動(dòng)物模型制備

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)肝纖維化動(dòng)物模型制備原理及應(yīng)用肝纖維化動(dòng)物模型制備原理及應(yīng)用摘要肝纖維化是威脅人類健康的常見疾病，是各種慢性肝病最重要的病理基礎(chǔ)，也是原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險(xiǎn)因素之一。它是肝損傷后的修復(fù)反應(yīng)，涉及一系 列復(fù)雜的分子及細(xì)胞機(jī)制，如何制備與人類肝纖維化相似的動(dòng)物模型，不僅是深 入研究肝纖維化及肝硬化發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)。也是篩選防治藥物的有效手段。 本文重點(diǎn)討論制備大鼠纖維化動(dòng)物模型的不同研究方法及原理。并評述了 CCL4模 型的優(yōu)缺點(diǎn)與應(yīng)用范圍。不同造模方法制備的肝纖維化動(dòng)物模型各具特點(diǎn)，選擇 最為合適的動(dòng)物模型。關(guān)鍵詞:肝纖維化；肝硬化；動(dòng)物模型;優(yōu)缺點(diǎn)肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理過程

2、，是向肝硬化發(fā)展的中間階段。制 作和選擇肝纖維化動(dòng)物模型，是防治肝纖維化研究的基礎(chǔ)之一。肝纖維化研究是 當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)難點(diǎn)之一，該病涉及到諸多復(fù)雜的致病因素及細(xì)胞功能 和分子機(jī)制。研究表明，肝纖維化這個(gè)階段是可逆轉(zhuǎn)的，因此，阻斷肝纖維化 已成為目前肝病研究的熱點(diǎn)之一。然而建立一個(gè)能反映人肝纖維化的動(dòng)物模型一 直是科學(xué)研究中的難點(diǎn)，建立一個(gè)能反映人肝纖維化的動(dòng)物模型應(yīng)該考慮到許多 方面，構(gòu)建一種穩(wěn)定、可復(fù)制、便捷和仿真性強(qiáng)的肝硬化動(dòng)物模型是研究的必要 條件。近年來，肝纖維化動(dòng)物模型研究取得了可喜的進(jìn)展?，F(xiàn)將目前常用的造模 方法及其原理、特點(diǎn)與應(yīng)用范圍進(jìn)行歸納。綜述如下。以CC14為主誘導(dǎo)

3、的肝纖維化動(dòng)物模型。此法多用于研究肝纖維化發(fā)生機(jī)制、血清學(xué)標(biāo)志物與組織病理的相關(guān)性及抗 纖維化藥物的篩選。四氯化碳(cc14)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，可直接進(jìn)入肝細(xì)胞，經(jīng)線 粒體單加氧酶(P4502E1)系統(tǒng)代謝，代謝過程中產(chǎn)生三氯甲基和二氯甲基過氧化 物。這些自由基啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞及細(xì)胞器膜性結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，造成 肝細(xì)胞變性、壞死。長期給予cc14可造成肝纖維化、肝硬化。通過四氯化碳制備 肝纖維化模型的途徑有口服、腹腔注射、皮下注射。其形成肝纖維化的時(shí)間依據(jù) 大鼠種系、給藥途徑、用藥劑量的不同而有差別。1.1單因素誘導(dǎo)性肝硬化模型目前.單因素CC14誘導(dǎo)制備CM的主要途徑包括皮下注射、腹腔注

4、射和口服灌 胃等。通常多采用30%60 %CC1。油劑皮下注射的方法.劑量因動(dòng)物種類而不 同.一般小鼠為1 一3 m1/kg(體重)。大鼠為35 ml/kg，每周2次，通常1215 周即可成模。該方法雖操作簡便，但CC14。經(jīng)皮下注射很快即被機(jī)體吸收進(jìn)入循 環(huán)系統(tǒng)。腦、腎毒性較大。注射位置易發(fā)生浸潤性膿腫和潰瘍。死亡率可高達(dá)30% 40%。CCL4腹腔內(nèi)注射時(shí)，經(jīng)門靜脈系統(tǒng)吸收的濃度較皮下注射高，使肝硬化形 成時(shí)間短，而較少的毒副反應(yīng)使死亡率降至20%35%日。CCL4灌胃的吸收和代 謝途徑類似于腹腔注射.經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)，其刺激較少和生理模擬性更 佳，用中等劑量。CCL4制備小鼠CM時(shí)

5、.灌胃誘導(dǎo)的速度優(yōu)于腹腔注射.且二者在 生存曲線上并無特異差別。1215周后，可以觀察到大鼠一般狀況：大鼠隨著給藥時(shí)間延長活動(dòng)逐漸減 少，精神萎糜，毛發(fā)蓬亂無光澤，常鉆入墊；卷縮而臥，飲食量減少，全實(shí)驗(yàn)?zāi)r(shí)體重 較原體重均有所增長；肝臟病理變化：大鼠肝臟明顯腫大，肝包膜緊張，邊緣鈍， 黃棕色，質(zhì)硬。切面可見島狀結(jié)節(jié)。鏡下大鼠肝臟小葉間結(jié)締組織明顯增多，出 現(xiàn)由再生肝細(xì)胞形成的假小葉，其中有壞死細(xì)胞和氣球樣變細(xì)胞，中央靜脈壁和 匯管區(qū)的血管壁纖維有較明顯的增生。透射電鏡顯示，肝星形細(xì)胞內(nèi)的脂滴明顯 減少，細(xì)胞周圍大量膠原沉積，星形細(xì)胞周圍有膠原纖維形成。VON Gieson染色 顯示大量纖維間隔

6、形成，纖維間隔分割包繞肝組織形成假小葉。給藥30 d后，大 鼠肝臟出現(xiàn)少量纖維組織生;60 d時(shí)，所檢大鼠中，有部分呈現(xiàn)少量全中等纖維組 織增生;90 d時(shí)，所檢大鼠中會(huì)出現(xiàn)全部呈中等全大量纖維組織增生。上述提示肝 纖維化造模成功。單因素CC14誘導(dǎo)CM時(shí).機(jī)制明確、效果肯定、重復(fù)性佳、劑量可控性強(qiáng)，常 用于模擬暴發(fā)性肝功能衰竭、肝細(xì)胞脂肪樣變所致的肝硬化.然而較高的死亡率 和多器官毒副反應(yīng)限制了其在肝纖維化和慢性肝硬化病理發(fā)展機(jī)制研究中的應(yīng) 用。CC14法的優(yōu)點(diǎn)是：在病理生理學(xué)方面與人類肝纖維化和肝硬化的某些方面相 類似，如-二者均有肝細(xì)胞壞死后的再生，肝硬化晚期纖維的浸潤兒乎不可逆：肝 纖

7、維化病程進(jìn)展和病變特征穩(wěn)定，重復(fù)性好；具有造模簡便、費(fèi)用低廉、耗時(shí)短 的優(yōu)點(diǎn)。此方法可應(yīng)用于體內(nèi)研究肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞及分子機(jī)制、血清學(xué)標(biāo)志 物與組織病理的相關(guān)性以及抗纖維化藥物的篩選。缺點(diǎn)：對于相同的CC14處理， 肝纖維化的程度個(gè)體差異較大，而導(dǎo)致不一致的組織學(xué)利病理生理學(xué)表現(xiàn)。CC14 的肝毒性作用迅速而劇烈，若劑量掌握不當(dāng)，死亡率很高；停止給藥后，大鼠肝 纖維化有自然恢復(fù)的傾向。該模型的原始啟動(dòng)機(jī)制顯然是毒性化學(xué)物質(zhì)對肝臟的 損傷作用，比較適合藥物性肝炎方面的研究，但其能否準(zhǔn)確反應(yīng)病原微生物感染 人體后導(dǎo)致肝纖維化的機(jī)理尚待進(jìn)一步探討。1.2復(fù)合因素誘導(dǎo)性肝硬化模型。鑒于單因素制備的周

8、期長，成模比例低，有不少學(xué)者采用CC14復(fù)合因素致肝 纖維化模型，此種模型可靠且復(fù)制時(shí)間短，肝纖維化進(jìn)展穩(wěn)定，適合于以引起肝 細(xì)胞損傷為始動(dòng)機(jī)制的肝硬化發(fā)生發(fā)展過程的動(dòng)態(tài)研究。此外，此模型可以觀察 到動(dòng)物肝纖維化過程中糖、脂肪、蛋白質(zhì)、色素等方面的代謝障礙，以及迅速出 現(xiàn)的營養(yǎng)不良、脂肪變性、肝纖維等形態(tài)學(xué)改變。CC4+苯巴比妥聯(lián)合造模添加苯巴比妥可縮短造模時(shí)間，8一10周可形成肝硬 化，但死亡率高達(dá)40%。原理為苯巴比妥誘導(dǎo)肝內(nèi)混合功能氧化酶，增加細(xì)胞色 素P450活性，加速ccl4向CC13，轉(zhuǎn)化從而增加ccL4肝毒性。方法為分別給大鼠口 服CCL4,輔以苯巴比妥為唯一飲用水的方法建立肝纖

9、維化動(dòng)物模型，苯巴比妥的濃 度分別采用0. 05 mg/mL，其作用為誘導(dǎo)肝酶的活性，增加肝組織對ccL4的敏感 性。Krahenbuh 1制備模型時(shí),CC14首次用量為O. 05 mL / kg，以后每周2次，每次 用量以前次用量引起體重變化減少6%。9%為指標(biāo)來決定，第5周時(shí)用量為（220土 20）uL/只，第lO周為（22040）uL /只，其建模時(shí)間10周時(shí)，結(jié)果顯示肝臟表面 可見結(jié)節(jié)形成.實(shí)質(zhì)變致密，鏡檢可見在結(jié)節(jié)周圍有少量纖維組織沉積，同時(shí)伴 有脾大、慢性門脈高壓表現(xiàn)。添加乙醇能誘導(dǎo)P450活性從而增加ccl4的肝毒性， 在乙醇的致肝脂肪變作用下使用ccl4能加速肝細(xì)胞壞死，造模時(shí)

10、間明顯縮短，同 時(shí)可減小兩者劑量以降低藥物副反應(yīng)與動(dòng)物的不耐受現(xiàn)象。吳盂超報(bào)道在小鼠使 用該方法60d即可致成肝硬化.肝硬化穩(wěn)定，分期明顯，動(dòng)物死亡率低。CCl4+乙醇復(fù)合高脂肪飲食為主誘導(dǎo)的肝硬化模型:用高脂低蛋白食物，30% 酒精為唯一飲料，皮下注射CCL4,（第1次用5mL/kg，以后每隔3d皮下注射40%cCL4 油劑（3mL/kg），第6周末即可形成肝硬化。該方法簡單、成功率高（100%），且死 亡率低（20%）。肝硬化形成后飼料中加入2%的氯化鈉可制作肝硬化腹水模型。 ccL4，是復(fù)合因素中的決定因素，單純玉米面僅能供給所需蛋白質(zhì)的一半，并屬于 低膽堿飲食，飲酒可增加對膽堿的需求量

11、，均可促進(jìn)肝脂肪變性，使肝細(xì)胞對CCA 更敏感，這一模型目前已被廣泛采用，具有簡便易行、價(jià)廉及病變典型等優(yōu)點(diǎn)。該CM分期明確，在第l、2周以肝細(xì)胞變性壞死為主，第3、4周以彌漫性纖維增生 為其特征，第5、6周，纖維間隔、結(jié)節(jié)與假小葉形成。因其分期明顯，該模型有 助于研究外在因素對肝硬化進(jìn)程的干預(yù)作用。該方法用于小型動(dòng)物較多，大型動(dòng) 物的嘗試較少，與人肝炎肝硬化仍有差距。有助于研究外在因素對肝硬化進(jìn)程的 干預(yù)作用。該方法用于小型動(dòng)物較多，大型動(dòng)物的嘗試較少，與人肝炎肝硬化仍 有差距。二甲基亞硝胺（DMN）法DMN具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性。大鼠染毒后肝內(nèi)小葉炎性細(xì)胞浸潤， 出血性壞死。在肝內(nèi)

12、形成中心一中心纖維間隔或中心一門脈性纖維問隔。George 等給大鼠腹腔每周注射DMNA三次，處理3周，結(jié)果17d即可見中心肝小葉壞死及嗜 中性細(xì)胞浸潤，21d可見膠原纖維沉積、局部脂肪變、膽管增生、中央靜脈周圍纖 維沉積，此模型與人類肝硬化早期改變及膠原纖維沉積相似，可作為篩選抗纖維 化藥物的方便模型。王海燕等用SD大鼠按10 mg/kg的劑量，給予1%DMN生理鹽水 稀釋液，腹腔注射10次，模型組大鼠均形成肝纖維化或早期肝硬化。纖維化程度 在24期之間。該模型造模周期短，大鼠死亡率低，肝纖維化形成也相對穩(wěn)定。 在評價(jià)藥物對伴凝血障礙、纖溶亢進(jìn)的慢性肝病致纖維化的防治方面是一個(gè)比較 理想的模

13、型。缺點(diǎn)是小劑量不易形成肝纖維化，大劑量又容易形成肝細(xì)胞壞死后 纖維化，劑量不容易掌握。乙醇肝纖維化模型通常慢性酒精中毒可引起肝臟的4種序貫性損傷.即脂肪肝、酒精性肝炎、酒 精性肝纖維化和酒精性肝硬化。肝臟是乙醇代謝的主要場所，乙醇的中間代謝產(chǎn) 物乙醛是高度反應(yīng)活性分子，能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成乙醛一蛋白加和物，后者不但 對肝細(xì)胞有直接損傷作用，而且可以作為新抗原誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，導(dǎo)致 肝細(xì)胞受免疫反應(yīng)的攻擊。Tsul(amoto. French大鼠持續(xù)灌注法是較為通用的酒 精性肝病造模方法。酒精持續(xù)灌注的方法雖然先進(jìn)且避免了給動(dòng)物灌胃的麻煩， 但是國內(nèi)沒有生產(chǎn)胃灌注裝置，而國外的產(chǎn)品價(jià)格難以

14、接受，國內(nèi)多采用灌胃法。酒精引起肝纖維化的主要機(jī)制是酒精中間代謝產(chǎn)物乙醛 對肝臟產(chǎn)生直接損害，其在肝臟使輔酶I(NAD)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原性輔酶I(NADH)，從而其 比值下降，而NDA /NADH比例下降使j致酸循環(huán)受抑制，進(jìn)而脂肪氧化減弱，肝內(nèi) 脂肪酸合成增多。當(dāng)其增多超過肝臟的處理能力就形成脂肪肝，最終形成肝纖維 化。河福金等在大鼠常規(guī)喂養(yǎng)同時(shí)灌入酒精、橄欖油等的混合液.4周后可見肝小 葉中央?yún)^(qū)明顯壞死或呈局限性壞死、點(diǎn)狀壞死，間質(zhì)可見炎性浸潤，電鏡下可見 肝細(xì)胞周圍膠原纖維增生，此類模型依其處于不同的時(shí)期可作酒精性脂肪肝及肝 纖維化的研究。血清免疫法建立肝硬化模型造模方法是用異種血清或蛋白對大

15、鼠進(jìn)行皮下、腹腔或尾靜脈注射。人或牛 血清白蛋白直接經(jīng)靜脈注射，可引起過敏性休克，動(dòng)物死亡率較高，加用前列腺 素El可以降低動(dòng)物死亡率而不影響肝纖維化形成的時(shí)間和程度。豬血清法操作簡 便，周期較短，成功率高，結(jié)果穩(wěn)定，纖維化一旦出現(xiàn)不易改變，在研究肝纖維 化產(chǎn)生機(jī)制和篩選抗纖維化藥物方面有一定優(yōu)勢。用異種血清制品建立肝硬化， 其主要原理是異種的血清進(jìn)入體內(nèi)引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，在肝臟主要是在肝脈 匯管區(qū)形成免疫復(fù)合物沉積，由沉積的免疫復(fù)合物引起局部炎性反應(yīng)，進(jìn)一步刺 激膠原增生而造成肝組織纖維化。4. 1異源血清法 目前常使用的異種血清有牛血清，血吸蟲血清、豬血清等。 其中牛血清白蛋白免疫損傷

16、所致的肝纖維化，與臨床上的慢性肝炎所致的肝纖維 化在發(fā)病機(jī)制上更加接近。這些免疫損傷性模型與人類肝纖維化形成近似，屬主 動(dòng)性纖維化，符合人的肝炎后纖維化的形成機(jī)制，但因沒有病毒持續(xù)復(fù)制和肝實(shí) 質(zhì)持續(xù)損傷的過程，與人肝纖維化相比仍有較大的差距。4. 2人血清白蛋白法 李培建等將人血清白蛋白用生理鹽水稀釋，用等量的不 完全福氏佐劑乳化，每只大鼠皮下多點(diǎn)注射，每次注射白蛋白4 mg，共4次，然后 尾靜脈注射白蛋白進(jìn)行免疫攻擊。該方法所造的動(dòng)物模型肝細(xì)胞損傷較輕，無碎 屑狀或橋狀壞死，有別于肝炎后肝硬化。4. 3刀豆素蛋白A法小鼠經(jīng)靜脈注射植物凝集素刀豆素蛋白A(concanavalinA, Con

17、A)后，可以引起T細(xì)胞介導(dǎo)的急性肝損傷26I。李鴻立等將小鼠經(jīng)尾靜脈 注射12. 5 mg/kg劑量的1 mol/L刀豆素蛋白A,每周1次，連續(xù)6周。與其他肝纖 維化動(dòng)物模型相比較，Con A誘導(dǎo)的肝纖維化模型的方法成功率較高，動(dòng)物死亡率 較低，方法簡便易行。膽汁淤積性肝纖維化原理是通過切斷膽管或注入硬化劑等方法人為地造成肝外膽道梗阻，從而引 起梗阻部位以上肝管擴(kuò)張、膽汁淤積，膽道內(nèi)壓力增高，并可引發(fā)肝內(nèi)膽小管裂， 膽汁中的膽紅素和一部分膽汁酸可使線粒體受損，能量生成障礙、自由基產(chǎn)生、 Ca+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)等，導(dǎo)致肝細(xì)胞的溶解、壞死。國外文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠膽管內(nèi)逆行性 注入N一丁基一 2一氤基丙烯酸鹽

18、加膽管結(jié)扎導(dǎo)致膽管阻塞，可建立膽管阻塞性纖 維化模型。膽管阻塞性肝纖維化模型ALT、AST、HA、LN均明顯升高；病理組織學(xué) 可見彌浸增生的膽小管，大量的膠原沉積在膽小管周圍，肝細(xì)胞與增生的膽小管 相比明顯減少。Shen等采用膽總管雙重結(jié)扎的方法制備腫纖維化模型，即在肝管 匯合處及胰管匯處的上方分別結(jié)扎，然后在兩個(gè)線結(jié)間完全剪斷膽總管。4周時(shí)血 清膽紅素達(dá)到最高水平保持穩(wěn)定，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，2周時(shí)可見膽管細(xì)胞增生， 4周時(shí)月日管細(xì)胞增生更加明顯，并伴有肝組織結(jié)構(gòu)的變形，6周時(shí)肝內(nèi)假小葉形 成。顧小紅等在膽管結(jié)扎人鼠肝纖維化模型中成功分離培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞(HSC)，對 丁研究肝纖維化形成中的關(guān)

19、鍵環(huán)節(jié)一 HSC的活化，增殖和膠原合成機(jī)制的研究提供 了便利條件。該模型的原理與發(fā)生在人體的繼發(fā)性膽源性肝硬化的機(jī)制相吻合。 造模方法操作簡單、周期短、陽性率高、自發(fā)逆轉(zhuǎn)率低。此模型的特點(diǎn)是在無炎 癥及壞死的情況下發(fā)生進(jìn)行性肝纖維化，與人類小結(jié)節(jié)性肝硬化的生化及組織學(xué) 變化十分相似，被認(rèn)為是一種能模擬人肝纖維化比較理想的動(dòng)物模型，主要用于 考察藥物的直接抗纖維化作用及肝臟血液動(dòng)力學(xué)研究。該模型存在的問題造模動(dòng) 物膽汁過度淤積，高死亡率，以及膽管再通，組織學(xué)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。肝纖維化動(dòng)物模型展望科研過程中選擇一個(gè)與人類疾病特征相似的動(dòng)物模型是最為重要的，它是科 研工作能否成功以及有無科研價(jià)值最起碼的基礎(chǔ)之一。理想的肝纖維化模型病理 改變呈階段性，具有可逆與不可逆的階段性演進(jìn)過程，與人類疾病所致纖維化的 形態(tài)特點(diǎn)一樣，模型動(dòng)物的表現(xiàn)符合中醫(yī)“證”的特征，且造模方法簡單，模型 形成率高，重現(xiàn)性好。因?yàn)楦卫w維化的病因多樣性、以及動(dòng)物與人種屬差異，理 想的肝纖維化動(dòng)物模型的建立是臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究中的一個(gè)難點(diǎn)，尚需進(jìn)一步 深入研究.迄今為止，能完全反應(yīng)人類肝纖維化的動(dòng)物模型尚未完全取得