第四章植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉

1、 植物胚胎培養(yǎng)(piyng)指對植物胚、子房、胚珠、胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的培養(yǎng)方式。第四章 植物胚胎(piti)培養(yǎng)及離體授粉共四十三頁一、胚培養(yǎng)的意義（應(yīng)用）1. 促使發(fā)育不良和中途敗育的胚發(fā)育成熟（胚搶救） 高等植物的種間和屬間進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交時(shí)， 由胚乳發(fā)育不良使雜種胚的敗育。 可以建立胚胎培養(yǎng)， 在人工培養(yǎng)基上供應(yīng)與胚乳成分類似的外源營養(yǎng)，以保證胚的正常發(fā)育。2. 打破休眠期促使萌發(fā) 胚培養(yǎng)可以克服種子發(fā)育上的障礙和促進(jìn)(cjn)胚的生長， 提高發(fā)芽率、縮短育種周期或加速良種繁育。第一節(jié) 胚培養(yǎng)(piyng)共四十三頁3. 克服(kf)多胚品種珠心胚的干擾 仙人掌、柑橘等，

2、除正常有性胚外，還配以從珠心組織發(fā)生多個(gè)不定胚。 這些不定胚常常侵入胚囊，使合子胚發(fā)育受阻，影響了育種效率。4. 快速繁殖良種砧木 可以產(chǎn)生大量的次生胚，加速良種砧木的繁殖； 而且胚胎發(fā)生技術(shù)是人工種子的重要基礎(chǔ)。5. 誘導(dǎo)胚性愈傷組織 利用幼胚或胚軸，珠心組織等外植體，培養(yǎng)產(chǎn)生胚性愈傷組織， 為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體分離、融合，或遺傳轉(zhuǎn)化提供很好的材料。共四十三頁 6. 種子生活力的測定 測定休眠的種子生活力，應(yīng)用一般的萌發(fā)試驗(yàn)需時(shí)間很長， 要預(yù)先進(jìn)行后熟處理(chl)。 離體培養(yǎng)時(shí)間短。 7. 稀有植物的繁殖 芭碧蕉是商品香蕉的一個(gè)野生親緣物種，其種子在自然條件下不能萌發(fā)， 然而通過離體胚

3、的培養(yǎng)很容易產(chǎn)生幼苗。作為一種異?，F(xiàn)象，有些椰子不能產(chǎn)生液體胚乳，而是一種肥厚的組織。 由于十分罕見，價(jià)格非常昂貴，在菲律賓只有盛大宴會才供應(yīng)這種果實(shí)， 這種椰子的種子也只能通過離體培養(yǎng)才能萌發(fā)。共四十三頁此外，通過胚胎培養(yǎng)，探討胚胎發(fā)育(fy)的機(jī)制、開展人工受精、以及胚與胚乳的相互關(guān)系等基礎(chǔ)研究。杜鵑(djun)種子共四十三頁1. 材料的消毒與接種 種子95%酒精(jijng)消毒選取完好種子70%酒精浸數(shù)S 0.1%升汞或10%次氯酸鈉浸泡無菌水沖洗 種子培養(yǎng)幾天剝離種胚接種在培養(yǎng)基上。2. 培養(yǎng)基 成熟胚是含有根原基和莖原基以及1個(gè)或2個(gè)次生附屬子葉， 培養(yǎng)時(shí)進(jìn)一步發(fā)育產(chǎn)生根和莖， 此

4、時(shí)在營養(yǎng)上相對獨(dú)立，只需要提供簡單的營養(yǎng)條件， 在含有大量元素的無機(jī)鹽和糖的培養(yǎng)基上即能生長。二、成熟(chngsh)胚的培養(yǎng)共四十三頁3. 種胚培養(yǎng)的外界條件 光照：黑暗。 溫度：25溫度較適， 但有些材料的生長需要較高的溫度， 如熱帶蘭花的雜交種胚的培養(yǎng)，適于30溫度； 具有休眠習(xí)性的植物種胚， 接種后先在4溫度下，培養(yǎng)一段時(shí)間，然后轉(zhuǎn)入正常(zhngchng)溫度培養(yǎng)。固體培養(yǎng)共四十三頁 原胚指未成熟的幼胚。 其離體培養(yǎng)技術(shù)難度較大， 越早期的胚，培養(yǎng)越困難(kn nn)。 其分離需在顯微鏡下進(jìn)行。 Hanning早在1904年就培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚， 發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育， 并且提

5、前萌發(fā)形成小苗， 這是世界上胚培養(yǎng)最早獲得成功的一例。三、原胚（幼胚）培養(yǎng)(piyng)共四十三頁幼胚則要求更復(fù)雜的培養(yǎng)基。除了一般的無機(jī)鹽成分外，還要加入微量元素和生長輔助物質(zhì)，不同發(fā)育時(shí)期的幼胚對培養(yǎng)基成分要求不同，胚齡越小培養(yǎng)及成份(chng fn)越復(fù)雜。 對培養(yǎng)基營養(yǎng)的要求，認(rèn)為無機(jī)氮是以硝酸鹽、亞硝酸鹽或銨鹽的形式供給， 硝酸鹽比銨鹽好。培養(yǎng)基的滲透壓對幼胚的發(fā)育有密切的關(guān)系。通常培養(yǎng)基的滲透壓用蔗糖調(diào)整，也可以用甘露醇，用量在812左右（甚至18），糖濃度過低還會引起胚早熟萌發(fā) 幼胚不同發(fā)育時(shí)期對培養(yǎng)基滲透壓要求不一。 液體培養(yǎng)1. 基本(jbn)培養(yǎng)基共四十三頁（1）生長調(diào)節(jié)劑

6、 生長素與細(xì)胞分裂素合理搭配，才能控制胚性生長，促使胚發(fā)育成熟。 添加生長調(diào)節(jié)劑不當(dāng)，可能改變胚胎發(fā)育的方向， 轉(zhuǎn)向脫分化而形成愈傷組織， 或引發(fā)早熟萌發(fā)。（2）其他物質(zhì) 氨基酸：谷氨酰胺等； 維生素：必需。硫胺素、煙酸、泛酸等； 附加物：椰乳、香蕉(xingjio)、酵母提取物等天然有機(jī)物或活性炭。2. 生長(shngzhng)調(diào)節(jié)劑及其他附加物的影響共四十三頁 多培養(yǎng)基培養(yǎng)：外環(huán)，較簡單的培養(yǎng)基； 中央，較復(fù)雜(fz)的培養(yǎng)基 - 接種幼胚。 （異養(yǎng)自養(yǎng)） 胚乳看護(hù)培養(yǎng)：培養(yǎng)基周圍放置同種或異種胚乳。胚柄的作用位于胚根一端，對幼胚的存活是關(guān)鍵，顯著刺激胚的進(jìn)一步發(fā)育。3.培養(yǎng)(piyng)

7、方法共四十三頁4. 培養(yǎng)(piyng)過程幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù) 取材時(shí)期 幼胚剝離 培養(yǎng)條件的控制 （是否需要特殊處理） 成熟或未成熟子房70%酒精浸數(shù)S0.1%升汞或飽和漂白粉浸10-30min 無菌水沖洗剖出胚珠取出完整胚接種(jizhng)在培養(yǎng)基上。 一般采用液體培養(yǎng)法。 培養(yǎng)條件： 20-30，2000Lx，10-14hr共四十三頁1）按正常胚胎發(fā)育途徑形成植株（維持胚性生長）2）胚胎脫分化形成愈傷組織 多數(shù)植物幼胚形成愈傷組織，再分化成胚狀體或形成芽苗。3）胚“早熟萌發(fā)” 幼胚不再發(fā)育，迅速(xn s)萌發(fā)成幼苗。 多數(shù)情況1個(gè)幼胚萌發(fā)成1個(gè)植株； 有時(shí)因細(xì)胞分裂形成許多胚狀體，進(jìn)而

8、形成許多植株，即叢生胚現(xiàn)象。 “早熟萌發(fā)”產(chǎn)生畸形苗，或瘦弱發(fā)育不正常而死亡。 這種畸形苗加以利用分離培養(yǎng)變異體，作為育種材料.5. 幼胚培養(yǎng)的發(fā)育(fy)途徑共四十三頁胚乳培養(yǎng)的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例進(jìn)行了玉米胚乳培養(yǎng)。到目前為止，已有40多種植物的胚乳進(jìn)行了培養(yǎng)。其中蘋果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等近20種植物的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其它有的分化出芽、根、葉等或得到愈傷組織。 胚乳培養(yǎng)：將胚乳組織從母體上分離下來，通過離體培養(yǎng)， 使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。 裸子植物，胚乳是由雌配子體發(fā)育而成，是單倍體。 被子植物，

9、胚乳是雙受精的產(chǎn)物(chnw)，是三倍體，因此可以獲得無籽果實(shí)。第二節(jié) 胚乳(pi r)培養(yǎng)共四十三頁1.胚乳外植體的制備1）胚乳較大塊組織的種子，如大戟科和檀香科的植物， 可直接將種子表面滅菌，無菌條件下除去種皮即可培養(yǎng)。 2）帶果實(shí)的種子（斛寄生類）， 取授粉幾天后的幼果，表面滅菌后，無菌條件下切開幼果， 取出種子，小心分離(fnl)出胚乳，接種在培養(yǎng)基上。 一、胚乳培養(yǎng)(piyng)方法共四十三頁（1）愈傷組織誘導(dǎo) 除少數(shù)寄生或半寄生植物可直接從胚乳(pi r)中分化出器官， 大部分被子植物的胚乳，無論是未成熟的或成熟的， 都需要經(jīng)歷愈傷組織階段，才能分化植株。 胚乳接種后的6-10天后

10、，不斷增生成乳白色團(tuán)狀，成為愈傷組織。2. 胚乳愈傷組織誘導(dǎo)(yudo)及形態(tài)建成共四十三頁生長旺盛的愈傷組織應(yīng)及時(shí)(jsh)進(jìn)行分化培養(yǎng)，此時(shí)需光。胚乳愈傷組織誘導(dǎo)器官的形成也可通過器官發(fā)生和胚胎發(fā)生2種途徑來實(shí)現(xiàn)。 通過胚胎發(fā)生途徑獲得再生植株，最早的是柑橘。 通過胚胎發(fā)生途徑獲得再生植株的植物有檀香、橙、桃、棗、核桃和獼猴桃等。（2）形態(tài)(xngti)建成共四十三頁 （3） 3倍體后代(hudi)的特征1）形態(tài)特征 由于被子植物的胚乳是3倍體， 因此，通過胚乳培養(yǎng)可得到(d do)3倍體植株，產(chǎn)生無籽果實(shí)； 或由其加倍產(chǎn)生6倍體植株。 多倍體植株具有 粗壯、 葉片大而肥厚、葉色濃、 花大

11、或重瓣、 果實(shí)大但結(jié)實(shí)率低的特征。 這些變異性狀可直接利用或作為育種材料， 尤其在花卉和藥用植物新品種選育方面 往往有重要的利用價(jià)值。共四十三頁 胚乳愈傷組織及再生植株的染色體數(shù)常常發(fā)生變化。 如蘋果（2n=34）胚乳植株根尖細(xì)胞染色體數(shù)的分布范圍是 29-56條，多數(shù)是37-56條，3倍體細(xì)胞只占2%-3%。 同一植株是不同倍性細(xì)胞的嵌合體。 染色體倍性混亂在胚乳培養(yǎng)中是相當(dāng)普遍的。 但有些植株胚乳培養(yǎng)，如核桃(h tao)、檀香、橙和柚等， 其倍性表現(xiàn)出相對的穩(wěn)定性， 這些植物的胚乳細(xì)胞往往也能長期保持器官的分化能力。2）胚乳(pi r)再生植株的倍性共四十三頁胚乳植株染色體數(shù)目(shm)

12、的檢查 取胚乳培養(yǎng)植株根尖、幼葉或胚乳愈傷組織， 0.2-0.5%秋水仙素（或?qū)Χ缺斤柡腿芤海?5下處理4-8h， 流水沖洗， 卡洛氏液或FAA固定（福爾馬林-酒精-醋酸混合固定液）， 1mol鹽酸(yn sun)，60水浴下，水解10min， 染色（1%醋酸洋紅，3-5min）、 壓片（加1滴45%醋酸）、 觀察。 共四十三頁胚乳的類型(lixng)、胚乳愈傷組織發(fā)生的部位、培養(yǎng)基中外源激素的種類和水平。如獼猴桃來源于同一植株的胚乳，可以培養(yǎng)出三倍體和二倍體兩種倍性的植株。ZT 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L，愈傷組織再生2倍體植株；ZT 3.0mg/L+2,4-D 1mg/L，愈

13、傷組織再生3倍體植株；影響(yngxing)胚乳培養(yǎng)細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的因素共四十三頁1.培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件（1）培養(yǎng)基 在胚乳培養(yǎng)中，常用的基本培養(yǎng)基有White、LS、MS、MT等， 其中以MS使用最多。 生長調(diào)節(jié)劑：2,4-D、玉米素等； 天然提取物：20%番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰乳、水解酪蛋白、 酵母提取物 促進(jìn)(cjn)胚乳培養(yǎng)； 蔗糖：小麥8%，枸杞5%。（2）培養(yǎng)條件 ph4.5-6.5；光照10-12h；溫度24-26。二、影響(yngxing)胚乳培養(yǎng)的因素共四十三頁胚乳培養(yǎng)中，通常有帶胚培養(yǎng)和不帶胚培養(yǎng)兩種方式。帶胚培養(yǎng)胚乳比不帶胚的胚乳組織容易形成愈傷組織。當(dāng)愈傷組織形成后

14、，除去胚并不影響(yngxing)胚乳組織的增殖。2. 胚在胚乳(pi r)培養(yǎng)中的作用共四十三頁 被子植物胚乳的發(fā)生方式分為 核型（精核與極核受精后，只以核的分裂方式增殖）、 細(xì)胞(xbo)型（精核與極核受精后，以細(xì)胞分裂方式增殖）、 有的精核與極核受精后，有核分裂和細(xì)胞分裂兩種方式混生增殖。 不論胚乳屬于核型或細(xì)胞型， 處于發(fā)育早期的胚乳，其愈傷組織誘導(dǎo)率較低。 旺盛生長期是取材的最佳時(shí)期。 幾種植物胚乳培養(yǎng)的最佳時(shí)間（授粉后天數(shù)） 大麥1012天；黃瓜716天；小黑麥 714天。3. 胚乳發(fā)育(fy)類型和發(fā)育(fy)程度共四十三頁培養(yǎng)胚乳的首要目的(md)是為了直接獲得三倍體植株。三倍

15、體六倍體生產(chǎn)；倍性多樣性篩選非整倍體植株；雜種胚乳附加系和代換系遺傳育種。 自1965年以來，許多植物通過胚乳培養(yǎng)獲得了3倍體幼苗和植株。 但被子植物中，培養(yǎng)的胚乳細(xì)胞以及得到的胚乳植株， 并不都是三倍體。三、 胚乳培養(yǎng)(piyng)的應(yīng)用附加系：正常染色體組添加了1或多條親緣種染色體的品系。代換系：正常染色體被異源種屬的1條或1對染色體代換后所形成的品系。 共四十三頁一、胚珠培養(yǎng)胚珠是種子植物的大孢子囊，是孕育(yny)雌配子體的場所，也是種子形成的前身。 分為受精胚珠和未受精胚珠。將胚珠從母株中分離出來，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長發(fā)育，以致形成幼苗的過程。第三節(jié) 胚珠(pi

16、zh)和子房培養(yǎng)共四十三頁（1）材料的選擇和滅菌 培養(yǎng)受精胚珠，摘取(zhi q)授粉時(shí)間合適的子房， 如培養(yǎng)未受精胚珠，則在授粉前摘取子房。 子房表面滅菌 剖開子房壁，取出胚珠或帶胚珠的胎座接種。（2）培養(yǎng)基對胚珠培養(yǎng)的影響 培養(yǎng)基多為White、Nitsch、MS等， Nitsch使用更普遍。1. 培養(yǎng)(piyng)方法共四十三頁（3）胎座和子房對胚珠培養(yǎng)的影響 帶有胎座和子房 對胚珠早期發(fā)育起重要作用。（4）胚發(fā)育時(shí)期(shq)的影響 合子和原胚期的胚珠較難剝?nèi)『团囵B(yǎng)， 對培養(yǎng)基的成分要求嚴(yán)格。原胚期：合子不均等橫向分裂形成頂細(xì)胞和基細(xì)胞， 分別進(jìn)行縱向和橫向分裂，形成4個(gè)細(xì)胞的原胚。共

17、四十三頁2. 培養(yǎng)條件(tiojin) 固體培養(yǎng)基 室溫26， 50-60%相對濕度， 光照18hr。3. 受精胚珠的發(fā)育 胚珠種子 胚珠愈傷組織共四十三頁將子房從母株上摘下，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長發(fā)育，以至形成幼苗的過程。子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座和胚珠(pi zh)組成。根據(jù)培養(yǎng)的子房是否授粉分為 授粉子房、 未授粉子房。二、子房(zfng)培養(yǎng)共四十三頁1. 子房的獲取 未授粉子房在開花前1-5天摘取子房， 授粉子房在授粉后摘取子房。 滅菌 禾谷類幼穗表面用70%酒精擦拭即可， 雙子葉花蕾漂白粉液滅菌， 其他植株暴露的子房須嚴(yán)格消毒(xio d)，無菌濾紙

18、吸干。 撥開幼花，子房接種到培養(yǎng)基上。（一）子房(zfng)培養(yǎng)的過程共四十三頁固體和液體培養(yǎng)基均可，26，50-60%相對濕度(xingdu shd)，光照16h。 N6、MS、BN培養(yǎng)基。2.子房(zfng)的培養(yǎng)共四十三頁（二）培養(yǎng)(piyng)子房的發(fā)育 子房性細(xì)胞(xbo)愈傷組織或胚狀體單倍體植株 子房體細(xì)胞愈傷組織或胚狀體二倍體植株 共四十三頁1. 胚珠 受精(shu jng)胚珠培養(yǎng)目的打破種子的休眠； 挽救胚的發(fā)育以獲得雜交種。 未受精胚珠培養(yǎng)目的獲得單倍體細(xì)胞發(fā)育而來的植株。2. 子房 授粉子房培養(yǎng)目的挽救子房內(nèi)雜種胚的發(fā)育。 未授粉子房培養(yǎng)目的獲得單倍體植株； 試管受精解

19、決雜交育種中不親和問題。三、胚珠和子房培養(yǎng)(piyng)的應(yīng)用共四十三頁遠(yuǎn)緣(yun yun)雜交中, 受精前的障礙如花粉在柱頭上不能萌發(fā)；花粉管生長受抑制而不能進(jìn)入胚珠，其原因是花柱太長或花粉管生長緩慢。 受精后的障礙胚和胚乳之間的不親和,或胚乳發(fā)育不良，雜種發(fā)育不成熟。第四節(jié) 植物(zhw)離體授粉 （pollination in vitro）共四十三頁 離體授粉 將未授粉的胚珠(pi zh)或子房從母體上分離下來，進(jìn)行無菌培養(yǎng)， 并以一定的方式授以無菌花粉，使之在試管內(nèi)實(shí)現(xiàn)受精的技術(shù)， 所以又稱離體受精（fertilization in vitro）。共四十三頁1. 離體柱頭(zhtu)

20、授粉 指通過雌蕊的離體培養(yǎng)，使無菌花粉授于柱頭上， 得到含有可育的種子和果實(shí)的技術(shù)。 是一種接近于自然授粉的試管授精技術(shù)。2. 離體子房授粉 通過人工方法將花粉直接引入子房， 使花粉粒在子房腔內(nèi)萌發(fā)，并進(jìn)行正常受精， 最后獲得具有生活力的種子，又稱為子房內(nèi)授粉。一、離體授粉(shufn)的類型 3共四十三頁 是指離體培養(yǎng)未受精的胚珠，并在胚珠上授粉， 最終在試管內(nèi)結(jié)出正常種子(zhng zi)的技術(shù)。 離體胚珠授粉既可以將胎座上切下的單個(gè)胚珠（裸露的胚珠）接種在培養(yǎng)基上，然后撒播花粉與胚珠表面，實(shí)現(xiàn)受精； 也可以將帶有完整胎座或部分胎座的胚珠接種在培養(yǎng)基上，并撒播 花粉進(jìn)行受精。3. 離體胚珠(pi zh)授粉共四十三頁1.試驗(yàn)材料的選擇 在進(jìn)行(jnxng)離體授粉實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好選用子房較大并有多個(gè)胚珠的植物， 由于胚珠數(shù)量大，在分離過程中會有許多胚珠完好無損， 授粉后容易進(jìn)一步發(fā)育。二、離體授粉(shufn)的方法共四十三頁（1）確定開花、花藥開裂、授粉、花粉管進(jìn)入胚珠和授精的時(shí)間；（2）去雄后將花蕾套袋隔離；（3）制備無菌子房或胚珠；（4）制備無菌花粉；（5）胚珠（或子房）的試管授粉。 離體授粉成功的標(biāo)志是 授粉后能由胚珠或子房形成有生活(shnghu)