8硝基白楊素對HL60細(xì)胞凋亡與PTENAkt途徑的影響

1、8-硝基白楊素對HL-60細(xì)胞凋亡與PTEN-Akt途徑的影響【摘要】目的不雅察8-硝基白楊素(NhR)按捺人急性髓性白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，并探究其作用機(jī)制是否與PTEN-Akt信號傳導(dǎo)途徑相干。要領(lǐng)體外造就HL-60細(xì)胞。TT比色法檢測增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)F定量闡發(fā)細(xì)胞凋亡程度；esternBlt闡發(fā)HL-60細(xì)胞PTEN、P-Akt卵白表達(dá)的影響。效果NhR明顯按捺HL-60細(xì)胞增殖，呈濃度依靠性，其I50值為1.34l/L；NhR具有誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡作用，且呈濃度和時間依靠性。NhR以濃度和時間依靠方法上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN卵白表達(dá)和按捺P-Akt卵白表

2、達(dá)，其作用可被PPAR特異性阻斷劑G9662(10l/L)預(yù)孵育拮抗。結(jié)論NhR誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡作用與其活化PPAR，上調(diào)PTEN卵白表達(dá)，按捺按捺Akt磷酸化相干。【關(guān)鍵詞】人急性髓性白血病白楊素凋亡白楊素(hR)是一種具有普及生物活性的黃酮類化合物，在蜂膠中含量較高，具有抗氧化、抗病毒、抗高血壓并抗糖尿病等藥理作用。以往的實行研究表白，hR按捺人甲狀腺癌細(xì)胞生長；通過拮抗雌激素受體，按捺人乳腺癌細(xì)胞DNA合成；通過調(diào)控腫瘤壞死因子TNF-表達(dá)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡。我們研究創(chuàng)造8硝基白楊素(NhR)按捺人胃癌(SG-7901)細(xì)胞、人結(jié)腸癌(HT-29)細(xì)胞作用較白楊素更強(qiáng)1。Sng等2

3、報道白楊素具有按捺卵白激酶K2,上調(diào)腫瘤按捺基因產(chǎn)物PTEN卵白表達(dá)，按捺Akt磷酸化作用。Kanari等3對子宮內(nèi)膜癌的研究表現(xiàn),PTEN卵白表達(dá)喪失構(gòu)造中Akt磷酸化程度顯著升高,兩者呈明顯負(fù)相干。本研究旨在不雅察NhR按捺HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用及其與PTEN-Akt途徑的相干性。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1細(xì)胞與細(xì)胞造就HL-60細(xì)胞購于中國典范造就物收藏中央(中國武漢市)，用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(FS)的RPI-1640造就基在體積分?jǐn)?shù)5%2，37，飽和濕度的細(xì)胞造就箱內(nèi)造就，23d傳代1次，取對數(shù)生恒久細(xì)胞用于實行。1.2藥品與試劑NhR參照文獻(xiàn)4要領(lǐng)合成，分子量299，黃色

4、晶體，純度99.0。hR為美國Siga公司產(chǎn)物，全反式維甲酸、二甲基亞砜(DS)和G9662為美國Siga公司產(chǎn)物；鼠抗人PTEN單克隆抗體，鼠抗人P-Akt單克隆抗體及兔抗鼠IgG多克隆抗體由Santaruz生物公司消費，購于北京中杉金橋生物技能，小牛血清為杭州四序青生物產(chǎn)物；胎牛血清購于天津灝洋生物；PVDF膜購于Pall公司；胰酶、TT購于Aeres公司；1640造就基由GiB公司消費。1.4PI染色F闡發(fā)HL-60細(xì)胞經(jīng)無血清造就基處置懲罰24h后，用含差異濃度藥物的造就基別離處置懲罰48h后，網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞，用PBS吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，冷PBS洗2遍，用4的70%乙醇結(jié)實24h后，碘化丙

5、啶(PI)染色，上流式細(xì)胞儀(美國BD公司，F(xiàn)AS420)檢測細(xì)胞凋亡環(huán)境。1.5esternblt闡發(fā)用1640造就基調(diào)解HL-60細(xì)胞濃度為2104/l接種于造就板中，每孔1l，參加10.0l/L的NhR孵育0，4，8，24h；網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞，于4裂解液中裂解，離心后舉行卵白定量，用胎牛血清作為標(biāo)化比擬組，加緩沖液(42Tris-l，10%glyerl，2.3%SDS，5%2-eraptethanl和0.02%brphenlblue)，煮沸5in后SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，卵白被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，別離用鼠抗人PTEN、p-Akt抗體孵育，參加過氧化物酶標(biāo)識表記標(biāo)幟二抗并使膠片感光。用PPAR

6、特異性阻斷劑G9662實行檢測NhR是否通過活化PPAR調(diào)控PTEN和p-Akt卵白表達(dá)。實行重復(fù)3次。1.6統(tǒng)計學(xué)處置懲罰各組實行數(shù)據(jù)均用s表現(xiàn)，接納SPSSinds11.5軟件neayANVA方法行方差闡發(fā),兩兩比力接納Studentst查驗。2效果2.1NhR對HL-60細(xì)胞生長按捺作用差異濃度的NhR，ATRA，hR別離作用48h后，NhR能明顯按捺HL-60細(xì)胞的增殖，呈劑量依靠性，其I50值為1.34l/L。NhR按捺HL-60細(xì)胞增殖作用的效價強(qiáng)度高于先導(dǎo)化合物hRP0.05，與陽性比擬物ATRA相稱。見表1。表1NhR對HL-60細(xì)胞的生長按捺作用略與hR組比擬，*P0.01;

7、n=42.28硝基白楊素對HL-60細(xì)胞凋亡的影響NhR誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡率達(dá)23.16%，而雷同濃度hR的凋亡率僅為5.8%，陽性比擬藥物ATRA誘導(dǎo)的凋亡率是9.75%。見圖1。圖1PI染色F闡發(fā)8硝基白楊素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡略2.3NhR對HL-60細(xì)胞PTEN-Akt信號途徑影響提示NhR以時間依靠方法上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN卵白表達(dá)，較0h別離上調(diào)80.212%,10924%和11927；以時間依靠方法下調(diào)HL-60細(xì)胞p-Akt卵白表達(dá)，較0h別離下調(diào)7.92%,65.56%和89.59(見圖2)。PPAR特異性阻斷劑G966210.0l/L預(yù)孵育30in后，NhR作用H

8、L-60細(xì)胞24h,創(chuàng)造G9662能有用拮抗NhR的上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN卵白表達(dá)作用見圖3。圖2esternblt闡發(fā)NhR1.0對HL-60細(xì)胞PTEN、p-Akt卵白表達(dá)的影響略圖3PPAR特異性阻斷劑G9662對NhR調(diào)控HL-60細(xì)胞PTEN卵白表達(dá)的影響略3討論細(xì)胞凋亡Apptsis是指在特按時空產(chǎn)生的、受機(jī)體精細(xì)調(diào)控的細(xì)胞“自盡征象，與細(xì)胞惡性增殖和分化受阻一樣，細(xì)胞凋亡非常在大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)病學(xué)上占據(jù)緊張的職位，而按捺增殖和誘導(dǎo)凋亡大概是差異作用機(jī)理的化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的配合通路。本實行證明NhR以濃度依靠方法按捺HL-60細(xì)胞增殖，其作用效價強(qiáng)度是先導(dǎo)化合物hR的5

9、.3倍。PI染色流式細(xì)胞術(shù)F闡發(fā)創(chuàng)造，NhR1.0l/L作用48h的HL-60細(xì)胞凋亡率達(dá)23.16%，而雷同濃度hR的凋亡率僅為5.8%，陽性比擬藥物ATRA誘導(dǎo)的凋亡率是9.75%。提示：NhR對HL-60細(xì)胞具有按捺增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，且作用效價高于hR。PTEN是近期創(chuàng)造的一種新型腫瘤按捺基因，現(xiàn)已證明PTEN基因是第1個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，不但到場細(xì)胞周期的調(diào)控，并且調(diào)治細(xì)胞的正常生長和發(fā)育，終極促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PTEN可以特異性地按捺磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)依靠的卵白激酶B(PKB或Akt)的激活，而PI3K催化細(xì)胞膜上的(磷酸)肌醇磷酸化產(chǎn)生PIP2與PIP3，

10、PIP3激活卑劣的Akt。PTEN可以去磷酸化PIP3，拮抗PI3K的活性，低落細(xì)胞內(nèi)PIP3的濃度，從而按捺Akt的激活?；罨腁kt是促進(jìn)細(xì)胞存活因子,能低落凋亡促進(jìn)因子活性和增長抗凋亡卵白的活性5，Akt可以或許磷酸化Bad，后者開釋被其按捺的抗凋亡卵白Bl-xL，磷酸化的Bad還通過阻斷細(xì)胞色素的開釋到場抗凋亡；Akt通過磷酸化按捺aspase-9的活性按捺凋亡。過氧化物酶體增殖體激活受體PPAR是一個核受體轉(zhuǎn)錄因子,可以或許上調(diào)PTEN的表達(dá)；而PPAR拮抗劑G9662可以或許按捺PPAR配體的這種作用6。多種惡性腫瘤存在PTEN基因的突變或缺失，導(dǎo)致PI3K/Akt信號通路活性增高

11、，Kandasay等7在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PTEN可下調(diào)Akt程度，低落其對TRAIL凋亡途徑的對抗性。因此，想法上調(diào)PIEN，按捺P-Akt表達(dá)，不失為抗腫瘤的一種途徑。本實行用esternblt闡發(fā)創(chuàng)造，NhR以時間依靠方法上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN卵白表達(dá)和按捺P-Akt卵白表達(dá)。NhR的上調(diào)HL-60細(xì)胞PTEN卵白表達(dá)作用可被PPAR特異性阻斷劑G9662(10l/L)預(yù)孵育拮抗。說明NhR大概通過活化PPAR，上調(diào)PTEN卵白表達(dá)，按捺Akt卵白磷酸化，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1ZhengX,engD,XuYY,etal.SynthesisandAntianereffetf

12、hrysinderivativesJ.BirgdeheLett,2022.ar10;13(5):881.2SngDH,DinguezI,izunJ,etal.K2phsphrylatinftheAradillRepeatreginf-ateninPtetiatesntsignalingJ.JBilhe.2022,278(26):24018.3KanariY,KigaaJ,ItahiH,etal.rrelatinbeteenlssfPTENexpressinandAktphsphrylatininendetrialarinaJ.linanerRes,2001,7(4):892.4ZhengX,engD,XuYY,etal.SynthesisandAntianereffetfhrysinderivativesJ.BirgdeheLett,2022.ar10;13(5):881.5ayLD,etal.ThePTEN,d2,p53tursuppressr-n-prtEinnetrkJ.TrendsBiheSi,2002,27(9):462.6FarrB,etal.AtivatinfPPARgaainreasesPTENexpressininpanreatianerellsJ.BiheBiphysResun