組織學制片技術ppt課件

1、組織學制片技術組織學與胚胎學教研室目的要求1、了解組織學制片的根本程序；2、熟習HE染色的步驟；3、掌握HE染色結果的察看。1切片標本：組織經固定、切片包括冰凍切片、石蠟切片及火棉膠切片染色、封固而制成的各種玻片標本。它為組織學中最常用的標本。一、組織學常用的幾種標本類型2鋪片標本：將腸系膜或皮下組織鋪于載玻片上，經固定、染色、封固而制成的標本。3涂片標本：主要是將液態(tài)組織如血液、骨髓、痰液、腹水、精液等液體涂抹于載玻片上，經固定、染色制成的組織標本，以供察看細胞的形狀與其微細構造。血液涂片宮頸涂片4磨片標本：不經脫鈣及切片手續(xù)，而直接用手工在磨石上磨制成薄片，以便在顯微鏡下察看的骨、牙磨片標

2、本。大麗紫染色5分別標本：將極小組織塊用化學藥物的水溶液浸泡后，溶去其細胞間質，采用機械分別方法如振蕩、針撥等方式使之分別成單個而又完好的細胞，經染色后涂于載玻片上進展鏡檢。6壓片標本：組織經化學藥物軟化及染色后，用蓋片壓封于載玻片上進展鏡檢的標本。如運動終板的制造。7整裝標本：一種是將很小的動物或早期胚胎經固定、染色后，封固于載玻片上。另一種是將小動物、胚胎或病變器官經固定后，保管于固定液中瓶裝供肉眼察看用?？闪私馀唧w的外表立體形狀特征及病變部位與周圍組織的毗鄰關系。8活體標本：在組織細胞生活形狀下進展察看的標本，或生活形狀下進展活體染色后制成的標本。9血管注射標本： 一種是將樹脂類鑄形劑經

3、血管灌注后，用強酸或強堿腐蝕血管周圍組織而制成的血管鑄形標本，可瓶裝供肉眼察看或進一步處置后作掃描電鏡察看。另一種是將染料加明膠配制成染色液注入血管內，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成的組織切片標本。這類標本主要用于了解血管的走行及其與所支配組織或器官的相互關系。 組織切片的制造方法有：石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、超薄切片電鏡標本、樹脂切片、碳蠟切片等。石蠟切片法是最常用的方法，本節(jié)將較詳細講授其制造步驟。 二、組織切片的常規(guī)制造一 概述 組織切片制造方法的根本程序為：取材固定脫水透明包埋切片染色封固。1頸椎脫臼法 2斷頭法 3麻醉法 4空氣栓塞法：二動物的致死與取材1、動物致

4、死法： 2、組織取材時應留意：(1)所取資料越新穎越好；(2)切取組織的刀剪刃口必需鋒利；(3)取材時必需思索切面的方向；(4)組織塊應力求小而??；(5)收縮較大的新穎組織；(6)留意清潔；使細胞內蛋白質凝固，終止或抑制外源性和內源性酶活性，防止組織自溶；使組織成份轉變?yōu)椴蝗苄晕镔|從而有利于保管。這就是固定的根本意義。三標本的固定1固定的目的(1)組織塊不宜太大，普通以厚度為2毫米，長度不超越0.5厘米*0.5厘米。(2)固定液的量普通以組織塊大小的30倍為宜，最好在固定組織的瓶底墊上脫脂棉或幾層紗布以使固定液能從上下左右前后各方都能滲入組織塊。(3)固定的時間，普通以24小時為宜。2固定的本

5、卷須知 (4)后固定：柔軟組織在新穎時不易切成小塊，往往采用重新固定法處置。5特殊固定：神經組織以在活體動物灌流固定后再重新投入固定液為佳，有些組織如肺那么采用由氣管注射固定液后再投入固定液為好。常用的固定液有：110%福爾馬林液：商品甲醛36%40%甲醛水溶液配成固定液其濃度為3.6%4%，也就是習慣上稱為10%的福爾馬林液。 210%中性緩沖福爾馬林液：商品甲醛10ml，0. 1mol/L pH7.4 PBS 90ml。3固定劑用以固定組織的藥劑，稱為固定液。34%多聚甲醛磷酸緩沖液pH7.44Bouins液：苦味酸飽和水溶液75份，甲醛25份，冰醋酸5份配制而成。 1灌注法Irrigat

6、ion method自左心室插入自動脈，先以生理鹽水沖冼血液后，注入固定液，30min后取材，置同一固定劑后固定。 2浸入法Immersion method 。4固定方法 資料固定后，藥劑繼續(xù)留在組織中，易使組織破壞，必需用水或酒精洗去。5固定后處置三種方式進展處置：3直接入脫水劑。2酒精充分洗滌Bouins液含苦味酸；1流水沖洗鉻酸或鉻酸鹽固定的組織；1、目的 ：脫水與透明的目的在于為石蠟浸透至組織塊內部以便進一步包埋做必要的預備。脫水必需從低濃度開場，逐漸轉入高濃度脫水劑。另外脫水必需進展得很徹底。 2、常用脫水劑：1酒精： 2丙酮： 四脫水與透明3、常用的透明劑有二甲苯、甲苯、氯仿等。

7、二甲苯：透明組織的才干強，但易使組織收縮和變脆，故在二甲苯中不宜擱置太久。 氯仿：其透明才干遠比二甲苯慢，透明時間可以延伸至24小時也無妨。 1 目的：由于生物體的組織有各種硬度不同的成份，必需加石蠟等作支持物質滲入組織塊內部，并將組織塊包埋起來，然后用切片機以制造極薄的切片。2 種類：包埋物質目前廣泛采用的除石蠟外，還有火棉膠、炭蠟、明膠以及環(huán)氧樹脂、OTC(冰凍切片包埋劑等。五包埋商品石蠟 的處置：浸蠟 ：包埋：通常運用包埋盒。石蠟包埋法： 反復溶化以添加石蠟的硬度和密度。溫度不能超越該石蠟的溶點的2以上；12h 。 包埋通常運用組織包埋機、包埋盒及配套運用的不銹鋼模具。把熔蠟倒入模具內，

8、再用加熱的彎曲鈍頭鑷子夾取曾經過浸蠟的組織塊，使切面朝下平正地置放于模具底面的中央處，然后放上包埋盒，繼續(xù)加滿蠟，待包埋盒外表的熔蠟凝固后，將其移入加冰塊的冷水中加速凝固，包埋即告完成。 170%乙醇 常溫 1224h 280%乙醇 常溫 1224h 390%乙醇 常溫 23h 495%乙醇 常溫 12h 595%乙醇 常溫 12h 6100%乙醇 常溫 1h 7100%乙醇 常溫 1h8二甲苯 常溫 2030min 9二甲苯 常溫 2030min 10石蠟 4850 0.5h 11石蠟 4850 0.5h 12石蠟 5860 0.5h 13石蠟 5860 0.5h組織塊處置時間表 石蠟切片機

9、可分三個部分，一是安裝切片刀的部分，有調理刀片斜度和固著刀片的螺旋。一是安裝資料的部分，也有螺旋可以調理資料的位置。另一是支配在旋轉中向前推進的部分，控制著切片的厚薄，是比較重要而復雜的部分。六組織切片技術1、切片機簡介：德國冰凍切片機冰凍切片機制冷系統(tǒng)自動進樣/切片系統(tǒng) 照明系統(tǒng)2、載玻片和蓋玻片處置：新載玻片上有油污，必需經過清潔液浸泡、充分漂洗、酒精浸泡、烤干備用。 (1) 明膠液：這是粘片最常用的膠液，簡便優(yōu)良。 (2)蛋白甘油：雞蛋清 50ml ，甘 油 50m1 ，水楊酸納 1g 。 3樹脂膠：又稱白色乳膠，運用濃度為1%2%，以蒸餾水稀釋即可。 4 多聚賴氨酸，APES3-氨丙基

10、-乙氧基甲硅烷。3、載玻片上涂粘附劑：4切片步驟： 1切片刀或一次性切片刀必需鋒利。2將切片刀安裝在持刀座上以15為宜。3將蠟塊包埋盒固定于支持器上，調整蠟塊和刀刃至適當位置。4細心挪動刀座或蠟塊支持器，使蠟塊與刀刃接觸，旋緊刀座和蠟塊支持器。5修整蠟塊粗切：勻速旋轉切片輪，修切蠟塊外表至包埋其中的組織塊完好地全部切到。6調理切片厚度調理器普通為46m，進展切片，切出的蠟片應延續(xù)成蠟帶。蠟帶應完好無缺，厚度適宜、均勻，無刀痕、顫痕、皺折、開裂、缺損、松解等。7以公用小鑷子悄然夾到蠟片，放入伸展器的溫水中42左右，使切片全面展開。8將蠟片附貼于包被有粘附劑的載玻片上，蠟片應置放在載玻片右或左2/

11、3處的中央，蠟片與載玻片之間無氣泡。9放入溫箱中，4045約1小時烘干即可。七染色:1、染料及染色液簡介： 1蘇木精 2洋紅 3蘇丹 4伊紅 5堿性品復紅 6結晶紫 7亞甲藍或美藍 8甲基綠 2、Ehrlich蘇木精的配制蘇木精 2克、銨明礬 3克、無水酒精100毫升、甘油 100毫升、蒸餾水100毫升。此液配成后，須經12月，待它氧化成熟以后才干運用，故必需先配制。3、伊紅液配制：伊紅 2克、90%酒精 或蒸餾水200毫升。1取組織塊，經固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚46m。2切片常規(guī)二甲苯脫蠟，下行酒精至水3明礬蘇木精液染色510min，自來水洗去浮色。41%鹽酸乙醇分化20s提插數(shù)下。5

12、自來水浸泡1 h。4、HE染色6上行酒精脫水：70乙醇5min80乙醇5min90乙醇5min。7置1%伊紅液25min。8常規(guī)脫水，透明，封片胞核，嗜堿性，染為紫藍色胞質，嗜酸性，染為紅色 5、關于HE染色時本卷須知：1用含升汞的固定液固定的組織塊,在切片染色前，應進展脫汞。詳細方法：切片脫蠟，逐次進入70%酒精后，入稀碘液碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水3000ml內510min。蒸餾水稍洗，入5%硫代硫酸鈉溶液內5min。蒸餾水充分洗后進入染色。2切片必需求充分枯燥后才干進展染色；而染色過程中切忌讓切片枯燥。3用伊紅水溶液染切片時，往往在經脫水的低濃度酒精時極易脫色，特別是對于細胞密集的組織更易出現(xiàn)這種情況。而用95%酒精配制的1%伊紅染液那么可獲較稱心效果。4切片染蘇木精后，分色(1%鹽酸乙醇)這一步驟極為重要，應在顯微鏡下控制進展，普通以細胞核染色明晰，而