各種ELISA樣本處理方法及步驟

1、各種ELISA樣本處理方法及步驟可用于ELISA實(shí)驗(yàn)的樣本一般有血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清以及組 織勻漿等。不同樣本類型的預(yù)處理方法也不同。適當(dāng)?shù)臉颖绢A(yù)處理是確保 ELISA實(shí)驗(yàn)正確性和準(zhǔn)確性的第一步。這里，我們將介紹幾種不同樣本類型的 處理方法。血清血清是ELISA實(shí)驗(yàn)最常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡(jiǎn)單。使用無(wú)熱原無(wú)內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在 室溫下放置2小時(shí)或4C過(guò)夜，分離出血清（建議傾斜試管或離心管以擴(kuò)大液 面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來(lái)）。4C下以1000 xg離心20分 鐘，小心收集上清液（血清），立即進(jìn)行測(cè)定。建議在-20C或-80C下將收集 的

2、血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。在收集血液樣本的過(guò)程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有 過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實(shí)驗(yàn)中將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反 應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另外，樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染， 因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。血漿使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，4C 下以1000 xg離心15分鐘，小心收集上清液（血漿）。建議在-20C或-80C 下將收集的血漿分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。常見(jiàn)的 抗凝劑包括EDTA，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀ELISA試劑盒說(shuō) 明書(shū)，查看該

3、試劑盒針對(duì)抗凝劑是否有特殊要求。細(xì)胞培養(yǎng)上清將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中并以1000 xg離心20分鐘，除去細(xì)胞 碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20C或-80C，避免反復(fù)凍融。細(xì)胞反復(fù)凍融方法：(1)吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈。懸浮細(xì)胞可以省略該步驟。 將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，以1000 xg離心10分鐘，然后吸去培養(yǎng) 基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次。加入適量的預(yù)冷PBS (建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑)重懸細(xì) 胞。在6孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔需要150-250的PBS來(lái)重懸細(xì)胞。使樣本在-20OC或-80OC條件和室溫條件

4、下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過(guò)程數(shù)次，直至細(xì)胞完全裂解。也可以使用超聲波細(xì)胞破碎器超聲處理懸浮液來(lái)裂解 細(xì)胞。 4C下以10,000 xg離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液，-20C或-80T保存，避免反復(fù)凍融。組織勻漿 用預(yù)冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜 質(zhì)。（2） 將組織塊稱重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。 加入適量的預(yù)冷PBS （體積取決于組織的重量，9 mL PBS適用于1 g組織，建議使用前立即在PBS中加入適量蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上 或冰浴中充分勻漿。 將勻漿液吸入離心管中，4C下以5000 xg離心510分鐘，收集上清液，保存至-20C或-80C，避免反復(fù)凍融。尿液、唾液及其他生物體液以1000 xg離心20分鐘，收集上清液，立即進(jìn)行測(cè)定。一般來(lái)說(shuō)，由于ELISA實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)的含量，因此要求樣本應(yīng)清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，-20C或-80C