制備感受態(tài)細(xì)胞的原理和方法

1、制備感受態(tài)細(xì)胞的原理和方法1、感受態(tài)細(xì)胞的概念重組DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表 達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與 受體菌兩者在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān) 系。所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀 態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可以使感 受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作

2、用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70C保存（有效期6個(gè) 月）。二原理在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí) 驗(yàn)技術(shù)之一。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透 性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、 表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀?；瘜W(xué)制

3、備法：大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（CaCl2法），該法最先是由Cohen于1972年發(fā)現(xiàn)的。其原理是 細(xì)菌處于0C，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase 的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42C短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物， 在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到 表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到5x106-2x107轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA，可以滿足一般 的基因克隆試驗(yàn)。如在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價(jià)金屬離子（如Mn2+、Co

4、2+）、DMSO或 還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍?；瘜W(xué)法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細(xì)菌可以在-70C保存，因此被 廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化。物理制備法：電轉(zhuǎn)法（原理待續(xù)除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感 受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到109-1010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA。 因操作簡(jiǎn)便，愈來愈為人們所接受。）三感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素、細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度最好從-70C或-20 C甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次 轉(zhuǎn)接，及貯存在4C的培養(yǎng)菌液。細(xì)

5、胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5x107個(gè)左右為佳。 即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過測(cè)定培養(yǎng)液的OD600控制。對(duì)TG1菌株，OD600為 0. 5時(shí)，細(xì)胞密度在5x107個(gè)/ml左右。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。 此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變 株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比， 但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。一

6、般地，DNA溶液的體積 不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于30kb的重組質(zhì)粒 將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率 較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。、試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4C。、防止雜菌和雜DNA的污染整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓 滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均 會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。、整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。四具體步驟化學(xué)方法：（以大腸桿菌感受態(tài)制備為例）1）菌液分裝入ep管中（1.5ml） 6000rpm,5分鐘，沉淀菌體，棄上清液。2）加800ul預(yù)冷的CaCl2 （ 0.1mol/l）重新懸浮沉淀，6000rpm,5min,棄上清液。3）每管中加100ulCaCl2 （0.1mol/l含20%甘油）重新懸浮轉(zhuǎn)化取質(zhì)粒1-5ul加入制備好的感受態(tài)，輕輕搖勻，冰浴30-45min.42C熱激9