國家自然基金面上項目：淫羊藿的炮制機理

1、摘要：研究假說：中藥經(jīng)炮制后可提高活性成分的吸收，從而達到增加藥效的目的。本研究選擇淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai.），利用ADME/Tox平臺研究單體活性成分Epimedin A、Epimedin B、Epimedin C、Icariin 、Baohuside 的吸收、代謝機理與動力學及淫羊藿炮制品的標準提取物中這5個主要活性成分的吸收與代謝及其相互作用。從中藥活性成分吸收與代謝的角度闡明淫羊藿的炮制機理。中藥炮制的科學研究起步較晚，對減毒或增效的物質(zhì)基礎(chǔ)及炮制機理研究較少。目前對中藥炮制機理的闡述只是停留在該過程的兩端即化學成分的變化和藥理藥效層面，而對闡明炮制機

2、理的重要環(huán)節(jié)炮制前后有效成分的吸收、代謝研究不夠深入，本課題擬從更深層次上闡明中藥炮制機理，同時為制定合理的炮制工藝和質(zhì)量標準提高科學依據(jù)，為中藥現(xiàn)代化、國際化做出更大貢獻。(一)立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）1.項目的立項依據(jù) 1.1中藥炮制是我國人民在數(shù)千年的醫(yī)療實踐中不斷總結(jié)、改進、發(fā)展形成的一套傳統(tǒng)制藥技術(shù)，和中藥復方一起構(gòu)成了祖國醫(yī)藥學的兩大鮮明特色。目前對中藥炮制機理研究所采用的方法有：應用化學方法進行研究1：中藥的療效，是由于其所含的化學成分決定的。中藥經(jīng)過炮制后，所含的化學成分的性質(zhì)和含量會產(chǎn)生不同程度的改變，因而藥理作用、臨床療效也會發(fā)生相應變化，可見，研究中藥炮

3、制前后化學成分性質(zhì)和含量的變化是中藥炮制機理研究的重要內(nèi)容，該方法在一定程度上能闡明炮制原理，而且能指導炮制工藝的設(shè)計和改進，也是制訂質(zhì)量標準的重要依據(jù)。蔡寶昌等2，3測定了馬錢子不同炮制品中生物堿和馬錢子苷的含量，表明炮制后生物堿和馬錢子苷的含量均降低；蔡寶昌等4從炮制前后的馬錢子中提取鑒定了16個生物堿，其中異馬錢子堿等為新生物堿；應用實驗藥理學方法進行研究1：中藥的臨床研究由于受到復方用藥和患者對象的制約，一般不易進行，加上很多中藥化學成分研究還缺乏與藥效的緊密聯(lián)系，或者尚屬空白，因此實驗藥理學的研究也是揭示中藥炮制機理的方法之一。應用實驗藥理學的方法研究中藥炮制，主要選用適合中醫(yī)病理模

4、型的方法和指標來進行，或選用已有的藥理方法和指標來進行。在化學成分不清的情況下，通過實驗藥理學的方法來研究炮制前后的生物活性變化，也可達到控制炮制質(zhì)量和指導工藝改革的目的。如：蔡寶昌等2的研究表明馬錢子不同炮制品的急性毒性較生品均有所降低；馬聘等5的研究表明草烏用新方法炮制后具有對心律影響小、毒性低等優(yōu)點?？傊?，目前中藥炮制機理研究主要通過炮制前后藥物有效成分含量或溶出量增加、與治療無關(guān)的成分的減少和藥材中所含酶的活力的破壞以保留有效成分等化學成分變化的角度和炮制前后藥理毒理的對比等角度來闡述。1.2從目前對中藥炮制機理的研究現(xiàn)狀可看出：對炮制機理闡述的過程中缺少一架溝通中藥炮制前后化學成分變

5、化與藥理藥效變化之間關(guān)系的橋梁中藥活性成分ADME/Tox系統(tǒng)的研究；中藥活性成分吸收與代謝是中藥產(chǎn)生生物效應的重要環(huán)節(jié)，更是徹底闡述中藥炮制機理的最佳切入點。本研究擬利用中藥活性成分細胞層次的ADME/Tox系統(tǒng)研究中藥淫羊藿的入藥品種之一淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai.）的炮制機理。1.3 為了充分發(fā)揮藥物的療效，必須增加有效成分在體內(nèi)的溶出度、釋放度和吸收率，以提高生物利用度。然而藥物在體內(nèi)藥效的發(fā)揮很大程度上取決于血藥濃度的高低，而藥物在生物體內(nèi)的吸收、代謝與血藥濃度的高低有密切關(guān)系。目前，口服給藥在各種給藥途徑中占有主導地位，因此，藥物的ADME/Tox系統(tǒng)

6、研究是生物藥劑學研究的重點之一，ADME/Tox 系統(tǒng)區(qū)別于以前的吸收、分布、代謝、排泄的串級研究不同在于：提取與篩選同時進行，可以全面檢測和預見藥物提取過程中成分及在體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄和毒性各方面的問題；用細胞（特別是人源細胞）進行，采用高通量技術(shù)6。國外對藥物ADME/Tox系統(tǒng)（吸收、分布、代謝、排泄、毒理、藥物藥物之間相互作用）方面的研究非常重視，從而多種研究藥物腸道吸收的生物學方法應運而生。ADME/Tox系統(tǒng)研究中最著名的吸收模型Caco-2模型被美國FDA認為是預測人體藥物吸收的行之有效的方法，Caco-2模型輔以大鼠在體腸灌流模型可以從在體和細胞兩方面全面闡述藥物的AD

7、ME過程及其變化。(1)Caco-2細胞模型7Caco-2細胞來源于人體結(jié)腸腺癌細胞。由于Caco-2細胞在培養(yǎng)條件下可自發(fā)進行上皮樣分化并可形成緊密聯(lián)結(jié),其形態(tài)學、標志酶的功能表達及滲透特征與小腸類似, Caco-2細胞模型可作為研究小腸表皮細胞藥物轉(zhuǎn)運和代謝的體外模型。其優(yōu)點為:省時、可測定藥物的細胞攝取及跨膜轉(zhuǎn)運、Caco-2細胞內(nèi)有藥物代謝酶,可在代謝狀況下測定藥物的跨膜轉(zhuǎn)運、Caco-2細胞與小腸上皮細胞近似、Caco-2細胞易于培養(yǎng)且生命力強、Caco-2細胞來源是人結(jié)腸癌細胞,同源性好，可用于區(qū)分腸腔內(nèi)不同吸收途徑的差別。Caco-2細胞模型的基本特點Caco-2細胞系結(jié)構(gòu)和生化

8、作用類似于人小腸上皮細胞,含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系,與正常的成熟小腸上皮細胞在體外培育過程中出現(xiàn)逆向分化(反分化)不同, Caco-2細胞在傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)條件下,生長在多孔的可滲透的聚酯(Polycarbonate)膜上可達到融合并自發(fā)分化為腸上皮細胞,形成連續(xù)的單層(monolayer)8。培育約10后,單層的跨膜電阻約為2600cm2,細胞密度約為0.9106細胞cm2,此時Caco-2細胞單層對漏出標志物如聚乙二醇(Mr4000)或甘露醇是不滲透的,這種性質(zhì)可以維持恒定約20,由于Caco-2細胞性質(zhì)類似小腸上皮細胞,因此可以在這段時間進行藥物的跨膜轉(zhuǎn)運實驗9,10。Caco-2細

9、胞模型的藥物轉(zhuǎn)運機理在Caco-2細胞模型中,藥物的轉(zhuǎn)運過程為:藥物分子從Caco-2單細胞層的頂側(cè)腸腔側(cè)(側(cè))跨過Caco-2單細胞層或經(jīng)由細胞間隙到達基底側(cè)(側(cè))。藥物跨過腸上皮有4條途徑:被動轉(zhuǎn)運;胞旁轉(zhuǎn)運;載體介導轉(zhuǎn)運;胞飲。(2)在體腸灌流模型特點：保證了腸道神經(jīng)以及內(nèi)分泌輸入的完好無損,同時也保證了血液及淋巴液的供應,提高了生物活性。在該模型中還可測定腸道代謝物。該法既可從腸腔取樣,又可從血液中取樣。雖然這些研究常在麻醉的小動物上進行,但借助腸插管,非麻醉的實驗動物及人體的灌流研究亦可進行11。在體腸道灌流不僅提供了較高的組織活性,而且提供了額外的取樣部位。已經(jīng)建立了鼠腸原位灌流實

10、驗取得的藥物腸道滲透率同人體研究中口服給予藥物溶液后吸收的藥物量之間的關(guān)系。Hu M.等學者采用Coca-2和腸灌流模型等方法對黃酮和類黃酮成分的吸收與代謝進行了研究1219；研究結(jié)果表明1923：黃酮苷類化合物在腸道中降解成苷元再吸收，而淫羊藿苷主要是以它的次級鼠李糖苷形式吸收。類黃酮的吸收與代謝途徑可歸納為 Fig 1。1.4淫羊藿為傳統(tǒng)補腎中藥，在民間沿用已有千年歷史，具補腎陽，強筋骨，祛風濕功效。臨床常用于陽痿遺精，筋骨痿軟，風濕痹痛等證。淫羊藿中含多種黃酮類成分，目前研究證明24：淫羊藿總黃酮為淫羊藿主要活性成分。淫羊藿總黃酮在心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗炎、抗骨

11、質(zhì)疏松、抗衰老、抗腫瘤等25方面取得較大的進展。臨床常見的淫羊藿炮制品有淫羊藿、羊脂炙淫羊藿、鹽淫羊藿和酒淫羊藿等。目前對淫羊藿的炮制研究主要有以下兩個方面：(1)炮制前后黃酮類等化學成分的變化陳惠玲等26采用紫外分光光度法測定粗毛淫羊藿生品及4種不同炮制品中總黃酮的含量，總黃酮含量由高到低順序為：生品清炒品酒炙品鹽炙品羊脂炙品。(2)炮制前后藥理、藥效的變化淫羊藿炮制后對心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面藥理、藥效較生品有顯著提高，故歷代臨床用藥均以炮制品為主。淫羊藿炮制品中總黃酮含量低于生品,而臨床用藥歷代均以炮制品為主，且認為淫羊藿炮制后藥效較生品有顯著提高。因此從淫羊藿炮制前后化學成分變化的角

12、度并不能解釋其炮制機理；對炮制后其藥效的增強也缺乏令人信服的闡述，即只知其然而不知其所以然。淫羊藿炮制品中總黃酮含量低于生品,而臨床用藥歷代均以炮制品為主，即其炮制品藥效較生品有顯著提高，因此我們的假說為：淫羊藿的炮制機理是：淫羊藿炮制后能被機體吸收的黃酮含量相對增加；中藥經(jīng)過炮制，可提高活性成分的吸收，從而達到增強其藥效之目的。即該研究試圖從活性成分ADME/Tox層次闡明淫羊藿的炮制機理，以期填補國內(nèi)目前中藥炮制機理研究領(lǐng)域的一個空白。中藥炮制的科學研究起步較晚，許多炮制經(jīng)驗，只知道炮制后可以降低毒性、可以增強療效，但對減毒或增效的物質(zhì)基礎(chǔ)及炮制機理卻長期處于無知狀態(tài)，即只知其然而不知其所

13、以然。目前對中藥炮制機理的闡述只是停留在該過程的兩端即化學成分的變化和藥理藥效的變化，而對闡明炮制機理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)炮制前后中藥活性成分的吸收等研究不夠深入，本課題擬從更深層次上闡明中藥炮制機理，同時為制定合理的炮制工藝和質(zhì)量標準提供科學依據(jù)，為中藥現(xiàn)代化、國際化做出更大貢獻。 參 考 文 獻1.葉定江主編.中藥炮制學M.上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1996:82.蔡寶昌等.馬錢子不同炮制品中總生物堿的測定及急性毒性試驗的比較.中國中藥雜志，1994,19(10):5983.蔡寶昌等.炮制對馬錢子中馬錢子甙的影響.中國中藥雜志,1994,19(6):3464.蔡寶昌等.馬錢子中16個生物堿類化合物1

14、3CNMR譜的數(shù)據(jù)分析.藥學學報,1994,29(1):445.馬聘,蔡寶昌,陳龍.草烏幾種炮制品的毒性實驗比較.中國中藥雜志,1994,19(4):2166. 王夔主編.中藥研究現(xiàn)代方法學M.北京：化學工業(yè)出版社，2004：67.楊海濤，王廣基，Caco-2單層細胞模型基其在藥學中的應用，藥學學報，2000,35(10),797-800.8.AllenRH,robeitAC,PhilipSB.Caco-2 cell monolayers as model or drug transport across the intertinal mucosaJ.Pharm Res ,1990,7(9):

15、902.9.Hidalgo Ij Raub Tj,Borchardt RT.Characterization of the human colon carcinoma cell line(Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeabilityJ.Gast10.GanLL,DhirenRT,Applications of the Caco-2 model in the design and development of orally actived drugs;elucidation of biochemical and

16、physical barriers posed by the intestinal epitheliumJ.Adv Drug Deliv Rev,1997,23(1):77.11.Lenernas H Ahrenstedt O.Hallgren R,et al .Reginal jejunal perfusion,a new in vivo approach to study oral drug absorption in manJ.Pharm res,1992,9:1234.12.Hu M,Chen J,Lin H.Disposition of Flavonoids via Recyclin

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20、vonodisand Ginkgo Flavonodis.J Altern.Complement.Med.,9(5):631-640,200318.CrespiCL,Penman,BW and Hu M.The Development of Caco-2 Cells Expressing HighLevels of cDNA-Derived Cytochrome P4503A4.Pharm.Res.13,1635-1641,1996.19.Chen J,Lin H,Hu M.Metabolism of Flavonoids via Enteric Recycling:Role ofIntest

21、inal Dispostion.J.Pharmacol.Expt.304:1228-1235,200320.Abe K,Nakada Y,Suziki A,et al.Biliary metabolites of hesprrein in rats.Shoyakugaku Zasshi,1993,47:4321.Yasuda T,Kano Y,Saito K,et al.Urinary and biliary metabolites of daidzin anddaidzein in Rats.Biol Pharm Bull,1994,17:136922.李楓,劉永.寶藿苷-I,VI,VII和

22、寶藿素的分離和結(jié)構(gòu)研究.藥學學報,1998,23:73923.邱峰等.淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的代謝.藥學學報,1999,34(3):22222624.歐陽軍,歐陽紅.淫羊藿化學成分及藥理研究的新探討.中國民族醫(yī)藥雜志,1997,S1:15825.許碧連,吳鐵,王暉.淫羊藿總黃酮藥理作用的研究現(xiàn)狀.中國臨床藥理學與治療學,2003,8(1):11526.陳惠玲等.粗毛淫羊藿及其不同炮制品中總黃酮的含量.中國中藥雜志,2000,25(4):2392.項目的研究內(nèi)容、研究目標,以及擬解決的關(guān)鍵問題。*研究目標：從中藥活性成分吸收的角度闡明淫羊藿的炮制機理。本研究選擇淫羊藿（Epimedium korea

23、num Nakai.），利用ADME/Tox系統(tǒng)研究單體活性成分Epimedin A、Epimedin B、Epimedin C、Icariin 、Baohuside 的吸收、代謝機理與動力學及淫羊藿炮制品的標準提取物中這5個主要活性成分的吸收與代謝及其相互作用。從中藥活性成分吸收與代謝的角度闡明淫羊藿的炮制機理。*研究內(nèi)容：淫羊藿中含有多種化學成分，黃酮類成分是其主要活性成分，本研究擬選用淫羊藿的入藥品種之一淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)，對其中的5個黃酮單體活性成分及淫羊藿(Epimedium koreamum Nakai)炮制品的標準提取物中這5個主要單體活性

24、成分的吸收與代謝及其相互作用進行研究。結(jié)構(gòu)式如下：R1 R2 Compound 1. rhaglc glc Epimedin A(朝藿定A)2. rhaxyl glc Epimedin B(朝藿定B)3.rharha glc Epimedin C(朝藿定C)4.rha glc Icariin(淫羊藿苷)5.rha H Baohuside (寶藿苷)(1) 淫羊藿黃酮類成分的HPLC和LC-MS的分析方法：建立Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside的HPLC分析方法，并用LC-MS，LC-MS-MS等分析手段對標準提取物中其他成

25、分進行峰歸屬。(2) HPLC測定淫羊藿不同炮制品標準提取物中Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside五個單體活性成分的含量變化。(3) 利用ADME/Tox系統(tǒng)研究Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside五個單體活性成分的吸收與代謝機理、動力學、毒理學、藥物藥物之間相互作用(4) 研究比較生品與羊脂炙炮制品的標準品提取物中，上述5個黃酮單體活性成分（Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside）的吸收

26、與代謝機理及其相互作用。 *擬解決的關(guān)鍵問題：淫羊藿經(jīng)炮制后總黃酮含量降低，但是歷代臨床用藥卻以炮制品為主，本研究擬采用ADME/Tox系統(tǒng)研究淫羊藿炮制品中黃酮類成分的吸收與代謝，試圖從中藥活性成分吸收的角度闡述炮制的機理：炮制可提高中藥活性成分的吸收。3.擬采取的研究方案及可行性分析*技術(shù)路線淫羊藿藥材品種鑒定 炮制品制備(鹽炙、酒炙、羊脂炙)HPLC測定炮制品中5個黃酮單體（Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside）的含量LC-MS、LC-MS-MS等技術(shù)對標準提取物中其它黃酮類成分進行成分歸屬5個黃酮單體（同上）的吸收與

27、代謝動力學淫羊藿生品與羊脂炙品標準提取物中5個黃酮單體的ADME/Tox系統(tǒng)研究*研究方法及實驗手段：(1)HPLC、LC-MS分析方法：條件：色譜柱：C18柱（4.6150，5um）；流動相：A(0.5%冰醋酸溶液),B(乙腈)；B相濃度梯度洗脫：020min (25%B)，2045min(25%35%B)；流速:1.0 ml/ min ；檢測波長:272 nm；進樣量:20ul。(2)Caco2細胞模型研究黃酮成分的吸收代謝： Fig2 Caco-2 model細胞培養(yǎng)：Caco-2細胞種植于transwell上，種植密度為（100,000細胞/cm2），培養(yǎng)基為含有10小牛血清的DMEM

28、溶液，細胞在37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔一天更換培養(yǎng)液，單層細胞于1921天左右分化形成，即可用于試驗。實驗過程：37下用PH7.4的HBSS將單層細胞沖洗3次，測量跨膜電阻，棄去跨膜電阻值小于500ohmscm2的細胞。細胞在緩沖液中孵育1h后吸走孵化介質(zhì)，在細胞層的絨毛面（AP）加入含有待試藥物的溶液，隨后發(fā)生一系列的跨膜轉(zhuǎn)運。AP側(cè)底液于開始和結(jié)束時取樣兩份，BL側(cè)底液每隔30min中取樣400ul，并補充同體積空白底液保持BL側(cè)體積恒定。在每份樣品中加入50ul溶液（乙腈:冰醋酸94:6，其中含作為內(nèi)標物的100uM睪丸酮），混合物離心(13,000rpm)8分鐘，上清液用HPLC法分

29、析。(3)大鼠在體單向腸灌注模型研究黃酮成分的吸收代謝：方法：麻醉動物,打開腹腔, 靠近十二指腸處插入膽汁導管，分別在the duodenum；the jejunum；the terminal ileum；the colon兩端插管, 實驗時用等滲生理鹽水浸漬的紗布覆蓋于腸組織表面以保濕，用等滲生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物后換灌流液,用一恒速泵灌流腸腔, 泵的流速為0.191ml/min。每隔30min收集出口管中灌流液，灌注前收集一次膽汁樣品（約0.4ml），隨后每隔30min收集一份，灌注后測量小腸的長度。出口管中藥物濃度用HPLC檢測。膽汁樣品用緩沖液按（1:10）比例稀釋，加入葡萄糖醛酸酶和硫

30、酸酯酶，反應6h，釋放出苷元，供HPLC檢測。 (4)微粒體：腸微粒體制備：大鼠禁食24h，不禁水，注射苯巴比妥鈉（200mg/kg）處死，切開8只鼠的小腸部分，按照以下的方法分離：小腸部分（始端10cm作為 十二指腸；末端10cm作為回腸；其余的作為空腸）；大腸部分（盲腸棄去，結(jié)腸用于微粒體制備）。集中八只鼠腸的相同部分，每段用冰冷的溶液（冰鹽水加二硫基丁二醇1mM）清洗?？v向切開各部分腸，洗去排泄物，放置于冰冷溶液A8 mM KH2PO4, 5.6 mM Na2HPO4, 1.5 mM KCl, 96 mM NaCl, 27 mM sodium citrate, and 0.04 mg/m

31、l phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)中,用溶液A清洗兩次，將刮出的粘膜細胞放進溶液B(8mM KH2PO4, 5.6 mM Na2HPO4, 1.5 mM EDTA, and 0.5 mM dithiothreitol and 0.04 mg/ml PMSF)中，收集細胞，在900g轉(zhuǎn)速離心5分鐘，用12ml均勻的緩沖液洗兩次（PH7.4mM KH2PO4,250mM 蔗糖，1mM EDTA，0.04mg/mlPMSF）將細胞重新懸浮于2ml上述緩沖液中，用電動勻漿機使均勻化，經(jīng)15min低速離心（15,000g，4），上清液用巴氏吸管吸走，脂肪層和碎片

32、棄去。微粒體再經(jīng)高速離心（60min，4，90,000g，）將所得微粒體懸浮于250mM 蔗糖溶液中，分裝于微量離心管中，80下保存?zhèn)溆谩８挝⒘ｓw制備：切除麻醉成年雄性SpragueDawley大鼠新鮮肝臟，放于冰冷鹽溶液中，稱重，切碎，在冰冷緩沖溶液（50mM PH7.4磷酸鉀緩沖液，250mM蔗糖，1mM EDTA）中用電動勻漿機攪勻，離心（77,000g，15min，4），收集上清液，離心（18,500g，15min，4）棄去沉淀，上清液再離心1h（85,600g，4），產(chǎn)生微粒體。將所得微粒體懸浮于250mM 蔗糖溶液中，分裝于小瓶中（0.5ml/瓶），80下保存?zhèn)溆?。以小牛血清蛋白?/p>

33、為標準用BioRad分析方法檢測蛋白濃度。 用微粒體檢測UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性：步驟如下：（1）微粒體混合物（最終濃度大約0.05mg蛋白質(zhì)/ml），MgCl2（0.88mM）,葡糖二酸單內(nèi)酯（4.4mM）；丙甲素（0.022mg/ml）；含不同濃度底物的50mM磷酸鉀緩沖液（PH7.4）；最后加入3.5mM尿甙二磷酸葡萄糖醛酸(2)混合物在37孵化1030min；（3）加入170ul溶液(乙腈:冰醋酸94:6，其中含作為內(nèi)標物的100uM睪丸酮)終止反應。(5)數(shù)據(jù)計算與處理Caco- 2細胞模型表觀通透系數(shù)app=/(0)為t內(nèi)的轉(zhuǎn)運量，為膜面積，0為初始給藥濃度。吸收良好的藥物的表

34、觀滲透系數(shù)app 10-6c.s-1；吸收為1%100%的藥物表觀滲透系數(shù)app為0 .110-6110-6c.s-1；而吸收差的藥物(即吸收1%)的app 10-7c.s-1。大鼠腸灌注模型中黃酮類物質(zhì)的吸收公式如下：Mab=Q(CAin - CAout) Q：流速（ml/min）；：取樣間隔時間 30min；CAin 、C Aout 為進口管和出口管中苷元的濃度； 通過小腸排泄中的量計算公式如下： Mgut=QCMoutCMout為腸腔出口代謝物濃度通過膽汁排泄的變化量： Mbile=VCMbile CMbile為膽汁中代謝物的濃度；V為每30min收集的膽汁體積；吸收百分比和代謝百分比以

35、下式計算：吸收百分比=MabMtotal代謝百分比=MgutMtotalMtotal是30min內(nèi)灌注的藥物總量用方差分析或t檢驗來處理數(shù)據(jù)。P0.05或p0.05*關(guān)鍵技術(shù)：(1)HPLC、LC-MS、LC-MS-MS分析技術(shù)(2) ADME/Tox系統(tǒng)研究 4.本項目的特色與創(chuàng)新之處(1)從中藥活性成分吸收的角度闡述中藥炮制機理。(2)應用了ADME/Tox系統(tǒng)研究黃酮單體成分Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside的吸收、代謝機理與動力學及淫羊藿炮制品標準提取物中這5個主要活性成分的吸收與代謝及其相互作用。5.年度研究計劃

36、及預期研究結(jié)果*研究計劃(1)2006年1月2006年3月 淫羊藿藥材的品種與鑒定及炮制品制備(2)2006年4月2006年6月 淫羊藿炮制品Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside的含量變化，并用LC-MS，LC-MS-MS等分析手段對標準提取物中其他成分進行峰歸屬(3)2006年7月2006年9月 單體Epimedin A的吸收、代謝機理及HPLC、LC-MS分析其代謝產(chǎn)物(4)2006年10月2006年12月 單體Epimedin B的吸收、代謝機理研究及HPLC、LC-MS分析其代謝產(chǎn)物(5)2007年1月2007年3月

37、 單體Epimedin C的吸收、代謝機理研究及HPLC、LC-MS分析其代謝產(chǎn)物(6)2007年4月2007年6月 單體Icariin的吸收、代謝機理研究及HPLC、LC-MS分析其代謝產(chǎn)物(7)2007年7月2007年9月 單體Baohuside的吸收、代謝機理研究及HPLC、LC-MS分析其代謝產(chǎn)物(8)2007年10月2008年9月 淫羊藿生品與羊毛脂炙品標準提取物中Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside吸收代謝機理研究(9)2008年10月2008年12月 研究資料的匯總、整理等工作，進行評估和技術(shù)鑒定。*項目研究預

38、期成果及效益(1)從中藥活性成分吸收的角度闡明炮制的機理(2)在國內(nèi)中文核心期刊上發(fā)表論文2篇以上，在SCI源學術(shù)期刊上錄用2篇或以上。(3)完成淫羊藿藥材與炮制品的HPLC及LCMS分析；中藥淫羊藿中單體活性成分的吸收和代謝機理；利用ADME/Tox系統(tǒng)闡明淫羊藿炮制品中5個黃酮活性成分的吸收代謝機理及其相互作用，提交一套完整的研究資料。(二)研究基礎(chǔ)與工作條件1.工作基礎(chǔ)(1)淫羊藿藥材質(zhì)量控制藥材中水份的測定取供試品25g,平鋪于干燥至恒重的扁形稱瓶中，厚度不超過5mm，疏松供試品不超過10mm，精密稱定,打開瓶蓋在100105干燥5小時，將瓶蓋蓋好,移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定

39、重量，再在上述溫度干燥1小時，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計算供試品中含水量（%）。表1 藥材水份含量測定結(jié)果樣品號未干燥樣品重量（g）干燥后樣品減失重量（g）含水量（）12藥材中總黃酮含量的測定對照品溶液的制備：取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1ml含10g的溶液，作為對照品溶液。供試品溶液的制備：精密量取淫羊藿苷測定項下供試品溶液0.5ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。測定法：分別取供試品溶液和對照品溶液，以試劑為空白，照分光光度法(附錄A），在270nm波長處測定吸收度，計算，即得。表2 藥材中總黃酮含量的測定樣品號總黃酮含量

40、（）平均值（）123藥材中淫羊藿苷含量的測定色譜條件：Zorbax C18 柱（4.6*250mm，5um）；乙腈：水（30：70）為流動相；檢測波長為270nm；流速：1.0ml/min。標準品制備：稱取淫羊藿苷標準品適量，用甲醇配制成0.1mg/ml的標準品溶液。樣品制備：精密稱取淫羊藿炮制品約0.2g，精密稱定，于50ml居塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，密塞，超聲處理1小時，稱定，用稀乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法：分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜，測定。表3 藥材中淫羊藿苷的含量測定樣品號淫羊藿苷含量（）平均值（）123藥材指紋圖譜的建立

41、條件：色譜柱：C18柱（4.6150，5um）；流動相：A(0.5%冰醋酸溶液),B(乙腈)；B相濃度梯度洗脫：020min (25%B)，2045min(25%35%B)；流速:1.0 ml/ min ；檢測波長:272 nm；進樣量:20ul。樣品分析色譜圖見Fig 3。Fig 3 HPLC chromatographs of Epimedium(2)淫羊藿炮制研究酒制淫羊藿的炮制研究不同輔料用量對炮制品水份的影響表4 藥材水份含量測定結(jié)果樣品號含水量（）10輔料20輔料30輔料不同輔料用量對炮制品中總黃酮含量的影響表5 不同輔料用量炮制品中總黃酮含量的測定樣品號總黃酮含量（）10輔料20

42、輔料30輔料不同輔料用量對炮制品中淫羊藿苷含量的影響表6 不同輔料用量炮制品中淫羊藿苷含量的測定樣品號淫羊藿苷含量（）10輔料20輔料30輔料不同炮制時間對炮制品中含水量的影響表7 藥材水份含量測定結(jié)果樣品號含水量（）1.3min2.3min3.3min5.16不同炮制時間對炮制品中總黃酮含量的影響表8 不同炮制時間炮制品中總黃酮含量的測定樣品號總黃酮含量（）1.3min2.3min3.3min不同炮制時間對炮制品中淫羊藿苷含量的影響表9 不同炮制時間炮制品中淫羊藿苷含量的測定樣品號淫羊藿苷含量（）1.3min2.3min3.3min鹽炙炮制研究不同輔料用量對鹽炙炮制品水份的影響表10 藥材水

43、份含量測定結(jié)果樣品號含水量（）10輔料20輔料30輔料不同輔料用量對炮制品中總黃酮含量的影響表11 不同輔料用量炮制品中總黃酮含量的測定樣品號總黃酮含量（）10輔料20輔料30輔料不同輔料用量對炮制品中淫羊藿苷含量的影響表12 不同輔料用量炮制品中淫羊藿苷含量的測定樣品號淫羊藿苷含量（）10輔料20輔料30輔料不同炮制時間對炮制品中含水量的影響表13 藥材水份含量測定結(jié)果樣品號含水量（）1.3min2.3min3.3min不同炮制時間對炮制品中總黃酮含量的影響表14 不同炮制時間炮制品中總黃酮含量的測定樣品號總黃酮含量（）1.3min2.3min3.3min不同炮制時間對炮制品中淫羊藿苷含量的

44、影響表15 不同炮制時間炮制品中淫羊藿苷含量的測定樣品號淫羊藿苷含量（）1.3min2.3min3.3min羊脂炙炮制實驗研究不同用量對炮制品水份的影響表16 藥材水份含量測定結(jié)果樣品號含水量（）10輔料20輔料30輔料不同用量對炮制品中總黃酮含量的影響表17 不同輔料用量炮制品中總黃酮含量的測定樣品號總黃酮含量（）10輔料20輔料30輔料不同用量對炮制品中淫羊藿苷含量的影響表18 不同輔料用量炮制品中淫羊藿苷含量的測定樣品號淫羊藿苷含量（）10輔料20輔料30輔料不同炮制時間對炮制品中含水量的影響表19 藥材水份含量測定結(jié)果樣品號含水量（）1.0min1.3min1.5min不同炮制時間對炮制品中總黃酮含量的影響表20 不同炮制時間炮制品中總黃酮含量的測定樣品號總黃酮含量（）1.0min1.3min1.5min不同炮制時間對炮制品中淫羊藿苷含量的影響表21 不同炮制時間炮制品中淫羊藿苷含量的測定樣品號淫羊藿苷含量（）1.0min1.3min1.5min由上述實驗結(jié)果可以看出，淫羊藿經(jīng)過炮制后其總黃酮含量和淫羊藿苷含量都有不同程度的下降。臨床上常以羊油炙淫羊藿入藥，經(jīng)實驗表明，羊油炙淫羊藿中總黃酮含量以及淫羊藿苷含量較其他炮制品種的黃酮和淫羊藿苷含量高。（3