DB33_T 2246-2020豬流行性乙型腦炎病毒熒光定量RT－PCR檢測方法(高清正版）

1、ICS 65.020.20B 44DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 22462020豬流行性乙型腦炎病毒熒光定量RTPCR 檢測方法Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus2020 - 03 - 03 發(fā)布2020 - 04 - 03 實施浙江省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB33/T 22462020I前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009的規(guī)定編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜牧獸醫(yī)和飼料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省動物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：謝榮輝、張傳亮

2、、吳赟竑、徐輝、劉霞、周蕾、柴娟、虞一聰、王雅婷、周彩琴、趙靈燕、劉愛軍、吳雪軍。DB33/T 22462020 PAGE 3豬流行性乙型腦炎病毒熒光定量 RTPCR 檢測方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）熒光定量RTPCR檢測的實驗條件、操作步驟和結(jié)果判定等要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬流行性乙型腦炎病毒核酸的檢測。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1豬流行性乙型腦炎由豬流行性乙型腦炎病毒引起的一種急性傳染病。豬的主要臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、流產(chǎn)、死胎和公豬睪丸炎。實驗條件儀器高速冷凍離心機(jī)。熒光定量 PCR 儀。生物安全柜。

3、組織研磨儀。微量移液器。冰箱。渦旋混勻器。高壓滅菌器。試劑除特別說明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器分裝。Trizol：核糖核酸（Ribonucleic acid, RNA）提取試劑。氯仿：4 預(yù)冷。異丙醇：4 預(yù)冷。焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate ,DEPC）水：取 DEPC 100 L，加超純水至 100 mL，室溫過夜，121 高壓滅菌 15 min，分裝，凍存?zhèn)溆谩?5%乙醇：用 75 mL 無水乙醇，加 DEPC 水至 100 mL，混勻，20 預(yù)冷。商品化的一步法實時熒光 RT-PCR 反應(yīng)試劑：One Step Prime S

4、cript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 2One Step RT-PCR Buffer 、Ex Taq HS（5 U/ L）、PrimeScript RT Enzyme Mix 和無 RNA 酶的水。0.01mol/L PH7.4 磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline,PBS）：取 Na2HPO4.12H2O 2.9g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8g, 溶于 800 mL 去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，滴加濃鹽酸將 pH 調(diào)節(jié)至7.4，然后加去離子水定容至 1 L，高溫滅菌 30 min

5、，室溫保存。引物和探針，其序列如下：上游引物：5GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物：5 TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探針：5FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3。陽性對照：豬乙型腦炎活疫苗（SA14-14-2 株）。操作步驟樣品采集腦組織：選擇代表性病癥的病死豬，應(yīng)無菌采集腦組織，將采集到的腦組織裝入到無菌離心管中并編號，冷藏送檢或-20 以下保存?zhèn)溆?。全血：用無菌注射器耳靜脈采集豬血，將采集到的豬血裝入到無菌離心管中并編號，冷藏送檢。若不能及時送檢的全血，應(yīng)分離血清置于-20 以下保存?zhèn)溆?。樣品處理取待檢腦組織適

6、量裝入到無菌離心管中，按 1：10 體積加入 PBS，置于組織研磨儀中充分研磨。將研磨后的樣品，反復(fù)凍融 3 次，10000 r/min 離心 5 min，取上清液至無菌離心管中，編號待檢。取全血 3500 r/min 離心 5 min，取血清至無菌離心管中，編號待檢。RNA 提取按下列步驟完成 RNA 提取，也可采用商品化的病毒 RNA 提取試劑盒。取 n 個滅菌的 1.5mL 離心管，其中 n 為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，對每個離心管進(jìn)行編號。每管加入 750 L Trizol，分別加入被檢樣品、陽性對照和陰性對照各 250ul,震蕩數(shù)次，靜置5 min。再加入 200 L 預(yù)冷的

7、氯仿，震蕩混勻，靜置 5 min，于 4 C 12 000 r/min 離心 15 min。取與本標(biāo)準(zhǔn) 5.3.2 中相同數(shù)量的滅菌 1.5ml 離心管，并對每個離心管進(jìn)行編號。取本標(biāo)準(zhǔn) 5.3.3 中離心后的上清液（注意不吸出中間層）轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，加入等體積異丙醇，混勻，20 C 靜置30 min。于 4 C 12 000 r/min 離心 15 min，棄上清，緩緩加入 1 mL 75%乙醇，顛倒洗滌沉淀及管壁。于 4 C 12 000 r/min 離心 10 min，棄上清，室溫條件下干燥后，加入 30 L DEPC 處理水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，以 4 000 r/min

8、 離心 10 s,冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 應(yīng)在 2 h 內(nèi)進(jìn)行熒光 RT-PCR 擴(kuò)增，若需長期保存，需置于-70 C 冰箱保存。熒光定量 RTPCR 反應(yīng)反應(yīng)體系組成設(shè)立陽性對照、陰性對照，反應(yīng)體系（20L）由表1中物質(zhì)組成。表1 反應(yīng)體系配制表試劑用量L2One Step RT-PCR Buffer 10Ex Taq HS（5 U/L）0.4PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4上游引物 （10 mol/L）0.4下游引物 （10 mol/L）0.4探針 (10 mol/L)0.4樣品RNA4RNase Free dH2O4總量20反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄：42 15 min；預(yù)變性： 94 2 min；擴(kuò)增：94 10 s，60 40 s，45個循環(huán)，60 時設(shè)置采集熒光。熒光素的設(shè)定Report Dye 設(shè)定為FAM，Quencher Dye設(shè)定為none。結(jié)果判定結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽性對照的Ct值應(yīng)30并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，陰性對照無Ct值且無典型擴(kuò)增曲線，二者同