分子印跡固相萃取光譜法快速檢測豬肉中左氧氟沙星

1、分子印跡固相萃取光譜法快速檢測豬肉中左氧氟沙星摘要以表面接枝乙烯基的硅膠為載體，左氧氟沙星 為模板分子合成了選擇性識別左氧氟沙星的印跡聚合物。 使用元素分析、紅外光譜對制備的聚合物進行表征，通過動 態(tài)吸附及選擇性吸附進行性能測定。結果表明，此印跡聚合 物最大吸附量達56.33 mg/g印跡因子為2.62將所合成的 硅膠表面左氧氟沙星分子印跡聚合物用于實驗室自主開發(fā) 的分子印跡固相萃取漫反射光譜檢測裝置，對左氧氟沙星進 行定量分析。樣品經(jīng)此裝置固相萃取后，不經(jīng)洗脫，直接對 固相萃取介質進行漫反射光譜測定，簡化了操作過程，提高 了靈敏度。標準曲線的回歸方程為A=0.0496C+02412線性 范圍

2、為0.2尸9.0 mg/L相關系數(shù)R2=0.9924,檢出限為0.24 mg/L。豬肉樣品中的加標回收率為89.1%一92.0%,相對標準 偏差RSD為3.4%7.9%(n=3)。相比于傳統(tǒng)的富集分離技術， 本方法具有裝置小型化和集成化、靈敏度和選擇性高、成本 低、簡單快速等優(yōu)點。關鍵詞分子印跡；左氧氟沙星；固相萃??；漫反射 光譜1引言分子印?E聚合物是一種基于模板分子和功能單體之間 相互作用的選擇性富集材料。傳統(tǒng)的合成分子印跡的方法主 要有本體聚合法、原位聚合法和沉淀聚合法11但傳統(tǒng)方法 存在模板分子洗脫不完全、識別位點結合效率低、傳質速率 慢等缺點：21相比于其它方法，表面印跡制備技術在支

3、撐材 料的表面構建分子識別系統(tǒng)3一7。由于其識別位點位于材 料表面，使得模板分子更易與識別位點結合，可快速達到飽 和吸附，因此具有良好的熱穩(wěn)定性、較高的結合速率以及較 大的吸附容量8一10。目前常用的支撐印跡材料主要有硅膠 納米微球11, 12、硅膠納米管13及磁性納米微球等141膜富集在線漫反射光譜檢測技術，又稱膜固相萃取光譜 技術，在被測組分富集后不經(jīng)洗脫而在固相材料上直接測定 固相光譜，方法簡單、快速、靈敏，選擇性較好151 Wang 等16將膜固相萃取技術與紫外可見光譜結合，利用金屬離 子與絡合劑反應生成有色疏水絡合物，然后將有色絡合物富 集到濾膜上，無需洗脫，直接對濾膜上的物質進行檢

4、測。Li等 17對常規(guī)的膜富集過程進行改進，構建了一種多通道膜富 集裝置測定飲料和河水樣品中羅丹明B的濃度，利用多通道 富集裝置，將多個樣品富集在同一張膜上，最大限度減小實 驗中所用膜的差異性。Wei等18提出了一種快速、簡單、 靈敏的膜富集固相萃取結合漫反射光譜定量檢測光氣的方 法，操作簡單，背景干擾少。在膜固相萃取光譜技術基礎上，本研究選用分子印跡作 為富集材料，發(fā)展了一種分子印跡固相萃取在線漫反射檢測 技術，進一步提高了檢測目標分子的選擇性。以表面接枝乙 烯基的硅膠為載體，合成了左氧氟沙星印跡聚合物，并將此 聚合物應用于分子印跡固相萃取光譜技術中，實現(xiàn)了豬肉中 抗生素左氧氟沙星19的快速

5、檢測。2實驗部分2.1儀器與試劑Evolution 22紫外-可見分光光度計（賽默飛世爾科技有 限公司）；SHB三循環(huán)泵真空泵（上海衛(wèi)鎧水儀器設備有限 公司）；超聲波清洗器（上海聲彥超聲儀器有限公司）； DZF-6020真空干燥箱（上海予英儀器有限公司）；實驗用水 為超純水018.2 MQ?cm, SARTORIUS arium611DJGermany ）。HCl、甲醇（永華科技（江蘇）有限公司）；硅膠（200一 300目，上海盛亞化工有限公司）；甲苯、丙酮（國藥集團 化學試劑有限公司）；甲基丙烯酸（MAA ,上海凌峰化學 試劑有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA ,日本東 京化成工業(yè)株

6、式會社）；偶氮二異丁睛（AIBN）、3號基丙烯 酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH-570）、乙酸（上海晶純生化 科技股份有限公司）。2.2硅膠活化與硅烷化稱取硅膠10 g于250 mL圓底燒瓶中，加入150 mL 10%HCl, 110C攪拌12 h用超純水洗全中性，在120C下真空 干燥12 h以增加硅膠表面的羥基數(shù)目，并除去硅膠表面的 雜質。稱取活化好的硅膠，加入100山1甲苯、10 mL KH-570 在氮氣保護下110C回流12 h產物依次用甲苯、甲醇、丙 酮洗滌過濾，在60C條件下真空干燥過夜，得到表面硅烷化 偶聯(lián)劑的硅膠：612.3左氧氟沙星分子印跡聚合物(MIP )的制備稱取模板分子

7、01852 g(0.5 mmol)和功能單體MAA 0.1812 g(2 mmol)溶于 50 mL 甲醇-甲苯(9 : 1, V/V)混 合溶劑中，超聲30 min,靜置過夜。加入1 g硅烷化硅膠、 交聯(lián)劑 EDMA 10 mmol (2.0435 g、引發(fā)劑 AIBN 30 mg 反 復充氮排氧后密封，60C保溫并在磁力攪拌下反應24 h將 產物過濾，并用甲醇洗滌。用甲醇-乙酸(9： 1, V/V)索氏 提取，除去模板分子，直至提取液中未檢測到左氧氟沙星的 信號為止(采用紫外可見分光光度法檢測左氧氟沙星)。將 得到的MIP用丙酮沉降以及甲醇洗滌后，過濾，60C條件下 真空干燥12 h獲得左

8、氧氟沙星MIP。合成非分子印跡(NIP) 的過程與MIP過程相同，只是不加模板分子。2.4聚合物的表征2.4.1吸附動力學曲線的測定準確稱取MIP 20 mg至10 mL左氧氟沙星溶液的離心管中，室溫下分別振蕩5、10、20、 40、80和100 min離心，取上清液，用紫外可見分光光度計測量上清液的濃度。按照公式（1）計算吸附量Q （mg/g）Q=（C0-Cx）V/m（1）其中，C0為吸附前左氧氟沙星的初始濃度（mg/L）； Cx 為吸附后左氧氟沙星的平衡濃度（mg/L）； V為溶液的體積 （mL）； m為聚合物質量（g）。2.4.2吸附等溫線的測定準確稱取20 mg MIP全裝有10 mL

9、左氧氟沙星溶液的離 心管中，室溫下振蕩10 min離心，取上清液，用紫外可見 分光光度計測定吸附后上清液的濃度。NIP重復上述步驟。 根據(jù)吸附前后溶液中左氧氟沙星的濃度計算MIP及NIP的吸 附量。印跡因子是評價分子印跡特異性的重要參數(shù)，按照公 式（2）計算：a =QMIP/QNIP （2）其中a為印跡因子；QMIP為MIP平衡時的吸附量 （mg/g ） ； QNIP為NIP平衡時的吸附量（mg/g ）。2.4.3吸附選擇性的測定 準確稱取20 mg MIP,分別加 入10 mL 100 mg/L的左氧氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素標準溶 液，室溫下振蕩4 h離心，測上清液濃度。同樣處理NIP。 根

10、據(jù)公式（1）計算各自吸附量。用分配系數(shù)KD、選擇性系 數(shù)k和相對選擇性系數(shù)k考察聚合物的吸附特異性：KD = Qe/Ce k=KD 氧氟沙星/KDi, k = kMIP/kNIP其中，Qe （mg/g ）為平衡吸附量，Ce （mg/mL ）為吸 附平衡時上清液中左氧氟沙星等的濃度，KD和KDi分別為氧氟沙星和競爭分子的分配系數(shù)，kMIP和kNIP分別為MIP 和NIP的選擇性系數(shù)。2.5豬肉樣品的提取與凈化豬肉樣品購于本地超市，稱取10 g于50山1燒杯中，加 入10 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH=7）作為提取液，超聲10 min 后，3000 r/min離心5 min上清液移至另一燒杯中，向殘

11、渣中加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH =7），重復上述操作1次， 合并上清液。LC-C18固相萃取柱依次用2.0山1的甲醇、磷酸 鹽緩沖液淋洗活化，取上清液進行上樣，用10 mL甲醇洗脫 2次。收集洗脫液于50山1離心管中，備用。實際樣品豬肉 中末檢測出左氧氟沙星，向豬肉樣品中添加2、5和9 mg/L 的左氧氟沙星，測定回收率。2.6分子印跡固相萃取光譜的檢測本實驗利用所制備的印跡聚合物代替膜材料，進行固相 萃取光譜檢測。設計了專門的富集分離和光譜檢測裝置，如 圖1所示，此裝置含有能夠截留吸附材料的富集模塊5,模 塊上下有通道孔1和2,用于吸附材料的填裝和樣品溶液的 流入和流出。在真空或壓力的

12、作用下，樣品溶液通過富集模塊5上側 的孔道1流過吸附材料，進行富集和分離，濾液通過下方的 孔道2流出。此裝置的上下端均用反光鋁片3、4進行封裝， 側面使用鋁箔進行封裝，保證整個裝置不漏光。富集后，在 富集端直接測定漫反射紫外光譜。準確稱取60 mg MIP裝填于封裝型富集分離裝置中，富 集20 mL不同濃度的左氧氟沙星標準溶液或豬肉樣品洗脫液, 將裝置直接放置在紫外可見漫反射吸收光譜儀上檢測。3結果與討論3.1表面印跡材料的表征3.1.1元素分析活化硅膠和硅烷化硅膠的元素分析結 果表明，活化硅膠表面的碳、氫元素含量均低于050%；活 化硅膠表面接枝KH-570后，碳、氫元素含量分別提高到9.7

13、9% 和1.51%。表明硅烷化偶聯(lián)劑KH-570已成功接枝到硅膠表面。3.1.2紅外光譜分析 在活化硅膠的紅外光譜圖（圖2） 中，1103 cm1是SiOSi的伸縮振動峰，973 cm1是SiOH的伸 縮振動峰，3445和1635 cm1是OH的伸縮振動峰，表明硅 膠經(jīng)過酸活化后表面富含活性的羥基。由圖2可見，羥基的 相對強度明顯減弱，973 cm1處的SiOH吸收峰消失，硅烷化 后的CO的特征吸收峰在1721 cm1。表面印跡聚合物MIP的 紅外譜圖中，聚合物中酯基的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振 動吸收峰在1148 cm11廠21。3.2印跡聚合物對氧氟沙星的吸附性能吸附動力學實驗結果表明，在

14、010 min表面印跡材 料對左氧氟沙星的吸附量迅速增加，并達到平衡。吸附時間 明顯快于以沉淀聚合方法制備的聚合物23這是由于表面印跡方法制備的聚合物的識別位點暴露在外面，因而MIP具 有很快的傳質和吸附速度。隨著左氧氟沙星濃度的逐漸增大，印跡聚合物和非印跡 聚合物的吸附量也逐漸增加（圖3），當左氧氟沙星濃度大于 800 mg/L后，印跡聚合物的吸附量已趨于平衡。說明在此濃 度下，印跡聚合物對左氧氟沙星的吸附已經(jīng)達到平衡，處于 飽和狀態(tài)，吸附容量為56.33 mg/g在相同濃度下，MIP的 吸附量明顯高于NIP的吸附量，這是因為MIP中存在與左 氧氟沙星空間結構、尺寸大小、結合位點完全匹配的孔

15、穴， 這些特異性的結合位點增強了左氧氟沙星與印跡聚合物的 親和性。而非印跡聚合物缺少特異性結合位點，對左氧氟沙 星的吸附為非特異性的表面物理吸附，吸附容量為21.5 mg/g 吸附容量小。通過計算得出印跡聚合物的印跡因子為2.62 說明此印跡聚合物具有較高的特異性24 25。3.3印跡聚合物的選擇性能研究在相同的初始濃度下，印跡聚合物對左氧氟沙星的吸附 量遠大于四環(huán)素和恩諾沙星，說明此印跡聚合物對左氧氟沙 星具有良好的識別力。MIP對于四環(huán)素和恩諾沙星的選擇性 系數(shù)k分別為7.82和19.49, MIP相對NIP的相？ p三裥韻 凳？成別為1.05. 1.36以上結果說明，MIP對左氧氟沙星

16、具有良好的吸附能力（圖4）。3.4印跡聚合物在固相萃取光譜檢測中的應用將左氧氟沙星分子印跡聚合物材料裝填在圖1的裝置中, 富集不同濃度的左氧氟沙星標準溶液，富集后直接放置在紫 外可見漫反射吸收光譜儀上檢測光譜，檢測波長為297 nm， 圖5是標準曲線圖。線性方程為A=0.0496C+0.241? R2=0.9924, 線性范圍為02尸9.0 mg/L其中C為左氧氟沙星的濃度 (mg/L ), A為左氧氟沙星/甲醇溶液在297 nm下的吸光度值, 檢出限為0.24 mg/L(3。)。對豬肉樣品中左氧氟沙星進行了 檢測，結果見表1。左氧氟沙星在豬肉樣品中的加標回收率 為89.1%一92.0%, R

17、SD為3.4%一7.9% (n=3)。國標方法采用 液相色譜枝譜法檢測左氧氟沙星，步驟繁瑣、儀器要求高26 本方法簡單快速、易于操作、成本低、便于攜帶，有望應用 于大量樣品的現(xiàn)場快速篩查。4結論本研究合成了硅膠表面左氧氟沙星分子印跡聚合物，其 對左氧氟沙星有較強的吸附能力，吸附量為QMIP=56.33 mg/g,在10 min內接近飽和吸附，具有快速富集的能力。將 所合成的左氧氟沙星分子印跡聚合物與固相萃取光譜技術 相結合檢測左氧氟沙星，檢出限為0.24 mg/L對豬肉樣品進 行檢測，加標回收率在89.6%一92.0%之間，RSD為3.4%一7.9%, 可滿足實際分析要求。本方法簡單、快速，靈

18、敏度高，選 擇性好，為食品中抗生素的快檢提供了一種新方法。ReferencesWackerlig JSchirhagl R. Anal. C,hem016, 88(1):250-261Li ,Q Su H, Tan T. Biochem. Engineer. 2008, 38 (2)： 212-218Gao B An F Zhu Y.Polymr 2007， 48(8)： 2288-2297Xu，Xu W， Zhang X Yang Y. Microchim. Act2010, 171 (3): 441-449ZHOU Yan-Mei XU Wen-Guo , TONG Ai-Jun. Chi

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