一節(jié)根癌農桿菌Ti質粒課件教學教材

1、第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建Ti質粒的發(fā)現歷史1974年zeazen等從根癌農桿菌中分離出一巨大質粒，稱為致癌質粒（Tumor inducing plasmid）,簡稱Ti質粒.最初的發(fā)現和命名是1907年,Smith 和Townsent發(fā)現雙子葉植物常發(fā)生的冠癭瘤是由根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)誘發(fā)形成的.Ti質粒的遺傳特性及類型 Ti質粒為染色體外遺傳物質，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為9.51071.6108，大小為180250kb。 迄今人們已從多種植物中分離出了不同種類的農桿菌，它們的Ti質粒結構特性均有差別。 根據Ti

2、質粒誘導合成的冠癭堿(opine)種類不同，Ti質?？杀环譃樗姆N類型：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農桿堿型(agropine)、農桿菌素堿型(agrocinopine)或稱琥珀堿型(succinamopine)。 其中，章魚堿型和胭脂堿型Ti質粒較為常見。Ti質粒的基因位點及其功能區(qū)域Ti質粒結構示意圖（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的結構示意圖（右）（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNA regions）: T-DNA是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上脫離下來轉移并整合到植物的核基因組上的一段DNA。T-DNA片段上的基因與腫瘤形成有關。（2）Vir

3、區(qū)（virulence region）:該區(qū)段上的基因的產物為T-DNA的轉移及整合所必需，它導致農桿菌產生毒性，故稱之為毒區(qū)。在Vir區(qū)有VirA、 VirB、 VirC、 Vir D、VirE、 VirG、 VirH7個操縱子共24個基因。（3）Con區(qū)（regions encoding conjugations）:該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因（tra）,調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，故稱為結合轉移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（origin of replication）:該區(qū)段基因調控Ti質粒的自我復制，故稱為復制起始區(qū)（點）。LBRB

4、Ti質粒介導基因轉化的原理1. 植物受傷后會在傷口分泌出一些酚類物質(如乙酰丁香酮、-羥基乙酰丁香酮等)。2. 酚類物質誘導Ti質粒上毒性基因(vir)表達:當根癌農桿菌接觸到植物表面的受傷部位后，這些酚類小分子化合物誘導信號經VIR A蛋白傳遞給VIR G， VIR G激活其它vir 基因( virB、 virC、 vir D、virE )表達Ti質粒上毒性基因(vir)表達。3. T-DNA單鏈分子釋放： virD 基因編碼一種核酸內切酶，先在T-DNA右邊緣區(qū)(RB)切開一個單鏈缺口，再在同一鏈左邊緣區(qū)(LB)切開另一個單鏈缺口，使T-DNA以單鏈形式釋放出來。 4. T-DNA單鏈分子

5、轉移到寄主細胞：T-DNA單鏈分子與vir產物VIR D2蛋白共價結合，并在VIR D4和VIR B蛋白的幫助引導下穿過根癌農桿菌的內膜、外膜、細胞壁、以及植物的細胞壁、細胞膜和核膜。Ti質粒介導基因轉化的原理5. T-DNA整合到植物細胞的染色體中。 T-DNA單鏈分子進入植物細胞后，在植物有關酶體系的催化下，互補的雙鏈T-DNA分子,在RB序列的引導下，T-DNA分子整合到植物細胞的染色體中。6. T-DNA區(qū)域中的生長素和細胞分裂素基因過量表達導致細胞大量增值，形成冠癭瘤，隨著轉化細胞的增值，T-DNA也被大量擴增，冠癭堿合成基因的拷貝也隨之增加，這些基因表達后催化合成冠癭堿，為農桿菌的

6、生長提供碳源和氮源。土壤農桿菌與植物細胞相互作用的可能性機制酚類物質VIR A 由此可見，農桿菌對植物的侵染作用，就是一種天然發(fā)生的基因工程。一、Ti質粒的改造(一)Ti質粒1.定義 是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質,為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA大分子，其大小為180-240 kb。2.種類 2.1 根據冠癭堿的種類不同 章魚堿型(octopine); 胭脂堿型(nopaline);農桿堿型(agropine)和農桿菌素堿型(agrocinopine) or琥珀堿型(succinamopine)第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質粒基因轉化載體的構建第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建(一) Ti質粒

7、2.種類 2.2 根據功能區(qū)段不同 基因轉移T-DNA區(qū) (transferred DNA region)： 與基因轉移相關 毒性區(qū),即Vir區(qū) (Virulence region,Vir): 激活T-DNA轉移,使農桿菌對植物表現出侵染性的毒性區(qū) 接合轉移區(qū) (region encoding conjuation,Con) 調控Ti質粒在農桿菌間發(fā)生接合轉移 自我復制區(qū) (origin of replication,Ori) 調控Ti質粒自我復制第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建(二)天然Ti質粒存在的缺點1.缺點 野生型Ti質粒分子十分巨大； 野生型Ti質粒分子一般都為180-2

8、40 kb,幾乎無法進行基因工程的操作，所以應去除一切不必要的大片段DNA。 限制性內切核酸酶位點眾多； Ti質粒是分布著各種限制性內切核酸酶，難以找到可利用的單一限制性內切核酸酶位，因此很難通過體外DNA重組技術直接向野生型Ti質粒導入外源基因. T-DNA區(qū)段內含有許多編碼基因； 植物生長素合成酶基因,細胞分裂素合成有關酶基因等. 在大腸桿菌中不能復制。第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質粒基因轉化載體的構建(二)天然Ti質粒存在的缺點 2.改造 刪除T-DNA左右邊界中的tms、tmr和tmt基因,即切除T-DNA中onc基因,構建所謂的“卸甲載體”； 引入大腸桿菌的復制起點和選擇標記基因,或將Ti

9、質粒的T-DNA片段克隆到大腸桿菌的質粒當中,形成植物基因轉化載體系統,從而使通過Ti質粒的基因重組成為可能并有利于轉基因植物的篩選； 插入人工多克隆位點，以利于外源基因的克隆和操作；第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質粒基因轉化載體的構建 引入植物基因的啟動子和poly(A)信號序列，以確保外源基因在植物細胞內能正確高效地轉錄表達； 除去Ti質粒上的其他非必需序列，以最大限度地縮短載體的長度。 研究表明,大腸桿菌具有能與農桿菌高效地接合轉移的特性,因此,可以先將T-DNA的片段克隆到大腸桿菌的質粒中,并插入外源基因,最后通過接合轉移把外源基因引入到農桿菌的Ti質粒上. 中間載體: 帶有重組T-DNA的大

10、腸桿菌質粒衍生載體; 受體Ti質粒: 接受中間載體的Ti質粒.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建(三)御甲載體定義: 無毒的(non-oncogenic)Ti質粒載體,又稱onc-載體。 野生型Ti質粒中T-DNA中onc基因具有致瘤作用，因此,作為基因轉化的載體，必須切除T-DNA中的onc基因，即解除其武裝，構建成卸甲載體。在onc-卸甲載體中，已經缺失的T-DNA部位通常被大腸桿菌中的一種常用質粒pBR322取代.這樣任何適于克隆在pBR322質粒中的外源DNA片段,都可通過pBR322質粒DNA與卸甲載體的同源重組而被共整合到onc- Ti質粒載體上.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質

11、?；蜣D化載體的構建二、Ti中間表達載體的構建中間載體 定義:是指在一個普通大腸桿菌的克隆載體中插入了一段合適的T-DNA片段面構成的小型質粒。中間載體從功能上可分為兩大類: 1. 克隆載體: 復制和擴增基因 2.表達載體: 適于在受體細胞中表達外源基因的載體 Ti中間表達載體結構區(qū)包括: 選擇標記基因區(qū)域; 目的基因區(qū)域 每個區(qū)域由啟動子、基因和終止序列組成.二、Ti中間表達載體的構建(一)啟動子及調控序列 經由Ti質粒將外源基因整合到植物中并不一定就會發(fā)生基因的轉錄與表達，其先決條件在于必須要有合適的啟動子和調控序列。 真核生物基因調控序列中，大多數都具有“TATA”框，位于距離轉錄起始點

12、約30個核苷酸的上游區(qū)域，上游DNA的序列成分如“CAAT”(在上游-80 -70bp處)也普遍存在于許多真核生物基因的啟動子中。真核生物基因的3端具有AATAAA序列，從而使基因在轉錄過程中可以在mRNA的3端增加poly(A)的信號。第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建由AATAAA編碼的mRNA序列AAUAAA的作用是發(fā)出信號，讓核酸酶在此序列下游10-15bp 處切割mRNA,以便poly(A)聚合酶在切割點的3端加上100-200個腺苷酸.其作用是使mRNA的3端結合到內質網膜上,從而使3端穩(wěn)定,起到保護mRNA的作用.CaMV35

13、S啟動子Ubiquitin啟動子第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質粒基因轉化載體的構建二、Ti中間表達載體的構建(二)嵌合基因的構建嵌合基因: 來自兩種或兩種以上生物的啟動子,結構基因連接在一起而構成的基因.完整的嵌合基因: 完整,正確的可讀框,能正確表達,3端的終止信號.“植物特異性啟動子+目的基因+終止子”、“植物特異性啟動子+選擇標記基因+終止子”和“植物特異性啟動子+報告基因+終止子”，即是一種嵌合基因。三、Ti共整合轉化載體的構建共整合載體定義 指中間載體與改造后的受體Ti質粒之間,通過同源重組所產生的一種復合型載體.(一)Ti共整合載體的特點Ti共整合載體由兩個質粒組成,其中一個是E.col

14、i質粒中間載體,另一個是御甲Ti質粒組成.農桿菌中兩個質粒形成一個大的共整合載體.共合體的形成頻率與兩個質粒的重組頻率有關,相對較低.必須用Southern雜交或PCR對大的共整合體質粒進行檢測構建是比較困難.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建三、Ti共整合轉化載體的構建(二)Ti共整合轉化載體的類型和構建策略 基于中間載體與受體Ti質粒重組序列的不同,共整合載體可分為以pBR322序列為同源序列的轉化載體系統和基于左邊界內部同源區(qū)(LIH)的轉化載體系統,即SEV系統.1.基于pBR322同源序列的共整合載體的構建策略 此類載體系統的典型特點是在卸甲質粒的T-DNA區(qū)引入了pBR3

15、22,而中間載體是pBR322質?；蜓苌|粒,二者之間通過同源重組實現目的基因及選擇標記基因與卸甲Ti質粒的整合,進而以順式方式將基因轉化到植物細胞中去.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建1.基于pBR322同源序列的共整合載體的構建策略中間載體導入農桿菌pBR322及由其衍生的質粒為接合缺陷型,所以它們進入到農桿菌菌株中必須要有協助質粒,在協助質粒的動員下轉移到農桿菌中.三親雜交法:即將分別含有中間表達載體,協助質粒,受體質粒的菌液混合培養(yǎng),在混合培養(yǎng)過程中,通過雜交使協助質粒先轉移到含有重組中間載體的菌株中,然后中間載體再被動員和轉移到農桿菌中.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化

16、載體的構建1.基于pBR322同源序列的共整合載體的構建策略(2)中間載體與受體Ti質粒的同源重組 pGV1103中間表達載體導入農桿菌后,由于兩種質粒中都帶有pBR322同源序列,因此少部分質粒發(fā)生重組和交換,使少數中間載體整合到pGV3850的T-DNA區(qū)域內,形成一個大的共整合載體.沒有被整合的中間表達載體由于不能在農桿菌中復制,它將會隨著農桿菌的分裂增殖而自行消失.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質粒基因轉化載體的構建1.基于pBR322同源序列的共整合載體的構建策略(3) 共整合載體的選擇通過pGV3850和pGV1103質粒同源重組形成的共整合載體

17、能夠不斷復制和增殖,整合在Ti質粒中的中間載體隨同Ti質粒得豈到復制和增值.中間載體所帶有的抗性基因(Ampr,Kanr,Smr或strr)都能得到表達.此時含有共整合質粒的農桿菌將表現出中間載體攜帶的抗性標記,從而在含有相應抗生素的培養(yǎng)基上得到生長和篩選.未發(fā)生重組的pGV3850,pGV1103等均不能生長.含有共整合質粒的根癌農桿菌即可用于植物的轉化.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建1.基于pBR322同源序列的共整合載體的構建策略(3) 共整合載體的選擇整合后的Ti質粒含有重復的pBR322序列,此重復序列在農桿菌轉化植物細胞的過程中,與目的基因及選擇標記基因一起被整合到植

18、物染色體組上.但這種重復的序列有可造成基因的進一步重組及重排,從而影響外源基因的表達.因此,在對pGV3850系統進行改進的基礎上,獲得了pGV2260載體系統.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建1.基于pBR322同源序列的共整合載體的構建策略(3) 共整合載體的選擇pGV2260系統:來自章魚堿型Ti質粒的pTiB6S3,整個T-DNA序列連同25bp末端序列均被一段pBR322所取代。與pGV3850的區(qū)別在于pGV2260系統的中間載體必須在外源基因兩側連接25bp末端序列.共整合發(fā)生后,pGV2260系統中的pBR322重復序列在25bp末端序列以外,不會隨T-DNA一起整

19、合到植物染色體中.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建2.SEV系統的構建1985年美國孟山都公司的Fraley等建立了另一種共整合載體,即拼接末端載體(split-end vector,SEV)系統即T-DNA邊界拼接系統,也因為它的兩個“左邊界內部同源區(qū)”(left inside homology,LIH)序列在同源重組前分別處于不同質粒上而得名.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建2.SEV系統的構建構建過程:(1) SEV的受體Ti質粒是pTiB6S3-SE,來自野生型質粒pTiB6S3的突變體. 它的TL-DNA上的致瘤基因(onc)及TR都缺失,T-DNA的保留部分

20、被稱為LIH,即左邊界內部同源序列.該受體Ti質粒還保留了Vir基因及其他正常的功能基因,同時還攜有用于細菌篩選的卡那霉素抗性基因(Kanr).第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建(2)SEV中間載體是pMON200. 它含有一個胭脂堿合成酶基因,一個在細菌里編碼的壯觀霉素抗性基因(Sper),鏈霉素抗性基因(Strr)及在植物中作選擇標記基因的新霉素磷酸轉移酶基因(Npt ).此外,它還含有一個多克隆位點(MCS),可以方便地插入外源基因.更為重要的是它具有與受體Ti質粒同源的LIH序列及TR.從pMON200衍生出的一個新的質粒pCIT30具有更理想的特性. 質粒pCIT30中,潮

21、霉素抗性基因(Hygr)代替了MMiI基因,并且引入了一個cos位點和多克隆位點.在噬菌體包裝系統中可在cos位點上插入25-40kb的植物DNA,不需要額外的亞克隆步驟.多克隆位點上具有克隆和釋放插入DNA所需要的限制酶酶切位點。該載體還具有T7和S6細菌噬菌體啟動子，它們用于轉錄染色體步移中的末端特異性RNA探針.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質粒基因轉化載體的構建(3) 通過三親雜交將中間載體pMON200或pCIT30導入農桿菌后,由于它之間都具有LIH同源序列,即可發(fā)生同源重組,形成SEV的共整合載體.SEV包含有分別來自兩個質粒的左右邊界及Vir基因,成為一個完整的非致瘤性Ti質粒.由于中

22、間載體帶有抗性嵌合基因,因而轉化的植物可以直接進行篩選.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質?；蜣D化載體的構建(3)SEV系統與pGV3850系統的比較相同點: 兩者都是通過受全Ti質粒與中間載體同源重組而形成的,故同屬于共整合載體.不同點: 它們的受體Ti質粒與中間載體的結構不同. pGV3850的左右邊界(TL,TR)在一個受體Ti質粒上,而SEV來自兩個質粒,即TR來自中間載體. 同源序列不同. pGV3850重組的同源序列是pBR322,而SEV是LIH. SEV是更有效的共整合載體. pGV3850共整合載體轉化的植物中也帶有重復的pBR322序列.此重得序列可能對轉化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響,而SEV系則排除了這種可能,所以更為有效.第一節(jié) 根癌農桿菌Ti質粒基因轉化載體的構建四、Ti雙元轉化載體的構建雙元載體(binary vector)定義:是指由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的雙質粒系統.由于T-DNA與Vir基因分別位于兩個獨立的質粒上,Vir基因是通過反式激活的方式促成T-DNA的轉移,故稱為反式載體.通常含有T-DNA序列的穿梭載體用于攜帶嵌合基因,而含Vir基因的Ti質粒作為輔助質粒激活T-DNA的轉移。第一節(jié) 根癌農桿菌Ti