第三章血液分析儀檢查

1、第三章血液分析儀檢查目的要求 1、掌握：血液分析儀各項參數(shù)的縮寫、參考值、直方圖概念。2、熟悉：血液分析儀電臨床應(yīng)用、檢測參數(shù)、方法學(xué)平價、血細胞直方圖正常形態(tài)特點及常見異常形態(tài)、臨床應(yīng)用。3、了解：血液分析儀的進展。重點 : 1、血液分析儀測定的原理、方法 2、血液分析儀各參數(shù)臨床意義難點: 血液分析儀檢驗的質(zhì)控1 血液分析儀的發(fā)展史 自動血液分析儀（automated hematology analyzer, AHA)，早年稱血細胞計數(shù)儀（blood cell counter)，是目前國內(nèi)外臨床檢驗最常用的篩檢儀器之一。1、傳統(tǒng)采用手工方法 2、20世紀50年代，美國的Coulter設(shè)計了

2、第一臺電子血細胞計數(shù)儀。還產(chǎn)生了血紅蛋白儀。3、20世紀70年代 檢測血小板的儀器Baker-8104、20世紀80年代，可打印WBC、RBC、PLT體積分布直方圖。5、20世紀90年代，白細胞分類的開發(fā)（二分類、三分類）；將網(wǎng)織紅細胞檢測技術(shù)用于血細胞分析儀；生產(chǎn)了血液學(xué)全自動系統(tǒng)。6、現(xiàn)在，白細胞五分類，儀器組合化血細胞分析儀近年來的發(fā)展變化1. 血常規(guī)檢驗多參數(shù)化2. 多功能合成擴展3. 檢測速度的提高4. 方法的改進和進展5. 應(yīng)用的方便性 血液分析儀功能：全血細胞計數(shù)功能。 白細胞分類功能。擴展功能。血液分析儀優(yōu)勢檢測項目多速度快精度高易操作2 檢測原理 檢測原理電學(xué)光學(xué)電阻抗法 射

3、頻電導(dǎo)法激光散射法分光光度法一、電阻抗法 血細胞計數(shù)原理即庫爾特原理（Coulter principle):根據(jù)血細胞非傳導(dǎo)的性質(zhì)，以電解質(zhì)溶液中懸浮的血細胞在通過計數(shù)小孔時引起的電阻變化進行檢測為基礎(chǔ)，進行血細胞計數(shù)和體積測定。小孔管是電阻抗法細胞計數(shù)的一個重要組成部分。檢測期間，當電流接通后，位于小孔兩側(cè)的電極產(chǎn)生穩(wěn)定的電流。如果供給的阻抗也是穩(wěn)定的，則小孔的電壓是不變的。當有一個細胞通過小孔時，由于電阻增加，于瞬間引起電壓變化通過脈沖。細胞體積越大，脈沖振幅越高；細胞數(shù)量越多，脈沖數(shù)量也越多。脈沖信號經(jīng)過下列步驟，得出細胞計數(shù)結(jié)果：放大 由于血細胞通過微孔時產(chǎn)生的脈沖信號微弱，必須通過放

4、大器將訊號放大。2. 閾值調(diào)節(jié) 在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)參考電平的大小，使計數(shù)結(jié)果盡可能符合實際。3. 甄別 利用甄別器根據(jù)閾值調(diào)節(jié)器提供的參考電平，將低于參考電平的假訊號（細胞碎片，雜質(zhì)微粒）去掉。4. 整形 通過整形器作用，將脈沖訊號波形修整成一致標準的平頂波，才能觸發(fā)電路5 計數(shù) 血細胞的脈沖信號，經(jīng)過放大、甄別、整形后，送入計數(shù)系統(tǒng)，得出計數(shù)結(jié)果。 電阻抗法可準確測量出細胞（或類似顆粒）的大小，是三分群血液分析儀的主要應(yīng)用原理，并與光學(xué)檢測原理組合應(yīng)用于五分類血液分析儀中。三分群血液分析儀基本組成 信號發(fā)生器各種微粒通過檢測小孔產(chǎn)生電阻抗脈沖信號的檢測源。放大器將血細胞微弱脈沖信號放大以觸發(fā)電

5、路系統(tǒng)。閾值調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)能區(qū)分不同群細胞合適的信號電平。甄別器去除非參考電平的各種假信號以提高計數(shù)的準確性。整形器將不一致的脈沖波形信號調(diào)整為標準的波形后觸發(fā)計數(shù)電路系統(tǒng)。計數(shù)系統(tǒng) 將整形后的血細胞脈沖信號顯示為不同類群的細胞數(shù)。二、激光散射法 激光散射法應(yīng)用了流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM) 檢測原理。流式細胞術(shù)檢測原理：細胞通過激光束被照射時，產(chǎn)生與細胞特征相應(yīng)的各種角度的散射光。對經(jīng)信號檢測器接收的散射光信息進行綜合分析，即可準確區(qū)分正常類型的細胞。半導(dǎo)體激光的流式細胞術(shù) 側(cè)向熒光（RNA/DNA含量） 激光（波長633nm） 側(cè)向散射（細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如核的大?。┣跋蛏?/p>

6、射光 （細胞大?。┑徒嵌壬⑸涔猓ㄇ跋蛏⑸涔猓悍从臣毎臄?shù)量和表面體積大小。高角度散射光（側(cè)向散射光）：反映細胞的內(nèi)部顆粒、細胞核等復(fù)雜性。激光散射法在區(qū)別體積相同而類型不同的細胞特征時，比電阻抗法分群更加準確。故激光散射法已成為現(xiàn)代五分類血液分析儀的主要檢測原理之一。流式細胞儀的技術(shù)特點 流式細胞儀在設(shè)計上采用了許多獨特的技術(shù)，比如液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、信號測量和細胞分選方面都有自己的技術(shù)特點。著重講述液流系統(tǒng)鞘流原理。雷諾系數(shù) ReRed /d: 管子的直徑 ：液體的密度：液體的流速 ：液體的粘滯系數(shù)Re2300， 液流處于湍流狀態(tài)通常把標本流的流速控制在10m/s以內(nèi)，就能保持標本流處于穩(wěn)

7、流狀態(tài)。外面包被有高速流動的鞘液，實現(xiàn)標本與鞘液穩(wěn)定的同軸流動狀態(tài)。同時利用液流聚焦原理，使標本流直徑變小，通常只有1020m，避免細胞多個重疊進入檢測區(qū)。激光散射法系統(tǒng)基本組成1、光源氣體（氦氖）激光或固體（半導(dǎo)體）激光（單色光）；鎢光源（多色光）。2、鞘流維持顆粒于液流中央，順序、單個、恒速向前流動，即流體動力學(xué)聚焦。3、細胞懸液被檢測細胞（顆粒）的懸液，由氣壓導(dǎo)入流動池。4、光檢測器接受來自各種角度的散射光或吸收光信號，并轉(zhuǎn)換成相應(yīng)特征的電信號三、射頻電導(dǎo)法 射頻（radio frequency, RF) 指射頻電流，是每秒變化大于10 000次的高頻交流電磁波。高頻電流能通過細胞壁。

8、用高頻電磁探針滲入細胞膜脂質(zhì)可測定細胞的導(dǎo)電性，提供細胞內(nèi)部化學(xué)成分、細胞核和細胞質(zhì)、顆粒成分等特征信息。四、分光光度法Lambert-Beer定律：A=lg(I0 / I)A:吸光度，或稱光密度；I0：單色入射光強度； I ：透過光強度分光光度法儀器的組成：單色光源、檢測池和比色容器、光檢測器。分光光度法是所有類型的血細胞分析儀檢測Hb 的原理：被稀釋的血液加入溶血劑后，紅細胞溶解，釋放血紅蛋白，后者與溶血劑結(jié)合形成Hb衍生物，在特定波長（530550nm）下比色，吸光度的變化與液體中Hb含量成比例。血紅蛋白血紅蛋白衍生物吸光度Hb濃度溶血劑540nm血紅蛋白測定的溶血劑溶血劑含氰化物的溶血

9、劑不含氰化物的溶血劑3 血液分析儀檢測參數(shù)原理 不同類型血液分析儀檢測參數(shù)的原理不盡相同。高檔儀器應(yīng)用2種或2種以上檢測原理，組合電學(xué)、光學(xué)、細胞化學(xué)等技術(shù)，在獨特檢測通道測定紅細胞、血小板和白細胞系列的數(shù)量、亞類及相關(guān)參數(shù)。一、白細胞系列參數(shù)檢測原理儀器將體積為35450fL的血細胞，分為256個通道（channel）。每個通道：1.64fl。根據(jù)細胞大小，分別置于不同的通道中，顯示血細胞體積分布直方圖(Histogram)。（一）電阻抗法經(jīng)溶血素處理脫水后，血細胞體積大小發(fā)生了變化！第一群（3590fl）小細胞區(qū)：淋巴細胞（體積最?。?。第二群（90160fl）單個核細胞區(qū)，（中間細胞）：單

10、核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、原始、幼稚細胞、異常細胞等。第三群（160fl以上）大細胞區(qū)：嗜中性粒細胞（體積最大）。三分群血液分析儀正常白細胞分類模式圖（直方圖） 35 90 160 300 400 450(fl)%（二）光散射法白細胞分類體積、電導(dǎo)和光散射法（volume, conductivity, light scatter, VCS) V C S電阻抗技術(shù)細胞大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)細胞內(nèi)的顆粒性、核分葉性和細胞表面結(jié)構(gòu) 體積 電導(dǎo) 光散射2、電阻抗與射頻法（能透入細胞內(nèi)，測量核的大小及顆粒的多少）。RF:射頻電流 細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息DC:直流電 細胞大小的信息 （1）嗜酸性粒細胞檢測系統(tǒng)

11、 專用的E溶血劑，電阻抗法（2）嗜堿性粒細胞檢測系統(tǒng) 專用的B溶血劑，電阻抗法（3）淋巴、單核和粒細胞檢測系統(tǒng) 電阻抗和射頻聯(lián)合檢測（4）幼稚細胞檢測系統(tǒng) 電阻抗法成熟幼稚成熟幼稚膜上脂質(zhì)少膜上脂質(zhì)多加入溶血劑結(jié)合AA多結(jié)合AA少加入硫化AA幼稚保持完整細胞破壞3、多角度偏振光散射法（MAPSS)（1）白細胞計數(shù) 用含DNA染料碘化丙啶試劑可破壞有核紅細胞膜和細胞質(zhì)，只留下細胞核，裸核易于染色。染料對有活性的白細胞只有極小滲透性或無滲透性，故不出現(xiàn)細胞核染色。從而鑒別有核紅細胞和活性白細胞，計算活性白細胞比率。（2）白細胞分群 MAPSS0,前向散射光：細胞大小、數(shù)量7，側(cè)向散射光：細胞內(nèi)部結(jié)

12、構(gòu)及核染色質(zhì)的復(fù)雜性90，垂直角度散射光：細胞內(nèi)部顆粒及分葉狀況90D，垂直角度去偏振散射 光，鑒別E與N MAPSS法可鑒別白細胞亞群、異常細胞類型，白細胞分類不受有核紅細胞、血小板凝聚、未溶解紅細胞和細胞碎片等干擾物質(zhì)影響。 運用這類原理的血細胞分析儀：SF-3000、CD-3500 、MEK-8118K 、Diana-5和EXCELLTM-22等。4、激光與細胞化學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用（1）過氧化物酶（Peroxidase, Perox)染色通道 過氧化物酶活性強度：ENM, L和B則無。（2）嗜堿性粒細胞/核分葉性（baso/ lobul- arity)通道: 除B外其他細胞僅剩裸核，不同細胞

13、的裸核結(jié)構(gòu)不同，分葉越多散點越靠近橫軸右側(cè)，根據(jù)多分葉核和單個核的比例，可計算出左移指數(shù)。（3）未染色大細胞計數(shù)檢測5. 雙鞘流動力連續(xù)系統(tǒng) (DHSS) 用鎢光源流式細胞光吸收、化學(xué)染色和電阻抗法 WBC計數(shù)通道：電阻抗法 嗜堿性粒細胞通道：專用染液 WBC分類通道：雙鞘流系統(tǒng)中，用流式細胞光吸收、電阻抗和細胞化學(xué)染色液聯(lián)合檢測除B以外的WBC。 DHSS技術(shù)：在流式通道中有2個鞘流裝置，細胞經(jīng)第1束鞘流后通過阻抗微孔測定細胞的真實體積，然后經(jīng)第2束鞘流后到達光窗，測定細胞的光吸收，分析細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。二、成熟紅細胞系列參數(shù)檢測原理1、紅細胞數(shù)和紅細胞比積：原理通WBC計數(shù)紅細胞體積分布直方圖

14、（一）電阻抗法2 、血紅蛋白含量測定 分光光度法3、 各項紅細胞平均指數(shù)檢測 根據(jù)RBC、 HCT 和HGB換算出來。4 、紅細胞體積分布寬度（ RDW ） 不同大小的脈沖信號分別貯存在儀器內(nèi)裝計算機的不同通道，計算出相應(yīng)的體積及細胞數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計處理得到RDW。（二）流式細胞術(shù)光散射法1、光散射法紅細胞、血紅蛋白檢測原理 低角度(23)：測量紅細胞體積。 高角度(515)：測定紅細胞血紅蛋白濃度。2、紅細胞散點圖 是紅細胞體積與血紅蛋白濃度二維散點圖，反映光散射與細胞體積和血紅蛋白濃度之間的相互關(guān)系，能準確區(qū)分小紅細胞等異常。線性體積/血紅蛋白濃度（V/HC)散點圖分為9個區(qū)。三、血小板系列參數(shù)

15、檢測原理（一）電阻抗法血小板計數(shù)（platelet, PLT）：隨紅細胞在一個系統(tǒng)中進行檢測。直方圖在228fl（不同儀器不一）。% 10 20 30(fl)（二）激光散射法根據(jù)Mie同質(zhì)性球體光散射理論，球形化PLT通過激光照射區(qū)時，在高角度得到PLT折射指數(shù)（refactive index, RI)，與PLT密度有關(guān)（PLT:1.351.40, RBC:含有高濃度Hb，RI為1.351.44）；低角度得到血小板大小。此法可區(qū)分PLT和紅細胞。（三）流式細胞激光核酸熒光染色和電阻抗法 紅細胞/血小板計數(shù)通道電阻抗法結(jié)果異常時，轉(zhuǎn)換至光學(xué)法核酸熒光染色網(wǎng)織紅細胞/血小板檢測通道。通過核酸熒光染

16、色鑒別網(wǎng)織Plt、成熟Plt和成熟RBC.（四）固體激光散射法、電阻抗法和單克隆抗體熒光染色散射法四、網(wǎng)織紅細胞系列參數(shù)檢測原理（一）非熒光染料染色法 用新亞甲藍對網(wǎng)織紅細胞RNA染色，采用VCS技術(shù)測定Ret。此外，應(yīng)用柔變輪廓分析技術(shù)，以非線性方式區(qū)分紅細胞群和成熟紅細胞群。 （二） 熒光染料染色法 （1）用聚次甲基染RNA和惡嗪染DNA法（2）用氧氮雜芑750染RNA法（3）用非對稱菁熒光染料染RNA法。（4）用噻唑橙染網(wǎng)織紅細胞RNA法。五、有核紅細胞系列參數(shù)檢測原理2.流式激光/熒光染色法 （1）聚次甲基熒光染色法 （2）碘化丙啶染色法 4. 阻抗法和噻唑橙熒光染色流式細胞術(shù)六、血細

17、胞分析儀工作流程（電阻抗法）4 血細胞分析儀的類型根據(jù)對白細胞分析程度分為二分群、三分群、五分類。根據(jù)自動化程度又分為二大類：半自動儀器須手工稀釋標本；全自動儀器可直接用抗凝血進樣。一、半自動二分群血細胞分析儀檢測速度為60個/h,儀器為雙通道，容易操作。用血量少，準確性、重復(fù)性好。測量結(jié)果超過正常界限和直方圖不正常，可出現(xiàn)警示符號提示。有質(zhì)控資料及標本檢測資料貯存、手工鑒別、設(shè)備警告等軟件程序。對儀器狀況可自動監(jiān)測。2. 檢測項目 可檢測815項參數(shù)及3個直方圖，主要有WBC, RBC, Hb，PLT, MCV, MCH, MCHC等，并打印出白細胞、紅細胞及血小板直方圖。圖1半自動分析儀

18、這是一個容易操作的系統(tǒng)。接通電源后，儀器處于正常的操作待機狀態(tài)時，只要把20l 血液樣品在機外稀釋，混勻后放在樣品架上，按下計數(shù)鍵它就可以對15種血液指標和3個細胞直方圖進行一次分析。測定完成后結(jié)果會立即在LCD上顯示并將結(jié)果打印出來。3. 半自動血細胞分析儀的測試程序1）機外手工加溶血劑方式 先將標本（末梢血或抗凝經(jīng)脈血）用稀釋液進行預(yù)稀釋（稀釋倍數(shù)因儀器型號而異),然后按儀器說明書要求將適量的溶血劑加入已稀釋的標本中混勻后上機進行檢測，打印或記錄測試結(jié)果。這類儀器如F-820、MEK-5108K。2） 機內(nèi)自動加溶血劑方式 先將標本（末梢血或抗凝經(jīng)脈血）用稀釋液進行預(yù)稀釋（稀釋倍數(shù)因儀器型

19、號而異),然后將已稀釋的標本混勻后（溶血劑由儀器自動定量注入） 上機進行檢測，打印或記錄測試結(jié)果。這類儀器如 AC-920(預(yù)稀釋通道）、BC-2000。二、全自動三分群血細胞分析儀檢測速度為6080個/h, 配上自動裝置可連續(xù)吸取樣本，避免實驗室內(nèi)感染。 兩種溶血素，即白細胞溶血素和紅細胞溶血素SLS-Hb法（無毒） 儀器線性范圍寬、重復(fù)性好、準確性高、變異范圍小。有的設(shè)有浮球式絕對定量裝置，攜帶污染率幾乎為零。自動化程度高，對試劑污染、氣泡干擾、異物阻塞有監(jiān)控系統(tǒng)。有自動報警系統(tǒng)。有質(zhì)控資料及標本檢測資料貯存等軟件程序。2. 檢測項目 除二分群的15項參數(shù)外，還增加了中等大小白細胞比率（W

20、-MCR)、中等大小白細胞計數(shù)（W-MCC)及大血小板比率（P-LCR)，達18項參數(shù)。3. 代表儀器：CD-1700 、Coulter ONYX血細胞分析儀等。三、全自動五分類血細胞分析儀速度快，每小時110150個標本。具有檢測有核紅細胞的功能。專用幼稚細胞檢測通道和試劑。多種分類技術(shù)的使用使白細胞分類更加精確，達到最低分類鏡檢率。強大的網(wǎng)絡(luò)功能及完善的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，可開展遠程診斷，遠程維護和質(zhì)控提供軟件支持。高效、自動的標本資料管理及強大的工作平臺。無錯進樣管理，包括穿刺進樣，條碼識別和雙重樣本完整性探測器。儀器可與網(wǎng)織紅檢測儀、自動進樣儀、自動涂片機相聯(lián)，形成自動化模塊。2. 檢測項目 可檢測25項參數(shù)或更多。有些儀器可根據(jù)需要選擇不同檢測模式。3. 代表儀器 SF-3000血細胞分析儀、MEK-811K+QA-810VK、EXCELTM22血細胞分析儀等。四、全自動五分類連接網(wǎng)織紅細胞分析儀準確性高，通過對細胞RNA檢測比目測法更準確、敏感。精確度達97