產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌A226G突變體的構(gòu)建

1、產(chǎn)紅霉素C的糖多孢紅霉菌A226G-突變體的構(gòu)建袁華黃訓(xùn)端張部昌劉道琴趙皓孔小衛(wèi)張書(shū)祥紅霉素(erythryin，Er)是由革蘭陽(yáng)性細(xì)菌糖多孢紅霉菌(Saharplyspraerythraea)合成的次生代謝產(chǎn)物，為一類(lèi)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，包羅紅霉素A(ErA)、紅霉素B(ErB)、紅霉素(Er)和紅霉素D(ErD)等。這四種紅霉素均有抑菌活性，但在臨床上抑菌活性最高，用途最普及的是ErA1，2。紅霉素生物合成的基因以單一拷貝、成簇情勢(shì)存在于糖多孢紅霉菌的環(huán)形染色體上，質(zhì)粒不到場(chǎng)紅霉素的生物合成1，3。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1質(zhì)料(1)菌種和質(zhì)粒糖多孢紅霉菌A226、大腸埃希菌ET125675和同源重

2、組質(zhì)粒pH36由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技能研究所王以光傳授惠贈(zèng)；糖多孢紅霉菌染色體整合型表達(dá)載體pZ7、大腸埃希菌DH58和克隆質(zhì)粒pU18為本室保存；質(zhì)粒pUG、pHG、糖多孢紅霉菌突變體A226G-、質(zhì)粒pZG和糖多孢紅霉菌基因工程菌A226G-G+為本研究構(gòu)建。硫鏈絲菌肽(thistreptn，Thi)、安普霉素(aprayin，A)和PEG3350為Siga公司產(chǎn)物，溶菌酶為Fluka公司產(chǎn)物，卵白酶K為Ares公司產(chǎn)物，TSB為Dif公司產(chǎn)物，限定性內(nèi)切酶、T4DNA毗連酶和DNAarker(DL2000和DL15000)為大連寶生物公司產(chǎn)物，RNaseA、dNTP、pfu和TaqD

3、NA聚合酶為上海生工公司產(chǎn)物，質(zhì)粒提取試劑盒和PR產(chǎn)物接納試劑盒為道普生物科技(北京)產(chǎn)物，別的試劑為闡發(fā)純。1.2要領(lǐng)(1)大腸埃希菌的造就、感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒酶切、毗連、轉(zhuǎn)化等按Sabrk等8要領(lǐng)或產(chǎn)物說(shuō)明書(shū)舉行；質(zhì)粒提娶PR產(chǎn)物純化按道普生物科技(北京)產(chǎn)物說(shuō)明書(shū)舉行。(2)糖多孢紅霉菌A226的造就和基因組DNA的提取按Hpd等9要領(lǐng)舉行。(3)GDNA片斷重疊PR引物的方案上游片斷Fra1引物：卑劣片斷Fra2引物：(4)eryG基因PR引物的方案是按照GenBank宣布的糖多孢紅霉菌紅霉素eryG基因序列(GenBank登暗號(hào)A420293)，方案并合成了1對(duì)引物：(5)GDN

4、A片斷和eryG基因片斷的PR擴(kuò)增按文獻(xiàn)12操縱。(6)糖多孢紅霉菌A226原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)13操縱。(7)糖多孢紅霉菌A226:pHG整合體I和II及糖多孢紅霉菌A226G-突變體的挑選按文獻(xiàn)14操縱。(8)糖多孢紅霉菌A226:pHG整合體I和II及A226G-突變體發(fā)酵液中紅霉素身分的薄層層析(TL)闡發(fā)按文獻(xiàn)4操縱。(9)糖多孢紅霉菌A226:pHG整合體I和II的PR斷定按文獻(xiàn)14操縱。(10)糖多孢紅霉菌A226G-突變體PR斷定的引物序列方案按1.2(4)節(jié)中方案的引物序列。(11)糖多孢紅霉菌A226G-突變體發(fā)酵液中紅霉素身分的質(zhì)譜(S)闡發(fā)按文獻(xiàn)14操縱。2效果與

5、闡發(fā)2.1同源重組質(zhì)粒pHG的構(gòu)建以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模板，PR先擴(kuò)增出上游片斷Fra1和卑劣片斷Fra2，再以Fra1和Fra2為模版、P11和P22為引物，用重疊PR擴(kuò)增出全長(zhǎng)約1600bp的DNA片斷G，克隆到pU18載體上構(gòu)建質(zhì)粒pUG。序列闡發(fā)表白，所克隆的GDNA片斷序列與GenBank宣布的序列完全同等(290bpDNA片斷已被刪除，測(cè)序圖略)。pH3質(zhì)粒6為穿梭型質(zhì)粒，在糖多孢紅霉菌中不克不及不變存在，故可作為糖多孢紅霉菌的同源重組質(zhì)粒。pUG質(zhì)粒中外源DNA用ERI和HindIII酶切后連于pH3質(zhì)粒相應(yīng)酶切位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5得到了pHG質(zhì)粒(Fig

6、.1)。為制止糖多孢紅霉菌對(duì)外源基因的限定性作用(甲基DNA限定)15，將pHG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌ET12567，得到了無(wú)甲基化修飾的pHG質(zhì)IdentifiatinfpHGutbyERI/HindIII粒。2.2糖多孢紅霉菌A226:pHG整合體I和II的挑選將糖多孢紅霉菌A226制成原生質(zhì)體，用pHG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，在含30g/lThi的R3固體造就基上舉行篩眩因pHG質(zhì)粒在糖多孢紅霉菌中不克不及復(fù)制，只有整合到染色體上才氣給予菌體不變的Thi抗性。從轉(zhuǎn)化平皿中挑取110個(gè)單菌落涂含30g/lThi的R3歪面，有2個(gè)菌落可正常生長(zhǎng)，別離定名為A226:pHG整合體I和II。提取整合體I和II基因

7、組DNA做模板，別離以質(zhì)粒pHG和動(dòng)身菌株A226基因組作為陽(yáng)性和陰性比較，PR擴(kuò)增pHG質(zhì)粒上Thi抗性基因tsr舉行斷定。1.2%瓊脂糖凝膠電泳效果表現(xiàn)，整合體I和II的PR產(chǎn)物與陽(yáng)性比較一樣，巨細(xì)位于768bp四周，與預(yù)期符合，而陰性比較并無(wú)此條帶(Fig.2)，表白pHG質(zhì)粒已整合到A226的染色體上。糖多孢紅霉菌紅霉素生物合成基因在染色體上以單一拷貝、成簇情勢(shì)存在，此中eryAI、eryAII、eryAIII、eryII、eryIII、eryBII和eryG為一條多順?lè)醋?，配合受到eryAI啟動(dòng)子的操縱1。假設(shè)pHG質(zhì)粒與A226染色體在同源片斷Fra1內(nèi)產(chǎn)生同源重組，那么eryG基

8、因的表達(dá)將會(huì)受到按捺，整合體發(fā)酵液就會(huì)積聚ErA生物合成的中心產(chǎn)物Er；假設(shè)在同源片斷Fra2內(nèi)產(chǎn)生同源重組，那么eryG基因的表達(dá)將不會(huì)受到影響，整合體仍舊可以合成ErA。為了確定pHG質(zhì)粒的整合位置，提取整合體I和II發(fā)酵液中的紅霉素舉行薄層層析(TL)，TL效果表現(xiàn)整合體I是在同源片斷Fra1內(nèi)產(chǎn)生同源重組的，而整合體II是在同源片斷Fra2內(nèi)產(chǎn)生同源重組的(Fig.3)。2.3糖多孢紅霉菌A226G-突變體的挑選同源重組質(zhì)粒pHG在染色體上不不變，在無(wú)抗生素選擇壓力時(shí)會(huì)自覺(jué)產(chǎn)生染色體內(nèi)二次重組而脫落。假設(shè)第二次重組與第一次重組產(chǎn)生在同一同源片斷內(nèi)，質(zhì)粒脫落伍染色領(lǐng)會(huì)復(fù)興到質(zhì)粒整合前狀態(tài)

9、，菌株規(guī)復(fù)ErA合本錢(qián)領(lǐng)；假設(shè)第二次重組與第一次重組產(chǎn)生在差異的同源片斷內(nèi)，質(zhì)粒脫落伍eryG基因DNA序列會(huì)產(chǎn)生刪除突變，突變株將失去ErA合本錢(qián)領(lǐng)，發(fā)酵液中會(huì)有Er的積聚。糖多孢紅霉菌A226:pHG整合體I在無(wú)Thi的R3歪面上一連生長(zhǎng)三代后，將制得的原生質(zhì)體差異濃度稀釋液涂無(wú)Thi的R3平皿。從平皿中挑取約1000個(gè)單菌落，各一連涂含30g/lThi的R3歪面和無(wú)Thi的R3歪面，此中有5個(gè)菌落僅可以在無(wú)Thi的R3歪面上生長(zhǎng)，表白這5個(gè)克隆中同源重組質(zhì)粒pHG已從A226染色體上脫落下來(lái)。提取這5個(gè)克隆的紅霉素做TL，效果表現(xiàn)只有4號(hào)克隆僅可以積聚Er，此克隆被定名為A226G-(F

10、ig.4)。別的4個(gè)克隆都為復(fù)興突變，即規(guī)復(fù)了ErA的合本錢(qián)領(lǐng)。將A226G-突變體舉行液體造就，提取基因組DNA，以eryG基因上游引物P1和卑劣引物P2舉行PR擴(kuò)增，A226G-突變體PR產(chǎn)物的條帶顯著地比A226的要小(Fig.5)。對(duì)A226G-突變體的PR產(chǎn)物直接舉行序列闡發(fā)也表白此突變株eryG基因中心部門(mén)預(yù)期的290bpDNA片斷已被刪除(測(cè)序圖略)。2.5A226G-突變體中eryG基因的成效賠償(1)糖多孢紅霉菌表達(dá)質(zhì)粒pZG的構(gòu)建以糖多孢紅霉菌A226總DNA為模板，以P1和P2為引物PR擴(kuò)增出eryG基因，克隆到pU18載體上構(gòu)建了質(zhì)粒pUG。序列闡發(fā)表白，所克隆的ery

11、G片斷序列與GenBank宣布的序列完全同等(測(cè)序圖略)。將pUG中的eryGDNA片斷亞克隆至糖多孢紅霉菌表達(dá)載體pZ中，構(gòu)建了質(zhì)粒pZG。NdEi和ERV酶切pZG質(zhì)粒后得到預(yù)期巨細(xì)的兩個(gè)片斷(Fig.7)。(2)互補(bǔ)試驗(yàn)將糖多孢紅霉菌突變體A226G-制成原生質(zhì)體，用pZG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，在含125g/lA的R3固體造就基上舉行篩眩從轉(zhuǎn)化平皿中挑取6個(gè)單菌落涂含125g/lA的R3歪面，這6個(gè)克隆均可正常生長(zhǎng)，定名為A226G-G+I、II、III、IV、V和VI。接種A226G-G+I和A226于100lTSB造就基/500l三角燒瓶中，30振蕩造就120h，提取發(fā)酵產(chǎn)物紅霉素，TL效果表現(xiàn)

12、A226G-G+I規(guī)復(fù)了ErA的消費(fèi)本領(lǐng)(Fig.8)。3討論基因敲除技能是20世紀(jì)80年代末生長(zhǎng)起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技能，是通過(guò)必然的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技能，因此基因敲除技能在特定基因成效的研究中表現(xiàn)出越來(lái)越緊張的職位。通常意義上的基因敲除重要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用方案的同源片斷交換靶基因片斷，到達(dá)基因敲除、失活的目的。Reeves等17通過(guò)S1核酸酶庇護(hù)實(shí)行猜測(cè)紅霉素eryG基因大概有單獨(dú)的啟動(dòng)子，但迄今為止并沒(méi)有有力的文獻(xiàn)證明。在本研究中，整合體I紅霉素發(fā)酵液乙酸乙酯提取物經(jīng)TL闡發(fā)仍可見(jiàn)到少量的ErA斑點(diǎn)(Fig.3)，S闡發(fā)也表白發(fā)酵液中既有Er又有ErA(圖譜略)，說(shuō)明縱然是在同源片斷Fra1內(nèi)產(chǎn)生同源重組也沒(méi)有完全阻