第04章糖蛋白與蛋白聚糖課件

1、第四章 糖蛋白與蛋白聚糖4.1. 概述 糖類指多羥基醛和多羥基酮及其縮合產(chǎn)物， carbohydrate曾譯為碳水化合物；saccharide更多地與前綴組詞，如monosacchride(單糖)、oligosaccharide(寡糖)和polysaccharide(多糖)等；sugar除表示食糖外還用于表述糖類的組成，常有單糖的含義；glycan則譯為聚糖，是寡糖和多糖的統(tǒng)稱。，糖類僅僅被視為主要的能源物質(zhì)、碳源和結(jié)構(gòu)材料，對糖類的研究局限于單糖及其代謝，以及淀粉、糖原等少數(shù)多糖。雖然早就發(fā)現(xiàn)糖-肽共價復(fù)合物，鑒于一些含糖的酶類去掉糖組分之后活性并無明顯改變，因而把糖組分當(dāng)作雜質(zhì)，千方百計加

2、以去除。(1)復(fù)合糖的分類： 復(fù)合糖(complex carbohydrate)可分為 聚糖(glycam)和糖綴合物或糖復(fù)合物(glycoconjugate)。其中聚糖包括同聚糖(homoglycan)和雜聚糖(heteoglycan)；糖綴合物則包括糖肽復(fù)合物(glycopeptede complex)、糖脂復(fù)合物(glycolipid complex)和糖-核酸復(fù)合物(carbohydrate-nucleic acid complex)。糖肽復(fù)合物可分為肽聚糖(peptideglycan)或胞壁質(zhì)(murein)，是細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)材料；糖蛋白(glycoprotein)和蛋白聚糖(pro

3、teoglycan)。糖脂可分為糖鞘脂(glycosphingolipid)、糖基?；视?glycosylacylglyceride)和脂多糖(lipopolysaccharide)。(2)糖蛋白和蛋白聚糖中常見的單糖組分： 糖復(fù)合物中常見的單糖組分包括4種己糖：D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)、L-巖藻糖(L-Fuc)；兩種乙酰化己糖胺：N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；兩種糖醛酸：D-葡萄糖醛酸(GlcA)和L-艾杜糖醛酸(IdoA)；一種戊糖：D-木糖(D-Xyl)以及甘露糖胺與磷酸烯醇式丙酮酸縮合產(chǎn)物，它的

4、4、7、9-位羥基和5-氨基發(fā)生取代產(chǎn)生一系列產(chǎn)物，統(tǒng)稱唾液酸(Sia)，其中最重要的是N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸(NeuNAc)等。(3) 聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性： 糖蛋白和蛋白聚糖的聚糖部分盡管由上述為數(shù)有限的幾種單糖組成，但每種單糖有吡喃式與呋喃式結(jié)構(gòu)之分，異頭碳有-與-型之分，每個單糖有多個羥基，可能以不同的方式形成糖苷鍵和分枝結(jié)構(gòu)。兩種不同的氨基酸可形成兩種二肽；3種不同的氨基酸可形成6種三肽；6種不同的氨基酸可產(chǎn)生176種六肽。而兩種相同的己糖可能形成11種二糖；三種相同的己糖可產(chǎn)生176種三糖；6種不同的己糖則能形成109種六糖，如帶有分枝六糖的數(shù)目可達(dá)1012個。如果考慮到糖殘基不同部位

5、進(jìn)一步修飾：磷酸化、硫酸化、氨基化、乙?；⑻腔鶅?nèi)部脫水成內(nèi)醚等，聚糖的 數(shù)目無疑會更大。聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性增加了研究工作的難度，同時暗示它可以蘊含更多的信息，成為生物信息的理想載體。(4) 糖綴合物的許多重要的性質(zhì)和功能與其糖鏈特有的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，為了便于表現(xiàn)糖鏈的結(jié)構(gòu)，我們將采用一套流行的簡化符號系統(tǒng)(圖4.1)，標(biāo)明糖鏈單糖之間的連接方式及其修飾狀況。圖4.1 推薦的描述糖鏈結(jié)構(gòu)的簡化符號與慣例以一個復(fù)雜型分枝的雙天線N-聚糖為例。除L-Fuc和L-IdoA外，其余糖基均為D-型；糖鏈中的單糖都是吡喃型(六元環(huán))的；除Sia的糖苷鏈從C2開始，其余糖基的糖苷鏈均從C1開始。4.2. 糖蛋白

6、(glycoprotein) 廣義的糖蛋白泛指糖肽共價復(fù)合物。為了研究的方便，目前已將肽聚糖和蛋白聚糖劃分出來，狹義的糖蛋白專指肽鏈與一個或多個聚糖鏈共價結(jié)合形成的復(fù)合物，其聚糖鏈通常少于15個單糖殘基（少數(shù)聚糖鏈可能含有20030個單糖殘基），且大多數(shù)具有分枝。4.2.1 糖蛋白的結(jié)構(gòu)4.2.1.1 糖蛋白結(jié)構(gòu)研究 糖蛋白的結(jié)構(gòu)研究包括蛋白質(zhì)部分的結(jié)構(gòu)測定和糖鏈部分的結(jié)構(gòu)測定。糖蛋白糖鏈數(shù)目糖鏈平均間距血清糖蛋白511-酸性糖蛋白460胎球蛋白6113人觸珠蛋白13209人2-巨球蛋白31296牛甲狀腺球蛋白19375人轉(zhuǎn)鐵蛋白2776人IgG2胰糖蛋白：124牛胰RNaseB1270DNa

7、se1粘蛋白：羊領(lǐng)下腺粘蛋白8006豬領(lǐng)下腺粘蛋白5008膠原：兔角膜膠原19173牛皮膚膠原8435大鼠皮膚膠原4770兔鞏膜膠原31000表4-1 糖蛋白中糖鏈數(shù)目與間距的變動 (1)聚糖鏈與蛋白質(zhì)的分離： 從糖蛋白釋放完整的N-聚糖可采用專一的肽：N-糖苷酶F水解，也可用肼解裂解。O-聚糖可用內(nèi)切-N-乙酰氨基半乳糖苷酶水解，或在0.050.1mol L1 NaOH_ molL1 NaBH4通過-消去反應(yīng)來完成。反應(yīng)中產(chǎn)生的聚糖還原端被NaBH4還原成對堿穩(wěn)定的糖醇，以防糖鏈被堿降解。如用3H標(biāo)記的硼氫化鈉，可對釋放的聚糖還原端進(jìn)行標(biāo)記，便于在分離純化中跟蹤。也可用蛋白酶降解。產(chǎn)物進(jìn)行分

8、級分離與純化，得到不同的糖肽和或聚糖鏈，即可用于結(jié)構(gòu)分析。1(2) 聚糖的單糖組分分析： 用糖苷酶或酸堿將上述糖肽水解，把其中的單糖組分轉(zhuǎn)變成熱穩(wěn)定揮發(fā)性衍生物(如糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等)，再用氣-液相色譜法(gas-liquid chromatography,GLC)進(jìn)行鑒定和定量，檢測精度可達(dá)n mol級。GLC與質(zhì)譜法(mass spectrometry,MS)聯(lián)用，檢測精度可達(dá)10pmol級。如將單糖還原端進(jìn)行熒光標(biāo)記，再用HPLC(high-pressure liquid chromatoqraphy)與熒光測儀對其進(jìn)行鑒定和定量，檢測精度可達(dá)pmolfmol水平。

9、1980年代HPAEC-PAC(high pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection)用于單糖組分分析，無需制備單糖衍生物，檢測精度可達(dá)550 pmol水平。氨基糖可用氨基酸分析儀測定；唾液酸除用靈敏度較低的比色法測定外，已能利用高靈敏度GLC-MS對離子化的唾液酸進(jìn)行測定。(3) 糖鏈結(jié)構(gòu)分析： 已發(fā)展了一系列技術(shù)，可對糖鏈中每個單糖殘基的異頭結(jié)構(gòu)(或)、環(huán)式結(jié)構(gòu)類型(p或f)以及與其它糖殘基連接鍵的位置進(jìn)行測定。這些方法包括外切糖苷酶消化，利用特異性極高的外切糖苷酶水解糖鏈，再用HPLC、HPTLC

10、 (high- performance thin-layer chromatography)和HPCE(high-performance capillary electrophoresis)成套儀器進(jìn)行檢測，精度達(dá)fmolpmol級，可得到糖基連接鏈位置的信息。由于可用的高專一性外切糖苷酶種類有限，這種方法的應(yīng)用有很大的局限性。甲基化分析法利用甲基化等修飾反應(yīng)制備糖衍生物，經(jīng)GLC與質(zhì)譜儀聯(lián)用進(jìn)行檢測，精度可達(dá)0.110 pmol，可鑒定和定量殘基上特定位點取代以及糖的環(huán)式構(gòu)型。質(zhì)譜法在糖結(jié)構(gòu)分析中可測定糖環(huán)上鍵的類型與位置，如采用FAB(fast-atom bombardment)、LSIM

11、S(liquid secondary ion mass spectrometry)和MSMS(tandem mass spectrometry)，檢測精度可達(dá)fmolpmol水平。NMR(nuclear maqnetic resonance)用于糖結(jié)構(gòu)分析可測定糖基的異頭構(gòu)型和鍵的位置，精度達(dá)10pmoln mol水平，最顯著的優(yōu)點是無需制備糖衍生物。 (4) 糖鏈序列分析： 早期曾用外切糖苷酶從糖鏈非還原端依次切下特定的單糖，同樣由于可用的酶種類有限，而且進(jìn)行糖鏈序列分析的糖苷酶純度應(yīng)當(dāng)極高，因而限制了這種方法的應(yīng)用，常用的糖苷酶見表4.2。1980年代之前，糖鏈測序主要用MS和MS-GLC

12、法，需對樣品進(jìn)行甲基化、乙?；阮A(yù)處理。1980年后采用FAB-MS和ESI(electrospray ionization)-MS，檢測精度達(dá)n molp mol水平。酶來 源專 一 性Clostridium perfringensFuc1 2Gal-L-巖藻糖苷酶Diplococcu.s pneumoniasGal1 4GlcNAc-半乳糖苷酶Canavalia ensiformisMan1 2/6Man-甘露糖苷酶Diplococcus pneumoniasGlcNAc1 glycan-D-N乙酰氨基葡萄糖苷酶Diplococcus pneumoniasSia2 3/6Gal神經(jīng)氨酸酶S

13、ia2 6GkNAc內(nèi)切糖苷酶內(nèi)切-D-半乳糖苷酶Bacteroides fragillis-GlcNAc1-3Gal1 3/4GalNAc-Flavobacteriummeningoseptiumx-ManMan-GlcNAc-GlcNAc1Asn-x-ManD-糖苷酶Diplococcus pneumoniasGal1-3GalNAc1 Ser/Thr外切糖苷酶N-糖苷酶F表4.2 用于聚糖測序的幾種糖苷酶4.2.1.2 糖-肽連接鍵的類型 糖蛋白中的聚糖鏈均由其還原端以接枝方式與肽鏈特定部位的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)相連接，主要分為以下兩大類：(1) N-連接鍵： D-GlcNAc-Asn，又稱型

14、糖肽鍵，由糖鏈還原端的-D-GlcNAc殘基C1-OH基與多肽鏈Asn殘基側(cè)鏈酰胺-NH2間縮合，形成C-N糖苷鍵，廣泛分布于許多糖蛋白中。以肽鏈N端-NH2為連接點形成的N-糖-肽鍵迄今僅見于血紅蛋白Alc。(2) O-連接鍵： 由糖鏈還原端與含羥基的氨基酸側(cè)鏈-OH間形成C-O糖苷鍵。又可分為：D-GalNAc-Ser/Thr，又稱為(i)型糖-肽鍵，分布廣泛。D-Xyl-Ser/Thr，又稱(ii)型糖-肽鍵，主要存在于一些蛋白聚糖中。D-Gal-Hyl，又稱型糖-肽鍵，主要存在于膠原和絲心蛋白中。D-Ara-Hyp，僅見于高等植物中的一些糖蛋白。 型乳糖 Gal（14）Glc蔗 糖Fr

15、u（21）Glc繭 蜜 糖Glc（11）Glc區(qū) 別N-聚糖O-GalNAc聚糖糖-肽鍵GlcNAc1-N（Asn-x-Ser/Thr）GalNAc1-O（Ser/Thr）聚糖組成都含Man，GlcNAc,絕大多數(shù)不含GalNAc都含GalNAc,不含Man糖鏈分枝全部分枝不一定分枝糖-肽鍵化學(xué)裂解肼解稀堿水解聚糖內(nèi)側(cè)核心結(jié)構(gòu)都有分枝的五糖Man3GlcNAc2有多種，除GalNAc外，可含Gal或/和GlcNAc表4.3 N-聚糖與O-GalNAc聚糖的主要區(qū)別 血清糖蛋白多以N-糖肽鍵連接，因而N-聚糖又稱為血清型(plasma type)。血清型聚糖均由一個共同的五糖核心和不同數(shù)量的外鏈

16、組成。核心五糖結(jié)構(gòu)如下：Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc1-AsnMan1Man1364.2.1.3 N-聚糖的結(jié)構(gòu)根據(jù)核心五糖中兩個-Man上連接的糖基，N-聚糖可分為三類：高甘露糖型（high- or oligo-mannose type) 、 復(fù)雜型（complex type）和雜合型（hybrid type）。 圖4.2 三種類型的N-聚糖結(jié)構(gòu)示意圖虛線框內(nèi)為核心五糖。A.高甘露糖型；B.復(fù)雜型；C.雜合型222334Asn23644Asn3/6363446Asn3/642423/642BAC664高甘露糖型復(fù)雜型圖4.3 復(fù)雜型N-聚糖天線數(shù)及其位置263Asn2463As

17、n42663Asn22663Asn2426Asn263442C2C2二天線C2,4C2三天線C2C2,6三天線C2,4C2,6四天線C2,4C2,4,6五天線圖4.4 N-聚糖外鏈結(jié)構(gòu)示意圖見于1型糖鏈；兼有2，3和 2，6 Sia的外鏈；1型H抗原；無Fuc1-2者為Lae抗原；有Fuc1-2者為Leb 抗原；5Lea抗原；見于2型糖鏈；常見的唾液酸化三糖外鏈；2型H抗原；無Fuc1-2者為Lxe抗原；有Fuc1-2者為L ey抗原；(10)sLex 抗原；(11)僅存在于靈長類以下的哺乳動物；(12)存在于少數(shù)糖蛋白外鏈中LNunitSO436333234233244333343/6424

18、34441112 4.2.1.4 O-聚糖的結(jié)構(gòu) GalNAc-O-Ser/Thr糖肽鍵最早發(fā)現(xiàn)于粘蛋白，因而O-GalNAc聚粘又稱為粘蛋白型(mucin type)。最簡單情況Ser/Thr只連接一個GalNAc,見于不多幾種粘蛋白和分泌性糖蛋白中。少數(shù)糖蛋白中Ser/Thr上連接一個二糖，包括Sia2-6 GalNAc- ； Gal1-3 GalNAc- ； GlcNAc1-3 GalNAc- ； Gal1-3 GalNAc- 。含有兩個以上糖殘基的O-聚糖可將其結(jié)構(gòu)分為核心、骨架和非還原端三部分。(1) 核心： 與N-聚糖都只有核心五糖不同，O-GalNAc聚糖至少有7種核心結(jié)構(gòu)，如圖

19、4.5所示；其中核心結(jié)構(gòu)較為常見；核心結(jié)構(gòu)和分別是上述二糖和；核心和有分枝。(2) 骨架： 指核心結(jié)構(gòu)外側(cè)的延長部分，與N-聚糖的外鏈相似，基本上由連接的Gal-GlcNAc二糖單位組成，包括Gal1-3 GlcNAc(1型結(jié)構(gòu))、Gal1-4GlcNAc(2型結(jié)構(gòu))和(Gal1-4 GlcNAc1-3)n以及N-聚糖中不存在的Gal 1-3 GalNAc(3型結(jié)構(gòu))和Gal1-3 GalNAc-(4型結(jié)構(gòu))。O-GalNAc聚糖骨架的Gal C6位常連有GlcNAc1-6分枝，如Gal1-4 GlcNAc1-3(Gal1-4 GlcNAc1-6)Gal1-結(jié)構(gòu)，i抗原直鏈結(jié)構(gòu)上如形成這種分枝

20、就轉(zhuǎn)變成I抗原。 (3) 非還原端： O-GalNAc聚糖的非還原端常是在Gal上連一個Sai2-3或在GalNAc上連一個Sia2-6。還有相當(dāng)一部分O-GalNAc聚糖末端糖基被硫酸化，雖然糖鏈中部的糖基也可能被硫酸化。O-GalNAc聚糖非還原端部分往往構(gòu)成血型抗原，例如圖4.4中和分別為1型H和2型H抗原；則根據(jù)有無Fuc1-2分別為Lae和Lbe抗原；則按有無Fuc1-2分別構(gòu)成Lxe和Lye抗原。在H-1和H-2抗原結(jié)構(gòu)Gal上分別以1-3鏈連接Gal或GalNAc，就成為B-1、B-2和A-1、A-2抗原。4.2.2 糖蛋白的生物合成 糖蛋白肽鏈部分的合成由特定基因轉(zhuǎn)錄的mRNA

21、直接編碼，聚糖部分是后加的。N-聚糖的合成在肽鏈合成尚未完成時即已開始，是伴翻譯(co-translational)過程，O-聚糖的合成則是翻譯后(post-translational)修飾過程。糖基化位點的選擇、糖肽鍵的類型以及聚糖鏈的組成和結(jié)構(gòu)，都是在基因組編碼的一系列特異性酶順序作用下，在細(xì)胞內(nèi)特定的微環(huán)境中形成的，因而可以認(rèn)為聚糖鏈的合成受到基因組嚴(yán)格而精準(zhǔn)的間接控制。4.2.2.1 活化糖基供體的合成 所有的生物合成都需要把單體事先活化，以利于反應(yīng)朝著合成的方向進(jìn)行。聚糖鏈合成所需要的單糖也必需轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的活化形式，才能在糖基轉(zhuǎn)移酶催化下參入聚糖。蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)所需活化糖基供體有三

22、種類型：Glc、Gal、GlcNAc、GalNAc、Xy1和GlcA均為UDP-糖基；UDP-GlcA經(jīng)表異構(gòu)酶催化可轉(zhuǎn)化成UDP-IdoA；Man和Fuc為GDP-糖基；Sia則以CMP-Sia為活化供體；此外，UDP-Glc和GDP-Man還能將糖基轉(zhuǎn)移到ER膜中的Dol-P上，以Dol-P-Glc和Dol-P-Man的形式被糖基化反應(yīng)利用。圖4.6簡要概括了這些活化糖基供體的合成路線與相互轉(zhuǎn)化。圖4.6 活化糖基供體的生物合成及其相應(yīng)轉(zhuǎn)化帶陰影的矩形框為活化糖基供供；橢圓為單糖；星號處為控制點4.2.2.2 N-寡糖的合成 早在1960年代至1970年代，利用重建的無細(xì)胞系統(tǒng)和凝集素耐受

23、細(xì)胞系闡明了N-聚糖生物合成的基本途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)首先在ER中組裝一個脂質(zhì)載體連接的寡糖前體，再把這個寡糖前體轉(zhuǎn)移到新生肽鏈合適的糖基化位點上，最后在ER和Golgi器中經(jīng)過一系列剪接加工，形成成熟的糖蛋白。從1980年代開始克隆N-聚糖生物合成涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的基因并延續(xù)至今。這些基因特殊的表達(dá)模式以及它們編碼的酶突出的底物專一性為闡明N-聚糖特殊結(jié)構(gòu)的形成與變化具有重要意義。還注意到胚胎發(fā)生、細(xì)胞活化和腫瘤形成等條件下N-聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，為研究N-聚糖的生物學(xué)功能提供了新的契機。C=CH3CHCH2(CHCCH3CH3=CHCH2 )nCH2CHCH3OCH2OCH3=PO圖4.

24、7 多萜醇磷酸的結(jié)構(gòu)O(1) 多萜醇寡糖前體的組裝： N-聚糖的前體由14個特定的單糖連接而成，在所有真核細(xì)胞中這個寡糖前體的結(jié)構(gòu)是保守的。寡糖前體在磷酸多萜醇上組裝(圖4.7)。動物的多萜醇含1721個異戊二烯單元，真菌類和植物的多萜醇含有1424個異戊二烯單元。多萜醇的極性端通過焦磷酸與糖相連接，長長的烴鏈插入ER膜，把正在合成的寡 糖前體錨定在ER膜上。 如圖4.8所示，多萜醇焦磷酸寡糖前體組裝的第1步反應(yīng)由GlcNAc-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶把GlcNAc-P從UDP-GlcNAc上轉(zhuǎn)移到給Dol-P,同時釋放1分子UMP；然后再由GlcNAc轉(zhuǎn)移酶從UDP-GlcNAc上把第二個GlcNAc

25、轉(zhuǎn)移到Dol-PP-GlcNAc上，同時釋放1分子UDP。接下來，在第2步反應(yīng)中由5種不同的Man轉(zhuǎn)移酶以GDP-Man為糖基供體，依次添加5個Man。通過尚不完全了解的機制，Dol-PP-GlcNAc2-Man5穿越ER膜翻轉(zhuǎn)到ER腔(步驟3)。4個GDP-Man在ER膜胞液一側(cè)把Man轉(zhuǎn)移到Dol-P上，生成的Dol-P-Man翻轉(zhuǎn)到ER腔（步驟4和5）。在ER腔，4種Man轉(zhuǎn)移酶以Dol-P-Man為活化糖基供體，向Dol-PP-GlcNAc2Man5 再添加4個Man殘基(步驟6)。3個UDP-Glc在ER胞液一側(cè)把Glc轉(zhuǎn)移到Dol-P上，生成的Dol-P-Glc也翻轉(zhuǎn)到ER腔(步驟

26、7和8)。最后，由Glc轉(zhuǎn)移酶以Dol-P-Glc為糖基供體添加3個Glc殘基(步驟9)，完成Dol-PP-GlcNAc2 Man9 Glc3 寡糖前體寡糖前體的組裝。 多萜醇焦磷酸寡糖前體的合成過程涉及拓?fù)渥兓?。正如圖4.8所示，反應(yīng)1、2、4和7都發(fā)生在ER胞液一側(cè)，反應(yīng)6、9和10都發(fā)生在ER腔內(nèi)。反應(yīng)2形成的中間產(chǎn)物和反應(yīng)6、9所需要的糖基供體都必需在ER膜中翻轉(zhuǎn)到ER腔。盡管目前尚不清楚這種翻轉(zhuǎn)移位的機制，但用糖基化抑制劑、內(nèi)翻外的粗糙型ER囊泡進(jìn)行的研究都直接或間接證明了上述中間產(chǎn)物翻轉(zhuǎn)移位的事實。圖4.8 多萜醇焦磷酸寡糖前體的合成途徑(2) 寡糖前體轉(zhuǎn)移到新生肽鏈上： 上述完成

27、組裝的寡糖前體已具備了轉(zhuǎn)移到新生肽鏈上的條件，當(dāng)肽鏈中出現(xiàn)合乎要求的Asn殘基(Asn-x-Ser/Thr)時，包括14個糖殘基的寡糖前體整體轉(zhuǎn)移，同時釋放1分子Dol-PP，再翻轉(zhuǎn)到ER胞液面(步驟10和11)，其后經(jīng)磷酸酶作用Dol-PP失去一個磷酸基，又變成Dol-P，可以參與下一輪寡糖前體合成(步驟12)。 寡糖前體的轉(zhuǎn)移是由ER膜中的寡糖轉(zhuǎn)移酶(oligo-sacharyl transfrase, OST)催化的。酵母OST復(fù)合物至少包含9種不同的亞基：Ostlp、Ost3p、Wbp1p、Stt3p、Ost6p、Swplp、Ost2p、Ost5p和Ost4p，所有這些亞基都是跨膜蛋白

28、，有18個跨膜域，其中Ost1p對其活性必不可少(圖4.9)。寡糖前體末端的3個Glc顯然是其轉(zhuǎn)移信號，OST可識別其非還原端的3個Glc和還原端的GlcNAc，如果切掉最外側(cè)的兩個Glc，其轉(zhuǎn)移活性只剩下1/9；如將3個Glc全部切掉，就不能再被轉(zhuǎn)移。OST同樣具備識別多肽鏈中合適糖基化位點的能力。圖4.9 ER膜上的OST復(fù)合物催化十四寡糖從Dol-pp-寡糖前體轉(zhuǎn)移到新生多肽鏈中合適的Asn殘基上OSTComplex60S40S(3) N-糖鏈的加工和成熟： 結(jié)合在肽鏈上的十四寡糖首先被ER中的葡萄糖苷酶切去非還原端Glc1-2殘基，再由-葡萄糖苷酶切下另外2個Glc殘基。切除Glc不僅

29、是開啟后續(xù)加工的信號，而且與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)。如果糖蛋白折疊不適當(dāng)，即可被ER 腔一種UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶識別并重新糖基化，帶有Glc-Man9-GlcNAc2寡糖的不當(dāng)折疊蛋白質(zhì)即可被ER腔中的一種有糖結(jié)合活性的分子伴侶鈣連蛋白(calnexin)識別并結(jié)合，然后結(jié)合于多肽鏈部分，把十二寡糖的Glc1-3Man-暴露給-葡萄糖苷酶。-葡萄糖酶和UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶交替作用，直至多肽鏈正確折疊。正確折疊的肽鏈糖基化位點附近的疏水片段不再暴露，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶不再結(jié)合，最后一個Glc被切去，鈣連蛋白解離，寡糖的加工繼續(xù)進(jìn)行(圖4.10)。圖4.10 ER鈣連蛋白(ca

30、lnexin)在糖蛋白的折疊中的功能Glcase和為-葡萄糖苷酶和，Glc-T為UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 上述帶有十一寡糖Man9-GlcNAc2-糖蛋白隨即被ER中的-甘露糖苷酶切去核心糖1-6臂上的1-3分枝末端1-2連接的Man殘基，生成的Man8GlcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)即可進(jìn)入Golgi體繼續(xù)加工。有些糖蛋白的Man8GlcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)可被一種特殊的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶識別，在兩個1，2連接的末端Man內(nèi)側(cè)Man上各轉(zhuǎn)移一個GlcNAc-P-基團(tuán)，然后再由一種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶切去GlcNAc,把磷酸基留在Man C6位。這種有Man-6-P的寡糖是糖

31、蛋白被分揀和運輸?shù)饺苊阁w關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)信號。上述反應(yīng)在ER/Golgi中確切的定位尚不明確。另一些糖蛋白則可在Golgi器-甘露糖苷酶作用下，切去以1-2連接的其余3個Man殘基。 除上述逐步加工途徑外，ER中還有一種內(nèi)切-甘露糖苷酶，可切除Glc-Man9GlcNAc2-Asn 結(jié)構(gòu)末端的Glc1-3Man,生成的Man8GlcNAc2-Asn進(jìn)入Golqi體，由其中的-苷露糖苷酶切去3個1-2連接的Man(圖4.11)。圖4.11 ER和Golgi體內(nèi)N-寡糖的加工GlcNAc-P-T:N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶；GlcNAcase:N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。 在Golgi體內(nèi)，上述Man5G

32、lcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)如繼續(xù)添加Man，可形成高甘露糖型N-聚糖。如果由N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在核心結(jié)構(gòu)1，3臂的Man上添加一個1-2連接的GlcNAc，或由-甘露糖苷酶繼續(xù)切除1-6臂上的兩個Man，再添加適當(dāng)糖基，可形成雜合型N-聚糖。如果Man5GlcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)在-甘露糖苷酶作用下切去1-6臂上兩個Man，再由N-乙酰氨基葡萄基轉(zhuǎn)移酶添加1個GlcNAc，產(chǎn)物再由N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用在1-6連接的Man上以1-2連接1個GlcNAc，產(chǎn)物還可由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在Asn連接的GlcNAc上以1-6連接一個Fuc,生成的寡糖都可以成為復(fù)雜型N-聚糖的“核心”部分(圖

33、4.12)。圖4.12 Golgi體中產(chǎn)生高甘露糖型、雜合型和復(fù)雜型N-聚糖的基本途徑GlcNAc- T，-T：N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶， 上述復(fù)雜型N-聚糖“核心”在不同糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，順序添加糖基，形成各具特點的聚糖鏈。圖4.13出示了幾種雙天線復(fù)雜型N-聚糖的合成路線，包括末端為1-3連接的Fuc、2-3/6連接的Sia以及1-4連接的GlcNAc 4-SO4殘基的外鏈。圖4.13 幾種雙天線復(fù)雜型N-聚糖的合成1-4GaT為1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；1-4GlcNAc T為1-4N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶；1-3Fuc為1-3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；ST6 Ga1-1為CMP-Sia：Gal2-6

34、唾液酸轉(zhuǎn)移酶- 上述外鏈延伸和修飾主要在trans-Golgi垛疊和trans-Gogli網(wǎng)絡(luò)(TGN)中進(jìn)行(參看圖3.31)。除1-4Gal T外，還有一種1-3GlcNAc T-i，二者交替作用，合成(Gal1-4GlcNAc1-3)n。外鏈帶有Gal的N-聚糖進(jìn)入TGN后，在非還原端添加Sia而終止外鏈的合成。N-聚糖“核心”在1-4N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶和GlcNAc-4硫酸轉(zhuǎn)移酶相繼作用下完成4位硫酸化的外鏈合成。1-4GlcNAcT對受體糖鏈(雜合型或雙天線復(fù)雜型)有專一性，能識別LH和TSH肽鏈糖基化位點氨基一側(cè)含有Arg(或Lys)的序列。接于外鏈GlcNAc上的Fuc由1

35、-3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化。高等動物至少有5種1-3FucT,分別為、和，有組織分布專一性。其中型1-3FucT以2型糖鏈為受體時形成Fuc1-3連接；以型糖鏈為受體時則形成Fuc1-4連接，是“一種糖基轉(zhuǎn)移酶只形成一種糖苷鍵”這一法則唯一的例外。 多天線N-聚糖的合成涉及6種不同的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(GlcNAc T),其中GlcNAcT-和T-作用于核心五糖1-3臂Man，分別形成1-2和1-4連接鍵；GlcNAcT-、T-和T-作用于1-6臂Man，分別形成1-2、1-4和1-6連接鍵(圖4.14)。合成單天線只需要GlcNAcT-；雙天線需要GlcNAcT-和T-；C2，4，C2三天

36、線需要GlcNAcT-、T-和T-；C2 ， 2，6 三天線需要GlcNAcT-、T-和T-；合成四天線則需要GlcNAcT-、；GlcNAcT-負(fù)責(zé)合成平分型GlcNAc。這6種GlcNAc T均以UDP-GlcNAc為糖基供體，而受體各不相同，有嚴(yán)格的糖基序列專一性，因而它們的作用先后也有嚴(yán)格的順序：GlcNAcT-最先作用，其次是GlcNAcT-，然后是-甘露糖苷酶，接下來是GlcNAcT-和T-，最后是GlcNAcT-。C圖4.14 6種GlcNAcT(1)的作用位置及形成的糖苷鍵4.2.2.3 O-GalNAc聚糖的合成 O-GalNAc聚糖的合成是在已折疊的蛋白質(zhì)表面適當(dāng)?shù)腟er/

37、Thr上逐個添加糖基。O-GalNAc糖基化的發(fā)生比N-糖基化要晚，尚不能確定加上第一個GalNAc的確切亞細(xì)胞定位。很可能不同的糖蛋白O-GalNAc糖基化起始部位也不同，可以在ER、過渡小泡或cis-Golgi扁囊。起始之后，O-GalNAc聚糖其它糖基的添加、糖鏈延伸和非還原端形成都發(fā)生在Golgi體內(nèi)。O-GalNAc聚糖合成起始步驟由多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAcT)催化。哺乳動物至少可編碼8種ppGalNAcT，其中的4種(ppGalNAcT-14)已進(jìn)行了體外重組研究。多種GalNAcT同工酶很可能有差異地定位于不同的亞細(xì)胞區(qū)隔，與一些糖蛋白糖基化作用的組織和細(xì)

38、胞類型專一性有關(guān)?？蓪-GalNAc聚糖酶合成劃分為三個階段：核心結(jié)構(gòu)的合成；糖鏈延伸和分枝；非還原端的形成。(1) 核心結(jié)構(gòu)的合成：O-GalNAc聚糖至少有7種核心結(jié)構(gòu)，都是在GalNAc被pp GalNAcT添加到肽鏈上之后，再由有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶順序添加糖基形成的(圖14.15)。核心11-3半乳基轉(zhuǎn)移酶(corel Gal T)負(fù)責(zé)把1個Gal以1-3鍵連接到GalNAc-Ser/Thr上，形成核心1。已在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)至少3種corel GalT，可能也存在一個像ppGalNAcT一樣的家族，有差別地在特定的組織和細(xì)胞類型中表達(dá)，并表現(xiàn)出底物選擇性。核心21-6N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)

39、移酶(core 2 GlcNAcT)把1個GlcNAc以1-6鍵連接到核心1GalNAc殘基上，形成核心2。核心31-3GlcNAcT轉(zhuǎn)移酶(core 3 GlcNAcT)把1個GlcNAc以1-3鍵連接到GalNAc-Ser/Thr上，形成核心3。由于core 3 GlcNAcT與core 1 Gal AT都要利用相同的糖基受體，與core 2 GlcNAcT利用相同的糖基供體和相似的受體，因而在某些情況下，它們之間會出現(xiàn)競爭。核心41-6 N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)把另一個GlcNAc以1-6鍵連接到核心3的GlcNAc殘基上，產(chǎn)生核心4。另外三種出現(xiàn)頻率較低的核心結(jié)構(gòu)分別由core 5

40、 GalNAc T、core 6 GlcNAc T和core 7 GalNAc T以GalNAc-Ser/Thr為糖基受體而生成的。圖4.15 Gal NAc聚糖核心結(jié)構(gòu)的合成(2)糖鏈的延伸和分枝： 糖鏈延伸就是在上述核心結(jié)構(gòu)上逐個添加糖基，通常是1-3連接的GlcNAc或1-4連接的Gal。例如由1-3GlcNAcT在核心1或核心2的Gal上添加一個GlcNAc1-3，或由1-4Gal T在核心2，3，4中1-3GlcNAc或1-6GlcNAc殘基外側(cè)添加1-4連接的Gal。其次，還有1-6GlcNAc T、1-3Gal T參與鏈延伸，形成前面14型骨架結(jié)構(gòu)（圖4.16）。1-3GlcNA

41、c T和1-4Gal T交替作用，可形成LN重復(fù)序列（圖4.17）。圖4.16 1型和2型骨架的合成圖4.17 多聚N-乙酰乳糖胺的合成 外鏈骨架上的Gal1-4可接受1-6GlcNAc T轉(zhuǎn)移的GlcNAc T1-6殘基而形成分枝（圖4.18）。這個酶不同于參與N-聚糖合成的GlcNAc T-V和參與核心2和核心4合成的GlcNAc T，只能以O(shè)-GlcNAc 聚糖外鏈中的Gal1-4為糖基受體。 參與O-GalNAc聚糖核心和骨架合成的糖基轉(zhuǎn)移酶具有嚴(yán)格的底物序列專一性，因而作用有一定的先后順序。例如核心1的Gal上接受1個1-3連接的GlcNAc后，就不能作為core2 GlcNAc T

42、的底物。同樣，核心2中的Gal可接受1個1-3連接的GlcNAc，然后才能在Gal上連接1-6GlcNAc。這種3位取代抑制6位取代的現(xiàn)象被稱為“3先于6（three-before-six）”規(guī)律。圖4.18 由線性多聚乳糖（i抗原）生成1-6分枝多枝多聚乳糖胺（I抗原）示意圖（3）非還原端的形成： O-GalNAc聚糖的非還原端大致可通過三種方式形成：唾液酸化、硫酸化和巖藻糖基化。其中硫酸化只能對原來的非還原端糖基進(jìn)行修飾。2-3唾液基轉(zhuǎn)移酶家族至少已發(fā)現(xiàn)5個成員（ST3Gal-I、ST3Gal-、ST3Gal-、 ST3Gal-和ST3Gal-）負(fù)責(zé)以2-3鍵在末端Gal上引入一個Sia殘

43、基。這些酶的表達(dá)有組織專一性，只作用于O-聚糖和某些糖脂末端的Gal（圖4.19）。圖4.19 糖鏈末端Gal的2-3唾液酸化 括號內(nèi)的酶在體外系統(tǒng)活性相對較低 帶有2-3Sia的聚糖通常不再接受其它酶進(jìn)一步的修飾。糖鏈末端或次末端甚至內(nèi)部的GalNAc殘基可2-6唾液酸化。催化該反應(yīng)的2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族至少存在5個成員（ST6Gal-I、ST6GalNAc-I、ST6GalNAc-、ST6GalNAc-和ST6GalNAc-）（圖4.20）。末端2-6唾液酸化的聚糖通常也不接受進(jìn)一步的修飾。此外，還有一個2-8唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族，在糖蛋白和某些糖脂上合成2-8連接的線性多聚唾液酸。圖4.2

44、0 GalNAc的2-6唾液酸化括號內(nèi)的酶在體外系統(tǒng)相對活性較低 聚糖硫酸化通常出現(xiàn)在Gal、GalNAc、GlcNAc、GlcA和IdoA上，這些硫酸化的糖基可以是非還原端的也可能是內(nèi)部的。反應(yīng)由硫酸轉(zhuǎn)移酶家族催化，以PAPS為活性硫酸供體。例如唾液酸化的Lewis X抗原末端四糖為1-3GlcNAc（1-3Fuc）1-4Gal2-3Sia中的Gal第6位被硫酸化或GlcNAc第4位被硫酸化，或者二者均被硫酸化。硫酸化還可發(fā)生在末端Gal和GlcNAc第4位、GlcA第3位等位點上。部分聚糖鏈（尤其是血型抗原）合成中，非還原端Gal的巖藻糖基化是必需步驟，反應(yīng)由1-2FucT催化。此外，還有

45、1-3Fuc T催化外鏈中GlcNAc的1-3巖藻糖基化以及N-聚糖與Asn相連的GlcNAc的1-6巖藻糖基化（參看N-聚糖加工成熟有關(guān)敘述）。4.2.2.4 糖蛋白生物合成的調(diào)控（1）糖基化位點的選擇： 據(jù)統(tǒng)計，多肽鏈中的N-糖基化位點Asn-x-Ser/Thr三聯(lián)序列子大約只有三分之一被N-糖基化，說明決定是否糖基化還有很多因素。如 這個三聯(lián)序列如處于親水片段才能被N-糖基化。 三聯(lián)序列子約70%處于-轉(zhuǎn)角，N-糖基化的幾率最高；約20%處于-折疊，而10%處于-螺旋中的三聯(lián)序列子N-糖基化幾率最低。 三聯(lián)序列子中的X也明顯影響N-糖基化效率。如狂犬病病素糖蛋白3739位的Asn-Leu

46、-Ser糖基化率為43%，把Leu38分別突變成Glu、Asp、Trp和Pro，糖基化率依次遞減為24%、19%、5%和0；如X為Cys，可因形成二硫鍵降低N-糖基化幾率。 鄰近三聯(lián)序列子的氨基酸也可影響其糖基化率，如為Pro則降低糖基化率，羥基氨基酸則促進(jìn)N-糖基化。 盡管對許多O-糖基化位點周圍的氨基酸序列進(jìn)行了對比和分析，至今尚未找出一致序列。許多O-糖基化位點Ser/Thr附近多為Ala、Ser、Thr等，1和3位多為Pro，沒有帶電荷的殘基，大多數(shù)處于-轉(zhuǎn)角。 常識告訴我們，蛋白質(zhì)是否被糖基化？在何處糖基化？合成什么樣的聚糖鏈？都與蛋白質(zhì)自己的結(jié)構(gòu)有密切的聯(lián)系，只是現(xiàn)在所知尚少。（2

47、）糖基供體的可利用性：活化糖基供除CMP-Sia在核內(nèi)合成，其余的都在胞液中合成，ER-Golgi膜上的糖核苷酸運輸系統(tǒng)必然影響糖基供體的可利用性，從而對糖基化作用進(jìn)行調(diào)控。利用ER-Golgi膜微囊以及運輸系統(tǒng)有缺陷的突變體細(xì)胞進(jìn)行的研究表明，Golgi體擁有的運輸系統(tǒng)如圖4.21所示，而ER擁有其中UDP-Glc、UDP-GlcA、ATP、UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc的運輸系統(tǒng)。這些運輸系統(tǒng)實際上是雙向搬運工，一方面把活化糖基供體運入ER-Golgi腔內(nèi)，使它們的濃度增加1050倍，足以達(dá)到或超過估算的多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶對其糖基供體的Km，保證了糖基化反應(yīng)對供體的需求；另一方面，

48、糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成的5-NMP不僅抑制運輸裝置，還強烈抑制糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，及時將其移出ER-Golgi腔對保證糖基轉(zhuǎn)移酶有足夠的活性很重要。作為整個調(diào)節(jié)機制的一環(huán)，上述運輸系統(tǒng)顯然是不可或缺的。圖4.21 Golgi膜上糖-核苷酸、ATP和PAPS的運輸系統(tǒng)（3）遺傳控制： 除了不多幾種加工性糖苷酶，聚糖生物合成主要涉及糖基轉(zhuǎn)移酶。大多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶是膜蛋白，迄今已研究過的Golgi糖基轉(zhuǎn)移酶均為型膜蛋白：短的N-端在細(xì)胞溶膠內(nèi)，單跨膜，巨大的C-端催化域位于膜的非胞液一側(cè)。與溶酶體中P-6-Man合成有關(guān)的兩個酶：N-乙酰氨基葡萄糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶和-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶為型膜蛋白，N-端催化域

49、在Golgi腔內(nèi)。糖基轉(zhuǎn)移酶顯著的特點是具有極高的底物專一性，即對糖基供體和受體的結(jié)構(gòu)有高度選擇性，前一個酶的產(chǎn)物優(yōu)先被另一糖基轉(zhuǎn)移酶用作后續(xù)糖基化的受體底物，結(jié)果一組相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶按一定的順序作用，以非凡的精確度把單糖基彼此連接成特定的聚糖。 人體紅細(xì)胞A、B、O（H）血型抗原是說明聚糖結(jié)構(gòu)受基因型間接控制的良好范例。圖4.22出示了14型A、B、O（H）血型抗原結(jié)構(gòu)。A、B、O（H）抗原的合成起始于1-2Fuc轉(zhuǎn)移酶對前體聚糖的修飾。人類基因組的H基因編碼一個H1-2Fuc T，Se基因編碼一個Se1-2Fuc T，前者在紅細(xì)胞中表達(dá)，利用2型和4型聚糖前體；后者在消化道、呼吸道、生殖道

50、和唾液腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，利用1型和3型聚糖前體，合成分泌型血型抗原，分泌到血漿中，被紅細(xì)胞吸附于表面。1-2FucT把1個Fuc以1-2鍵連接到14型聚糖前體的非還原端Gal殘基上，形成O（H）抗原。A基因型ABO基因座位的A基因編碼一種1-3GalNAc T（A轉(zhuǎn)移酶），在H抗原的Gal上添加1個1-3連接的GalNAc, 成為A抗原。B基因型ABO基因座位的B等位基因編碼一種1-3Gal T（B轉(zhuǎn)移酶），在H抗原的Gal上添加1個1-3連接的Gal，形成了B抗原（圖4.23）。圖4.22 A、B、O（H）、血型抗原的結(jié)構(gòu) O基因型的O等位基因缺258位堿基，結(jié)果不能編碼有活性的酶，不能對H

51、抗原進(jìn)一步修飾。AB血型的人既有1-3GalNAc T，又有1-3Gal T，所以同時擁有A抗原和B抗原。A轉(zhuǎn)移酶和B轉(zhuǎn)移酶要求其糖基受體末端1-3 （4）Gal必須1-2巖藻糖基化。圖4.23 A、B、O（H）血型抗原的合成 Bombay基因型個體因1-2Fuc T缺失而不能進(jìn)行巖藻糖基化，或者先被唾液酸化，A轉(zhuǎn)移酶或B轉(zhuǎn)移酶都不再利用它作為底物。所以Bombay型的人既沒有H抗原，也沒有A抗原和B抗原,再次表明，在糖基轉(zhuǎn)移酶組成的聚糖裝配線上，位置越靠前的酶，一旦出現(xiàn)缺失影響的聚糖結(jié)構(gòu)越多。人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的IgM可與相應(yīng)的ABO抗原相互作用。O型個體可產(chǎn)生抗A抗原的抗體和抗B抗原的抗體，

52、血液中都保持相當(dāng)高的IgM效價；A型個體血漿中含有相當(dāng)多的抗B抗原的IgM抗體；B型個體血漿中含有很高的抗A抗原的IgM抗體；而AB型個體既不產(chǎn)生抗A抗原的IgM，也不產(chǎn)生抗B抗原的IgM。血漿中的IgM抗體能與“異己的”紅細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，并激活補體系統(tǒng)，導(dǎo)致低血壓、休克、腎衰竭、循環(huán)衰竭甚至死亡。因此必需對供血者和受血者進(jìn)行正規(guī)的交叉匹配，以避免發(fā)生輸血反應(yīng)。合成A抗原的A轉(zhuǎn)移酶與合成B抗原的B轉(zhuǎn)移酶同屬一個1-3Gal轉(zhuǎn)移酶家族，它們之間只有4個氨基酸不同，它們的基因也只有4個堿基不同：氨基酸殘基位置176235266268A轉(zhuǎn)移酶的殘基及密碼子Arg (CGC)Gly (

53、GGC)Lys (CTG)Gly (GGG)B轉(zhuǎn)移酶的殘基及密碼子Gly (GGC)Ser (AGC)Mct (ATG)Ala (GCG) 研究表明，不同種屬的同一組織或同一種屬的不同組織中，相同肽鏈上連接的聚糖并不相同，即聚糖結(jié)構(gòu)具有種屬和組織專一性。例如質(zhì)膜糖蛋白-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（-GT），人和牛的腎-GT聚糖結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)，主要區(qū)別為人腎-GT的N-聚糖全部為復(fù)雜型，而牛腎-GT含10%高甘露糖型；人腎-GT含酸性聚糖僅31%，且均為C2,4C2三天線，而牛腎-GT含62%的酸性聚糖，除三天線外還有二天線和四天線；人腎-GT的天線外鏈有60%以上的GlcNAc與1，3Fuc相連，且有LN重復(fù)

54、序列，而牛腎-GT沒有外鏈Fuc和LN重復(fù)序列。同一物種的腎-GT的N-聚糖全部含有平分型GlcNAc，而其肝-GT則幾乎完全沒有平分型GlcNAc。4.2.2.5 糖鏈結(jié)構(gòu)的微觀不均一性（microheterogenity） 此外，同一個體同一組織中不同糖蛋白也表現(xiàn)出糖鏈結(jié)構(gòu)的不均一性。例如同樣在人肝中合成的-GT與運鐵蛋白（Tf），-GT的N-聚糖約2/3為二天線，其余1/3為三天線和四天線，其中四天線聚糖約1/3含LN重復(fù)序列，而Tf超過95%都是不含LN重復(fù)序列的二天線N-聚糖。即使是同一蛋白，其中不同的N-糖基化位點所連接的N-聚糖結(jié)構(gòu)也不盡相同。上述聚糖結(jié)構(gòu)的這種不均一性又被稱為糖

55、形（glycoform）。圖4.24出示大鼠胸腺細(xì)胞和腦中Thy-1糖蛋白3個位點上聚糖結(jié)構(gòu)的變化。盡管肽鏈結(jié)構(gòu)完全相同，但在這兩種細(xì)胞中這3個糖基化點上的聚糖不盡相同，甚至同一位點上聚糖結(jié)構(gòu)也有明顯改變。圖4.24 大鼠Thy-1中N-聚糖的不均一性存在率二天線），Con A+（單天線或二天線）3天線分布 C2 C2,6三天線，C2,4 C2,6四天線DSA+，Con A-，L-PHA+ C2,4 C2三天線DSA+，Con A-，L-PHA- C2,4偏二天線DSA+，Con A-，L-PHA-4平分型Glc NAcE-PHA+，WGA+，Con A-5核心FucAAL+(無論有無平分型G

56、lc NAc)，LCA+(無平分型Glc NAc)6唾液酸WGA+ 2-6SNA+，Allo A+ 2-3MAA+7LN重復(fù)序列PML+，DSA+表4.5 N-聚糖結(jié)構(gòu)分析常用凝集素的選擇 目前可以用某些固定化凝集素柱分離處于特定發(fā)育階段的細(xì)胞、突變細(xì)胞株、癌細(xì)胞或受病毒侵染的細(xì)胞。例如用固定化花生凝集素（PNA）專一地吸附未成熟的胸腺細(xì)胞，用半乳糖溶液洗脫，即可分離出純度很高的未成熟胸腺細(xì)胞。利用某些凝集素的血型專一性不僅可區(qū)分ABO血型，還能鑒別其亞型。 如利馬豆凝集素（PLA）僅凝集A型血細(xì)胞，歐洲百脈根凝集素（LTL）對O型血細(xì)胞專一，西非單葉豆凝集素（BSL）對B型專一，雙花扁豆凝集

57、素（DBL）對A1型專一。（5）在病原體-寄主細(xì)胞識別中的作用： 病原菌（或寄生菌）對寄主的感染以及寄主巨噬細(xì)胞吞噬病原體的過程，同樣從細(xì)胞間的專一性識別和粘著開始。流感病毒就是通過識別細(xì)胞表面聚糖鏈末端的Sia殘基進(jìn)入寄主細(xì)胞的。A型和B型流感病毒識別5-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu 5Ac）或5-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu 5Gc），而C型病毒都只能識別5，9-二乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5 9Ac）。流感病毒含有唾液酸酶，能專一地水解作為其受體的唾液衍生物。A型和B型病毒只水解Neu 5Ac或Neu 5Gc，C病毒含的酶卻能水解Neu 5，9Ac生成Neu 5Ac。唾液酸被水解后病毒不能再結(jié)合而從細(xì)胞表面

58、脫落，使同一型病毒入侵受阻，但不影響另一類型病毒的侵染。 不同細(xì)菌表面凝集素專一地認(rèn)別細(xì)胞表面不同的聚糖或糖基，例如霍亂弧菌凝集素識別L-Fuc和D-Man，大腸桿菌凝集素識別-D-Man，綠膿桿菌凝集素識別D-Gal和D-Man，雞敗血枝原體凝集素識別Sia，這是不同細(xì)菌侵染性差別的分子基礎(chǔ)。又如肺炎球菌識別肺泡和腦膜細(xì)胞表面聚糖中的GlcNAc，而嗜腐球菌識別尿路細(xì)胞表面的Glc NAc和Gal NAc，所以它們分別侵染肺、腦組織和尿路上皮。正因為A和AB血型的人細(xì)胞表面的A抗原有Gal NAc末端，因此易受嗜腐球菌感染。 同樣，細(xì)胞表面凝集素樣蛋白也能專一識別細(xì)菌表面的糖復(fù)合物。例如紫花

59、苜蓿根毛表面的凝集素可識別苜蓿根瘤菌表面的糖，進(jìn)而促成二者間的粘著，逐步形成根瘤。 （6）在配子識別與結(jié)合中的作用： 有性繁殖中同種配子之間專一的識別與結(jié)合，使物種的遺傳特性得以世代相傳。成熟的卵子與已經(jīng)獲能的精子相遇，精子頭部細(xì)胞器（頂體）外膜與質(zhì)膜融合，釋放水解酶、糖結(jié)合蛋白等內(nèi)容物，再以囊泡的形式脫離精子，稱為頂體反應(yīng)。小鼠卵的透明帶含有3種糖蛋白：ZP-1,2,3，其中ZP-3是與精子結(jié)合誘發(fā)頂體反應(yīng)的主要蛋白，可視為精子的受體。精子表面一種糖蛋白SP56與ZP-3專一結(jié)合，精子頭部膜結(jié)合的1-4 Gal T也介導(dǎo)與ZP-3的結(jié)合。 ZP-3上有N-聚糖也有O-Gal NAc 聚糖，而

60、O-Gal NAc聚糖是ZP-3與SP56結(jié)合所必需的。由于SP56可與固相Gal結(jié)合，因而認(rèn)為SP56與卵ZP-3上 O-Gal NAc-聚糖末端的Gal專一結(jié)合，是小鼠精卵結(jié)合重要的分子基礎(chǔ)。由于精卵結(jié)合的專一性涉及多種凝集素樣蛋白與特定聚糖結(jié)構(gòu)之間的相互作用，真正的分子機制肯定還要復(fù)雜得多。（7）在細(xì)胞粘附中的作用： 細(xì)胞作為有機體生命活動的基本單位，必須相互粘合或與胞外基質(zhì)粘合，形成組織、器官和完整的個體。參與細(xì)胞識別與粘合的大分子幾乎都是糖蛋白和蛋白聚糖。細(xì)胞表面的凝集素或凝集素樣蛋白對配體糖結(jié)構(gòu)專一的結(jié)合可能是細(xì)胞粘附專一性的分子基礎(chǔ)。迄今已鑒定的細(xì)胞表面的粘附分子（cell ad