的基本特性是波粒二象性(wave and corpuscle duality)。 光
2、的波動(dòng)性是指光可以用互相垂直的、以正弦波振蕩的電場(chǎng)和磁場(chǎng)表示。電磁波具有速度、方向、波長(zhǎng)、振幅和偏振面等。光可有自然光、偏振光(線偏振或園偏振)、連續(xù)波、調(diào)制波、脈沖波等。 電磁輻射的特性物質(zhì)具有能量,是誘電體。物質(zhì)與光的作用可看成是光子對(duì)能量的授受,即 hn=E1-E0,該原理廣泛應(yīng)用于光譜解析。電磁輻射與物質(zhì)的作用本質(zhì)是物質(zhì)吸收光能后發(fā)生躍遷。躍遷是指物質(zhì)吸收光能后自身能量的改變。因這種改變是量子化的,故稱為躍遷。不同波長(zhǎng)的光,能量不同,躍遷形式也不同,因此有不同的光譜分析法。 電磁輻射與物質(zhì)的相互作用譜圖的三要素一般進(jìn)行光譜分析時(shí),要同時(shí)注意譜圖的位置(能量)、強(qiáng)度(躍遷幾率)、波寬這三
3、個(gè)要素,才能得出正確的結(jié)論。遠(yuǎn)紫外紫外可見(jiàn)紅外遠(yuǎn)紅外10200nm200380nm380780nm0.7550m50250 m分子外層價(jià)電子躍遷分子外層價(jià)電子躍遷分子外層價(jià)電子躍遷分子中原子的振動(dòng)分子的轉(zhuǎn)動(dòng)遠(yuǎn)紫外吸收紫外吸收可見(jiàn)吸收紅外吸收遠(yuǎn)紅外吸收光譜類型分子運(yùn)動(dòng)形式波 長(zhǎng)光譜區(qū)域分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng) 價(jià)電子運(yùn)動(dòng)、分子內(nèi)原子在平衡附近的振動(dòng)、分子作為整體繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)。分子能級(jí) 電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)分子總能量 E=Ee+Ev+Er當(dāng)分子吸收一定能量的電磁輻射時(shí),分子由較低的能級(jí)E1 躍遷到較高的能級(jí)E2,吸收輻射的能量與分子的這兩個(gè)能級(jí)的能量差相等。 E=E2-E1=h=hc/ 由于三種能級(jí)
4、之間的差值很小,不能區(qū)分開(kāi),得到的分子光譜為帶光譜。由于三種能級(jí)躍遷所需要能量不同,所以需要吸收不同波長(zhǎng)的電磁輻射使產(chǎn)生躍遷,所產(chǎn)生的光譜應(yīng)在不同的光學(xué)區(qū)域。 eeE Ea b cRoRoRoVoV1EoE1E電子能級(jí)V振動(dòng)能級(jí)R轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)分子在吸收過(guò)程中發(fā)生電子能級(jí)躍遷的同時(shí)伴隨振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的能量變化。原子對(duì)電磁輻射的吸收只涉及原子核外電子能量的變化,是一些分離的特征銳線,而分子的吸收光譜是由成千上萬(wàn)條彼此靠得很緊的譜線組成,看起來(lái)是一條連續(xù)的吸收帶。溶液中相鄰分子間的碰撞導(dǎo)致分子各種能級(jí)的細(xì)微變化,也會(huì)引起譜帶的進(jìn)一步加寬和匯合。當(dāng)分子由氣態(tài)變?yōu)槿芤簳r(shí),一般會(huì)失去振動(dòng)精細(xì)結(jié)構(gòu) 分子的電
5、子光譜的特點(diǎn):在波長(zhǎng)范圍內(nèi)按一定強(qiáng)度分布的譜帶帶光譜 波長(zhǎng)位于紫外-可見(jiàn)區(qū)物質(zhì)的紫外吸收光譜決定于分子中價(jià)電子的躍遷,因此分子的組成不同,特別是價(jià)電子性質(zhì)不同,則產(chǎn)生吸收光譜也不用。三、分子吸收光譜的特點(diǎn)可進(jìn)行分子的定性和定量分析可用于一些物理化學(xué)常數(shù)的測(cè)定(如平衡常數(shù)等)儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜應(yīng)用范圍廣泛(無(wú)機(jī)離子、有機(jī)化合物、生物大分子分析等)一、吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)1、有機(jī)化合物的吸收光譜根據(jù)分子軌道理論,分子中的電子軌道有 n、和 三種*n第二節(jié) 紫外-可見(jiàn)分子吸收光譜的理論基礎(chǔ)反鍵軌道非鍵軌道成鍵軌道 *躍遷 能量很大 吸收光譜在真空紫外區(qū) 多為飽和烴甲烷125 nm乙烷135 nmn
6、 * 躍遷 所需能量小于 *躍遷(150-250 nm) 含有未共用電子對(duì)(n電子)原子的飽和化合物都可發(fā)生躍遷的摩爾吸光系數(shù)比較小,一般在100-3000 L / mol cm化合物maxmaxH2O1671480CH3OH184150CH3Cl173200(CH3)2O1842520 * 和 n * 躍遷 * 和 n * 躍遷能量低(200 nm) 含有不飽和鍵的有機(jī)分子易發(fā)生這類躍遷 C=C C=C ; N=N ; C=O 有機(jī)化合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析多以這兩類躍遷為基礎(chǔ) * 比 n * 躍遷幾率大 100-1000 倍 *躍遷吸收強(qiáng), 104 n * 躍遷吸收弱, 500生色團(tuán)
7、含有 鍵不飽和官能團(tuán),能進(jìn)行n * 、 * 含碳碳雙、三鍵,碳氧雙鍵,氮氮雙鍵基團(tuán)。助色團(tuán) 基團(tuán)本身無(wú)色,但能增強(qiáng)生色團(tuán)顏色為含有n電子, n *,且能與電子作用,產(chǎn)生n 共軛。-OH、-NH2、-SH、-SO3H紅移和紫移 因取代基或溶劑的改變,使吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)。向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)為紅移,向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)為紫移。CH4 * 150210nmCH3I n* 259 nmCH2I2 n* 292nmCHI3 n* 349nm影響紫外-可見(jiàn)光譜的因素共軛效應(yīng):電子共軛體系增大,波長(zhǎng)紅移、吸收增強(qiáng);取代基影響:能夠引起電子永久性轉(zhuǎn)移的取代基使波長(zhǎng)紅移(助色團(tuán));溶劑影響:一般情況下分子的
8、激發(fā)態(tài)極性大于基態(tài),因此溶劑極性增大有利于激發(fā)態(tài)穩(wěn)定,能量降低,波長(zhǎng)紅移。max185nm204nm210nm270nm240nm270nm328nmmax取代基的影響:在光的作用下,有機(jī)化合物都有發(fā)生極化的趨向,既能轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)。當(dāng)共軛雙鍵的兩端有容易使電子流動(dòng)的基團(tuán)(給電子基或吸電子基)時(shí),極化現(xiàn)象顯著增加。給電子基為帶有未共用電子對(duì)的原子的基團(tuán)。如-NH2, -OH等。未共用電子對(duì)的流動(dòng)性很大,能夠和共軛體系中的p電子相互作用引起永久性的電荷轉(zhuǎn)移,形成p-p共軛,降低了能量,lmax紅移。吸電子基是指易吸引電子而使電子容易流動(dòng)的基團(tuán)。共軛體系中引入吸電子基團(tuán),也產(chǎn)生p電子的永久性轉(zhuǎn)移,l
9、max紅移。p電子流動(dòng)性增加,吸收光子的吸收分?jǐn)?shù)增加,吸收強(qiáng)度增加。給電子基與吸電子基同時(shí)存在時(shí),產(chǎn)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移吸收,lmax紅移,emax增加。 給電子基的給電子能力順序?yàn)椋?-N(C2H5)2-N(CH3)2-NH2-OH-OCH3-NHCOCH3-OCOCH3-CH2CH2COOH-H 吸電子基的作用強(qiáng)度順序是: -N+(CH3)3-NO2-SO3H-COH-COO-COOH-COOCH3-Cl-Br-I 除了有機(jī)化合物的p p*和n p*躍遷吸收帶以外,當(dāng)外來(lái)輻射照射某些有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物時(shí),可能發(fā)生一個(gè)電子從體系具有電子給予體特性部分(稱為給體,donor)轉(zhuǎn)移到該體系的另一具有電
10、子接受體特性的部分(稱為受體,acceptor),這種電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的吸收譜帶,稱為電荷轉(zhuǎn)移吸收帶。電荷轉(zhuǎn)移吸收帶涉及的是給體的一個(gè)電子向受體的一個(gè)電子軌道上的躍遷,激發(fā)態(tài)是這一內(nèi)氧化還原過(guò)程的產(chǎn)物。電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程可表示如下: 式中D與A分別代表電子給體與受體。下面是能產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移吸收帶的一些化合物。 -NR2是電子給體,苯環(huán)是電子受體。 苯環(huán)是電子給體,氧是電子受體。 電荷轉(zhuǎn)移吸收帶的一個(gè)特點(diǎn)是吸收強(qiáng)度大,emax 104l/mol cm因此含有這類結(jié)構(gòu)的分子測(cè)定靈敏度高,該原理已被廣泛應(yīng)用于分子識(shí)別的主體分子設(shè)計(jì)中。 2、無(wú)機(jī)化合物的吸收光譜某些無(wú)機(jī)金屬離子也會(huì)產(chǎn)生紫外-可見(jiàn)吸收。如含d電子的
11、過(guò)渡金屬離子會(huì)產(chǎn)生配位體場(chǎng)吸收帶。依據(jù)配位場(chǎng)理論,無(wú)配位場(chǎng)存在時(shí), 能量簡(jiǎn)并;當(dāng)過(guò)渡金屬離子處于配位體形成的負(fù)電場(chǎng)中時(shí),5個(gè)簡(jiǎn)并的d軌道會(huì)分裂成能量不同的軌道。不同配位體場(chǎng),如八面體場(chǎng)、四面體場(chǎng)、正方平面配位場(chǎng)等使能級(jí)分裂不等。 d-d 電子躍遷絕大多數(shù)過(guò)渡金屬離子都具有未充滿的 d 軌道,按照晶體場(chǎng)理論,當(dāng)它們?cè)谌芤褐信c水或其它配體生成配合物時(shí),受配體配位場(chǎng)的影響,原來(lái)能量相同的 d軌道發(fā)生能級(jí)分裂,產(chǎn)生 d-d 電子躍遷。配體配位場(chǎng)越強(qiáng),d 軌道分裂能越大,吸收波長(zhǎng)越短。(f - f 躍遷與此類似)沒(méi)有配位場(chǎng)八面體配位場(chǎng)dxy dxx dyzdx2 dx2-y2E一般配位體場(chǎng)吸收帶在可見(jiàn)區(qū)
12、,emax約0.1-100 l/mol cm,吸收很弱。因此配位體場(chǎng)吸收帶對(duì)定量分析用處不大。鑭系及錒系離子5f電子躍遷產(chǎn)生的f電子躍遷吸收譜帶出現(xiàn)在紫外-可見(jiàn)區(qū)。由于f軌道為外層軌道所屏蔽,受溶劑性質(zhì)或配位體的影響很小,故譜帶窄。 少數(shù)無(wú)機(jī)陰離子,如NO3-(lmax=313 nm)、CO32-(lmax =217 nm)、NO2-(lmax =360 、280 nm)、N3-(lmax =230 nm)、CS32-(lmax =500 nm)等也有紫外-可見(jiàn)吸收。 例如:H2O 配位場(chǎng) NH3 配位場(chǎng)Cu 2+ 水合離子 794 nm淺藍(lán)色Cu 2+ 氨合離子663 nm深藍(lán)色小結(jié):分子結(jié)
13、構(gòu)光譜特征定性分析不同結(jié)構(gòu)的分子由于共軛程度不同,分子吸收的特征不同;相同共軛結(jié)構(gòu)的分子骨架,因助色團(tuán)的加入或改變,導(dǎo)致光譜位移和吸收系數(shù)變化;相同配體,因過(guò)渡金屬離子不同,導(dǎo)致配位場(chǎng)的變化或電荷轉(zhuǎn)移躍遷,或配體共軛結(jié)構(gòu)的變化,光譜發(fā)生變化IoIbSdx二、吸收定律(定量分析的基礎(chǔ))IxdIxdIxIx吸收光強(qiáng)入射光強(qiáng)吸收率任一截面的吸收率A = b c吸收定律二、吸收定律的適用性與限制1、吸收定律具有加和性,即特別是存在非吸收線(或吸收很小,雜散光)和濃度較大時(shí),I變得 很小。I i= 常數(shù)吸收定律或比爾定律,其成立條件是待測(cè)物為均一的稀溶液、氣體等,無(wú)溶質(zhì)、溶劑及懸濁物引起的散射;入射光為
14、單色平行光。比爾定律在有化學(xué)因素影響時(shí)不成立。解離、締合、生成絡(luò)合物或溶劑化等會(huì)對(duì)比爾定律產(chǎn)生偏離。比爾定律在有儀器因素影響時(shí)也不成立。非單色光對(duì)比爾定律產(chǎn)生偏離。雜散光(非吸收光)也會(huì)對(duì)比爾定律產(chǎn)生影響。 其他影響因素包括溶劑、光效應(yīng)等也應(yīng)考慮。 三、紫外-可見(jiàn)吸收光譜的靈敏度 = 0.4343 N aiai = 1x10-15 cm2吸光分子的截面積 N = 6.02x 1023因?yàn)?為摩爾吸光系數(shù) ai 的單位是 cm2 (cm3 是 ml,變成L除1000)所以 = 0.4343 N ai = 0.4343 x 6.02x 1023 x 1x10-15/ 1000 = 105若1%吸收
15、b = 1C=b 100000= 4.4 x 10-8 (M)此即為方法的理論靈敏度第三節(jié)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)一、基本結(jié)構(gòu)光源單色器狹縫樣品室檢測(cè)器、光源氫燈、氘燈、鎢燈常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源。利用固體燈絲材料高溫放熱產(chǎn)生的輻射作為光源的是熱輻射光源。如鎢燈、鹵鎢燈。兩者均在可見(jiàn)區(qū)使用,鹵鎢燈的使用壽命及發(fā)光效率高于鎢燈。氣體放電光源是指在低壓直流電條件下,氫或氘氣放電所產(chǎn)生的連續(xù)輻射。一般為氫燈或氘燈,在紫外區(qū)使用。這種光源雖然能提供至160nm的輻射,但石英窗口材料使短波輻射的透過(guò)受到限制(石英200nm,熔融石英185nm),而大于360nm時(shí),氫的發(fā)射譜線疊加于連續(xù)光譜之
16、上,不宜使用。2、單色器單色器的作用是使光源發(fā)出的光變成所需要的單色光。通常由入射狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、物鏡和出射狹縫構(gòu)成。入射狹縫用于限制雜散光進(jìn)入單色器,準(zhǔn)直鏡將入射光束變?yōu)槠叫泄馐筮M(jìn)入色散元件。后者將復(fù)合光分解成單色光,然后通過(guò)物鏡將出自色散元件的平行光聚焦于出口狹縫。出射狹縫用于限制通帶寬度。棱鏡和光柵分光原理與原子吸收類似。3、檢測(cè)器簡(jiǎn)易分光光度計(jì)上使用光電池或光電管作為檢測(cè)器。目前最常見(jiàn)的檢測(cè)器是光電倍增管其特點(diǎn)是在紫外-可見(jiàn)區(qū)的靈敏度高,響應(yīng)快。但強(qiáng)光照射會(huì)引起不可逆損害,因此高能量檢測(cè)不宜,需避光。一般單色器都有出口狹縫。經(jīng)光柵分光后的光是一組以角度分布的l1,l2等的光線
17、通過(guò)旋轉(zhuǎn)光柵角度使某一波長(zhǎng)的光經(jīng)物鏡聚焦到出口狹縫。二極管陣列檢測(cè)器不使用出口狹縫,在其位置上放一系列二極管的線形陣列,則分光后不同波長(zhǎng)的單色光同時(shí)被檢測(cè)。二極管陣列檢測(cè)器的特點(diǎn)是響應(yīng)速度快。但靈敏度不如光電倍增管,因后者具有很高的放大倍數(shù)。 4、樣品室1 cm5 cm石英 玻璃二、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),按其光學(xué)系統(tǒng)可分為單波長(zhǎng)與雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)單光束與雙光束分光光度計(jì) 1、單光束儀器S1HW紅藍(lán)S2單光束儀器中,分光后的單色光直接透過(guò)吸收池,交互測(cè)定待測(cè)池和參比池。單光束儀器的缺點(diǎn): 操作麻煩:空白IO樣品I任一波長(zhǎng) 不能進(jìn)行吸收光譜的自動(dòng)掃描光源不穩(wěn)定性影響測(cè)量精密度2
18、、雙光束儀器IOI雙光束儀器中,從光源發(fā)出的光經(jīng)分光后再經(jīng)扇形旋轉(zhuǎn)鏡分成兩束,交替通過(guò)參比池和樣品池。雙光束儀器的特點(diǎn)和不足: 測(cè)量方便,不需要更換吸收池 補(bǔ)償了儀器不穩(wěn)定性的影響 實(shí)現(xiàn)了快速自動(dòng)吸收光譜掃描 不能消除試液的背景成分吸收干擾單光束儀器中,分光后的單色光直接透過(guò)吸收池,交互測(cè)定待測(cè)池和參比池。儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,適用于測(cè)定特定波長(zhǎng)的吸收,進(jìn)行定量。而雙光束儀器中,從光源發(fā)出的光經(jīng)分光后再經(jīng)扇形旋轉(zhuǎn)鏡分成兩束,交替通過(guò)參比池和樣品池,測(cè)得的是透過(guò)樣品溶液和參比溶液的光信號(hào)強(qiáng)度之比。雙光束儀器克服了單光束儀器由于光源不穩(wěn)引起的誤差,并且可以方便地對(duì)全波段進(jìn)行掃描。 3、雙波長(zhǎng)儀器切光器12
19、儀器既可用作雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)又可用作雙光束儀器當(dāng)用作單波長(zhǎng)雙光束儀器時(shí),單色器出射的單色光束為遮光板所阻擋,單色器1出射的單色光束被斬光器分為兩束斷續(xù)的光,交替通過(guò)參比池和樣品池,最后由光電倍增管檢測(cè)信號(hào)。當(dāng)用作雙波長(zhǎng)儀器時(shí),由兩個(gè)單色器分出的不同波長(zhǎng)1和2的兩束光,由斬光器并束,使其在同一光路交替通過(guò)吸收池,由光電倍增管檢測(cè)信號(hào)。雙波長(zhǎng)儀器的主要特點(diǎn)是可以降低雜散光,光譜精度高。 單光束和雙光束分光光度計(jì),就測(cè)量波長(zhǎng)而言,都是單波長(zhǎng)的。由一個(gè)單色器分光后,讓相同波長(zhǎng)的光束分別通過(guò)試樣池和測(cè)量池,測(cè)得試樣池和測(cè)量池吸光度之差。雙波長(zhǎng)由同一光源發(fā)出的光被分成兩束,分別經(jīng)過(guò)兩個(gè)單色器,同時(shí)得到兩個(gè)
20、不同波長(zhǎng)(1和2)的單色光。由斬光器并束,使其在同一光路交替通過(guò)吸收池,由光電倍增管檢測(cè)信號(hào)。雙波長(zhǎng)儀器的主要特點(diǎn)是可以降低雜散光,光譜精度高。不僅能夠測(cè)量高濃度試樣,多組分混合試樣,還能測(cè)定混濁試樣。消除光譜重疊干擾A1 = Aa 1 + Ai 1 A2 = Aa 2 + Ai 2 Ai 1 = Ai 2 A = Aa 2 - Aa 1 =(a1 -a2)bCa消除了共存組分的干擾雙波長(zhǎng)儀器能否消除背景干擾?A1 = lg I0/ I1 = 1bC + AbA2 = lg I0/ I2 = 2bC + Ab式中 Ab 為背景吸收或干擾物質(zhì)的吸收若波長(zhǎng)選擇合適, 1和 2處 Ab相同A1 =
21、11C1 + 12C2 + 13C3 A2 = 21C1 + 22C2 + 23C3A3 = 31C1 + 32C2 + 33C3ij為在波長(zhǎng)i測(cè)定組分j的摩爾吸光系數(shù)Ai 為在波長(zhǎng)i測(cè)得該體系的總吸光度解上聯(lián)立方程可求出待測(cè)物濃度C1、C2、C3分光光度計(jì)的校正 波長(zhǎng)校正 可采用輻射光源法校正。常用氫燈(486.13, 656.28 nm)、氘燈(486.00, 656.10 nm)或石英低壓汞燈(253.65, 435.88, 546.07 nm)校正。鐠釹玻璃在可見(jiàn)區(qū)有特征吸收峰,也可用來(lái)校正。 苯蒸汽在紫外區(qū)的特征吸收峰可用于校正。在吸收池內(nèi)滴一滴液體苯,蓋上吸收池蓋,待苯揮發(fā)后繪制苯
22、蒸汽的吸收光譜。 吸光度校正以重鉻酸鉀水溶液的吸收曲線為標(biāo)準(zhǔn)值校正。將克重鉻酸鉀溶于1 升的氫氧化鉀中,以1cm 吸收池,25C測(cè)定吸收光譜。 定性分析用于有機(jī)物的鑒定、同分異構(gòu)體的鑒別、物質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。物質(zhì)的紫外吸收光譜基本上是分子中生色團(tuán)、助色團(tuán)的特性,而不是它的整個(gè)分子的特性?;衔锛兌辱b定鑒定未知試樣推斷分子結(jié)構(gòu)第四節(jié)紫外-可見(jiàn)分光光度法的應(yīng)用判斷異構(gòu)體:紫外吸收光譜的重要應(yīng)用在于測(cè)定共軛分子。共軛體系越大,吸收強(qiáng)度越大,波長(zhǎng)紅移。 如: 和 前者有紫外吸收,后者的lmax200nm。同樣,CH3COCH2CH2COCH3的最大吸收波長(zhǎng)要短于CH3CH2CO-COCH2CH3。下面兩個(gè)
23、酮式和烯醇式異構(gòu)體中,烯醇式結(jié)構(gòu)的摩爾吸光系數(shù)要遠(yuǎn)大于酮式,也是由于烯醇式結(jié)構(gòu)中有雙鍵共軛之故。CH2COCH2COOC2H5 CH3C(OH)=CHCOOC2H5酮式(lmax =275 nm, e =100) 烯醇式(lmax =245 nm, e =18,000)判斷共軛狀態(tài):可以判斷共軛生色團(tuán)的所有原子是否共平面等。如二苯乙烯(ph-CH=CH-ph)順式比反式不易共平面,因此反式結(jié)構(gòu)的最大吸收波長(zhǎng)及摩爾吸光系數(shù)要大于順式。順式: lmax =280 nm, e =13,500; 反式: lmax =295 nm, e =27,000判斷共軛狀態(tài):可以判斷共軛生色團(tuán)的所有原子是否共平面
24、等。如二苯乙烯(ph-CH=CH-ph)順式比反式不易共平面,因此反式結(jié)構(gòu)的最大吸收波長(zhǎng)及摩爾吸光系數(shù)要大于順式。 順式: lmax =280 nm, e =13,500; 反式: lmax =295 nm, e =27,000 已知化合物的驗(yàn)證:與標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì),紫外-可見(jiàn)吸收光譜可以作為有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)測(cè)定的一種輔助手段。 有機(jī)合物紫外光譜解析 了解共軛程度、空間效應(yīng)、氫鍵等;可對(duì)飽和與不飽和化合物、異構(gòu)體及構(gòu)象進(jìn)行判別。 紫外可見(jiàn)吸收光譜中有機(jī)物發(fā)色體系信息分析的一般規(guī)律是: 若在200750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)吸收峰,則可能是直鏈烷烴、環(huán)烷烴、飽和脂肪族化合物或僅含一個(gè)雙鍵的烯烴等。 若在27
25、0350nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有低強(qiáng)度吸收峰(10100Lmol-1cm-1),(n躍遷),則可能含有一個(gè)簡(jiǎn)單非共軛且含有n電子的生色團(tuán),如羰基。 若在20300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有中等強(qiáng)度的吸收峰則可能含苯環(huán)。 若在210250nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有強(qiáng)吸收峰,則可能含有2個(gè)共軛雙鍵;若在260300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有強(qiáng)吸收峰,則說(shuō)明該有機(jī)物含有3個(gè)或3個(gè)以上共軛雙鍵。 若該有機(jī)物的吸收峰延伸至可見(jiàn)光區(qū),則該有機(jī)物可能是長(zhǎng)鏈共軛或稠環(huán)化合物。定量分析基本原理:朗伯-比爾定律 A= C L單組分作 AC曲線多組分根據(jù)吸光度具有加和性的特點(diǎn)測(cè)定單組分定量分析 紫外-可見(jiàn)吸收光譜是進(jìn)行定量分析最廣泛使用的、最有效的手段
26、之一。尤其在醫(yī)院的常規(guī)化驗(yàn)中,95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的優(yōu)點(diǎn)是:可用于無(wú)機(jī)及有機(jī)體系。 一般可檢測(cè)10-4-10-5 mol/l的微量組分,通過(guò)某些特殊方法(如膠束增溶)可檢10-6-10-7 mol/l的組分。 準(zhǔn)確度高,一般相對(duì)誤差1-3%,有時(shí)可降至百分之零點(diǎn)幾。 分析條件的選擇溶劑的選擇所選擇的溶劑應(yīng)易于溶解樣品并不與樣品作用,且在測(cè)定波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)吸收小,不易揮發(fā)??捎糜跍y(cè)定的最短波長(zhǎng)(nm) 常見(jiàn)溶劑200蒸餾水,乙腈,環(huán)己烷 220甲醇,乙醇,異丙醇,醚 250二氧六環(huán),氯仿,醋酸 270N,N-二甲基甲酰胺(DMF),乙酸乙酯,四氯化碳 (275) 290苯,甲苯,
27、二甲苯 335丙酮,甲乙酮,吡啶,二硫化碳(380) 下表為某些常見(jiàn)溶劑可用于測(cè)定的最短波長(zhǎng)測(cè)定濃度的選擇溶液吸光度值在范圍內(nèi)誤差小時(shí)誤差最小),因此可根據(jù)樣品的摩爾吸光系數(shù)確定最佳濃度。即吸光度時(shí),吸光度測(cè)量誤差最小。將吸光度值控制在之間,光度測(cè)量誤差較小。 三、測(cè)量誤差只有當(dāng)則測(cè)量誤差最小,此時(shí)- logT = log e = 0.434 = A即吸光度為時(shí),濃度測(cè)量才具有最小相對(duì)誤差。一、絡(luò)和物組成的測(cè)定摩爾比法等摩爾系列法斜率比法平衡移動(dòng)法應(yīng) 用摩爾比率法測(cè)定絡(luò)和比:mM+nR MmRn配制:不同CR/CM的系列溶液:如CR/CM=1,2,3,n分別測(cè)吸光度:A1, A2 ,A3An,
28、 作A CR/CM曲線摩爾比法設(shè)有絡(luò)合反應(yīng)mM + nY = MmYn,固定一個(gè)組分(如M)的濃度不變,改變另一組分(如Y)的濃度,求得一系列Y/M比,在絡(luò)合物MmYn的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度的變化。則開(kāi)始時(shí),隨Y/M的增加,溶液吸光度線性增加,到達(dá)絡(luò)合物的組成比后,繼續(xù)增加Y/M,會(huì)有三種不同情況: 吸光度達(dá)到飽和,不再增加。說(shuō)明試劑Y無(wú)吸收,吸光度的增加只是絡(luò)合物的單獨(dú)貢獻(xiàn)。如Fe(III)-鈦鐵試劑絡(luò)合物。 吸光度出現(xiàn)一轉(zhuǎn)折點(diǎn)后繼續(xù)增加。說(shuō)明試劑Y在絡(luò)合物的lmax處稍有吸收。如Zn-PAN絡(luò)合物。PAN:1-(2-吡啶基偶氮)-2-萘酚。 吸光度出現(xiàn)一轉(zhuǎn)折點(diǎn)后呈直線下降。說(shuō)明分步生成
29、了摩爾吸光系數(shù)小于絡(luò)合物e的高次絡(luò)合物。如Bi-二甲酚橙絡(luò)合物。圖代表了第一種情況。曲線轉(zhuǎn)折點(diǎn)對(duì)應(yīng)的摩爾濃度比Y/M = n:m,即為該絡(luò)合物的組成比。摩爾比法測(cè)定絡(luò)合物的組成比。 若絡(luò)合物穩(wěn)定性差,絡(luò)合物解離使吸光度下降,轉(zhuǎn)折不明顯,據(jù)此可以測(cè)定絡(luò)合物不穩(wěn)定常數(shù)。設(shè):絡(luò)合物解離度為 ,不解離時(shí)轉(zhuǎn)折處濃度為 CCMmRn = (1- )CCM = m CCR = n C則絡(luò)合物不穩(wěn)定常數(shù)為 = A0 - AA0K = CMmCRn (m C)m(n C)n mmnn m+n Cm+n-1CMmCRn(1- )C1- =二、酸堿離解常數(shù)的測(cè)定HBH+B-Ka =H+B-HB(1)pKa=pH+l
30、gHBB-設(shè):b=1cmA=A HB +AB-A=HB(c- B-) +B-B- = HBc+B- (B- HB)同樣由(2)得: A=HBHB+ B-(c-HB)= B-c+HB (HB- B-)B-=HBA -HB cB-則:A=A HB +AB-=HBHB+ B-B- (2)HB=B-c-AB- HB(3)(4)將(3)(4)代入(1)中:Ka =H+B-HBC=HB+B-Ka=H+(A -HB c)B-c-AA HB=HB cAB-=B-c定義:A -AHBKa=H+AB-ApKa=pH+lgA -AHBAB-A第五節(jié) 分光光度測(cè)定方法普通分光光度法示差分光光度法雙波長(zhǎng)分光光度法導(dǎo)數(shù)分
31、光光度法一、普通分光光度法以一定的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定待測(cè)物溶液,測(cè)定滴定中溶液的吸光度變化,通過(guò)作圖法求得滴定終點(diǎn),從而計(jì)算待測(cè)組分含量的方法稱為分光光度滴定。一般有直接滴定法和間接滴定法兩種。前者選擇被滴定物、滴定劑或反應(yīng)生成物之一摩爾吸光系數(shù)最大的物質(zhì)的lmax為吸收波長(zhǎng)進(jìn)行滴定。滴定曲線有如下幾種形式。間接滴定法需使用指示劑。光度滴定與通過(guò)指示劑顏色變化用肉眼確定滴定終點(diǎn)的普通滴定法相比,準(zhǔn)確性、精密度及靈敏度都要高。光度滴定已用于酸堿滴定、氧化還原滴定、沉淀滴定和絡(luò)合滴定。 1.分光光度滴定 2.單組分的測(cè)定 通常采用 A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定。3.多組分的同時(shí)測(cè)定 若各組分的吸收曲線互不
32、重疊,則可在各自最大吸收波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。這本質(zhì)上與單組分測(cè)定沒(méi)有區(qū)別。 若各組分的吸收曲線互有重疊,則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。 A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb 普通分光光度法一般只適于測(cè)定微量組分,當(dāng)待測(cè)組分含量較高時(shí),將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。即提高入射光強(qiáng)度,并采用濃度稍低于待測(cè)溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。 設(shè):待測(cè)溶液濃度為cx,標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs cx)。則: Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs )=bc 二、示差分光光度法(示差法) AAx As =b(cx cs )=bc 測(cè)得
33、的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差A(yù) 。 示差法測(cè)得的吸光度與c呈直線關(guān)系。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的c值,則待測(cè)溶液濃度cx : cx = cs + c 普通法: cs的T=10%;cx的T=5% 示差法: cs 做參比,調(diào)T=100% 則: cx的T=50% ;標(biāo)尺擴(kuò)展10倍示差法標(biāo)尺擴(kuò)展原理: 不需空白溶液作參比;但需要兩個(gè)單色器獲得兩束單色光(1和2);以參比波長(zhǎng)1處的吸光度A1作為參比,來(lái)消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時(shí)顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測(cè)量精密度等方面都比單波長(zhǎng)法有所提高。 A A2 A1 (2 1)b c 兩波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度差值A(chǔ)與
34、待測(cè)組分濃度成正比。1和2分別表示待測(cè)組分在1和2處的摩爾吸光系數(shù)。 三、雙波長(zhǎng)分光光度法 測(cè)量波長(zhǎng)2和參比波長(zhǎng)1的選擇與組合 以兩組分x和y的雙波長(zhǎng)法測(cè)定為例:設(shè):x為待測(cè)組分,y為干擾組分,二者的吸光度差分別為: Ax和Ay,則該體系的總吸光度差A(yù)x+y為: Ax+y = A x + A y 如何選擇波長(zhǎng)1 、2有一定的要求。關(guān)鍵問(wèn)題: 選定的波長(zhǎng)1和2處干擾組分應(yīng)具有相同吸光度,即: Ay = A y2 A y1 = 0故: Ax+y = A x=(x2x1)bcx此時(shí):測(cè)得的吸光度差A(yù)只與待測(cè)組分x的濃度呈線性關(guān)系,而與干擾組分y無(wú)關(guān)。若x為干擾組分,則也可用同樣的方法測(cè)定y組分。 可
35、采用作圖法選擇符合上述兩個(gè)條件的波長(zhǎng)組合。 在選定的兩個(gè)波長(zhǎng)1和2處待測(cè)組分的吸光度應(yīng)具有足夠大的差值。選擇波長(zhǎng)組合1 、2的基本要求是:可用于懸濁液和懸浮液的測(cè)定,消除背景吸收 因懸濁液的參比溶液不易配制,使用雙波長(zhǎng)分光光度法時(shí),可固定1為不受待測(cè)組分含量影響的等吸收點(diǎn)(于樣品中依次加入待測(cè)組分,記錄吸收光譜,得到的吸光度重疊的點(diǎn)為等吸收點(diǎn),測(cè)定2處的吸光度變化,可以抵消混濁的干擾,提高測(cè)定精度(因?yàn)槭褂猛晃粘?。等吸收點(diǎn)波長(zhǎng) 等吸收點(diǎn)等吸收點(diǎn)無(wú)須分離,可用于吸收峰相互重疊的混合組分的同時(shí)測(cè)定。 設(shè)有混合組分x和y,1時(shí),A1=1xbCx+ 1ybCy2時(shí),A2= 2xbCx+ 2ybC
36、y A= A2- A1=( 2x- 1x)bCx +( 2y- 1y)bCy選擇1和l2,使2y= 1y,即 1和 是y等吸收點(diǎn)的波長(zhǎng),則: A= ( 2x- 1x)bCx 從而消除了y的干擾。如果體系中不存在等吸收點(diǎn),可以通過(guò)作圖法選擇干擾組分的等吸光點(diǎn),也可以消除干擾。如:,三氯苯酚存在下苯酚的測(cè)定, 1(nm) 為等吸收點(diǎn),測(cè)定(nm) 苯酚吸收 導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時(shí)測(cè)定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等方面,顯示了很大的優(yōu)越性。 利用吸光度(或透光度)對(duì)波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)曲線來(lái)進(jìn)行分析: 0 e-bc假定入射光強(qiáng)度0 在整個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)保持恒定: dI 0
37、 /d0則:dI/d0 bc e -bc d/d 0 bc d/d 四、導(dǎo)數(shù)分光光度法 dI/d 0 bc d/d 一階導(dǎo)數(shù)信號(hào)與試樣濃度呈線性關(guān)系; 測(cè)定靈敏度依賴于摩爾吸光系數(shù)對(duì)波長(zhǎng)的變化率d/d。吸收曲線的拐點(diǎn)處d/d最大,故其靈敏度最高(見(jiàn)圖)。 同理可以導(dǎo)出其二階和三階導(dǎo)數(shù)光譜(略) 隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加,譜帶變得尖銳,分辨率提高,但原吸收光譜的基本特點(diǎn)逐漸消失。導(dǎo)數(shù)光譜的特點(diǎn)在于靈敏度高,可減小光譜干擾。因而在分辨多組分混合物的譜帶重疊、增強(qiáng)次要光譜(如肩峰)的清晰度以及消除混濁樣品散射的影響時(shí)有利。 動(dòng)力學(xué)分光光度法是利用反應(yīng)速度參數(shù)測(cè)定待測(cè)物型體原始濃度的方法。設(shè)有一反應(yīng)速度較慢
38、的顯色反應(yīng),因催化劑H的存在而加速, 五、動(dòng)力學(xué)分光光度法若F為在紫外-可見(jiàn)區(qū)有吸收的化合物,則F的生成反應(yīng)速度可表示為: CH為常數(shù),積分得: 上式為動(dòng)力學(xué)分光光度法的基本關(guān)系式 準(zhǔn)零級(jí)法或初始速度法是指只在占完成反應(yīng)總時(shí)間的-的起始期間內(nèi)測(cè)量速度數(shù)據(jù),此時(shí)反應(yīng)物D, E消耗不大,近似等于起始濃度D0, E0,為常數(shù)。同時(shí)形成產(chǎn)物的量可以忽略不計(jì)。若逆反應(yīng)可以不考慮,催化劑H的量也可視為不變。則上式可變?yōu)椋?測(cè)定CH的方法有 固定時(shí)間法 在催化反應(yīng)進(jìn)行一固定時(shí)間(t=常數(shù))后,用快速冷卻、改變酸度、加入催化劑活性抑制劑等方法終止反應(yīng),測(cè)定體系吸光度。t為常數(shù)時(shí),A=k1CH。選擇一系列CH的
39、標(biāo)準(zhǔn)溶液,并測(cè)定固定時(shí)間t時(shí)的吸光度A,繪制A- CH工作曲線,由待測(cè)樣在t時(shí)的吸光度值求得CH。 固定濃度法 測(cè)量顯色產(chǎn)物F達(dá)到一定濃度(一定吸光度值)時(shí)所需的時(shí)間。CF為常數(shù)時(shí),CH=K/t。配制一系列不同濃度CH的標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定達(dá)到一定吸光度A時(shí)的時(shí)間t,繪制CH-1/t工作曲線,由待測(cè)樣經(jīng)反應(yīng)達(dá)到A時(shí)所需要的時(shí)間t求得CH。 斜率法 由吸光度A隨反應(yīng)時(shí)間的變化速率DA/Dt來(lái)測(cè)定CH。因?yàn)镈A/Dt=kCH,配制標(biāo)準(zhǔn)溶液具有不同的CH,分別測(cè)定A-t曲線,求得曲線斜率DA/Dt,再繪制DA/Dt-CH工作曲線。對(duì)待測(cè)樣亦同樣測(cè)定A-t曲線,求得曲線斜率DA/Dt,從DA/Dt-CH工作曲線上求得CH。斜率法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)多,準(zhǔn)確度高。圖為催化反應(yīng)測(cè)定痕量鎢酸根的示意圖。 動(dòng)力學(xué)分光光度法的特點(diǎn)是靈敏度高(10-6-10-9g/ml,有的可達(dá)10-12g/ml)。但由于影響因素多,不易嚴(yán)格控制,測(cè)定誤差較大。六、光聲光譜法photoacoustic spectroscopy光聲光譜法是1970年以后發(fā)展起來(lái),可用于測(cè)定固體、半固體狀態(tài)的生物組織或渾濁液體樣品的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。而普通的紫外-可見(jiàn)吸收光譜法由于散射及反射的影響
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