API使用培訓(xùn)(共32張)(PPT 32頁)

1、第1頁，共32頁。API系統(tǒng)-構(gòu)成:試條由特別選擇的生化反應(yīng)小管API試條有多種類 各有相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫 所有生化結(jié)果以同時(shí)間一并閱讀第2頁，共32頁。API系統(tǒng) 試條由10, 20, 50.測(cè)試組成不等 結(jié)果：鑒定百分率 基本單位：條目（Taxa)- 種(Pseudomonas Aeruginosa)- 生物型號(hào)(E. Coli 1)- 屬(Salmonella Spp.)- 一群菌種(Aeromonas hydrophilia/cavicie) 所引用的分類學(xué)跟國際認(rèn)可的一樣- International Journal of Systematic Bacteriology 資料庫整個(gè)系統(tǒng)的心

2、臟第3頁，共32頁。優(yōu)點(diǎn)：-標(biāo)準(zhǔn)化，簡(jiǎn)易化-在制造過程中，進(jìn)行質(zhì)控-FDA標(biāo)準(zhǔn)-用家可用ATCC菌種進(jìn)行質(zhì)控-系統(tǒng)化-操作簡(jiǎn)易-快速報(bào)告-20年經(jīng)驗(yàn)，擁有菌種資料25000，鑒定系統(tǒng)的發(fā)源生化測(cè)試750-1500文獻(xiàn)第4頁，共32頁。選條的標(biāo)準(zhǔn)第5頁，共32頁。革蘭氏陰性桿菌分類 革蘭氏陰性桿菌氧化酶 +非腸道菌鑒定API 20NE腸道桿菌鑒定API 20E氧化酶 -第6頁，共32頁。革蘭氏陽性桿菌分類革蘭氏陽性桿菌觸酶 -觸酶 +短小脫色含有異染顆粒slight discoloration(granulations)短球桿菌延長(zhǎng)狀桿菌細(xì)小不透光菌落20-25C 有動(dòng)力37C 無動(dòng)力李斯特菌鑒

3、定API Listeria乳酸菌鑒定API 50CHL棒狀桿菌鑒定API Coryne大體積產(chǎn)芽孢桿菌芽孢菌鑒定API 50CHB第7頁，共32頁。定向試驗(yàn)第8頁，共32頁。革蘭氏陽性球菌分類革蘭氏陽性球菌凝固酶葡萄球菌鑒定API STAPH觸酶 -觸酶 +金黃色萄葡球菌溶血鏈球菌鑒定API STREP+-第9頁，共32頁。-在細(xì)菌學(xué)里最普遍的染色方法革蘭氏染色步驟G()G()- 染色前，所有細(xì)胞是透明的- 結(jié)晶紫著色後用碘增加染料與菌體結(jié)合- 乙醇從G() 菌體洗脫結(jié)晶紫- 用番紅液復(fù)染，革蘭氏陰性菌呈粉紅色，革蘭氏陽性菌呈蘭紫色第10頁，共32頁。接解酶試劑- 原 理 - 傳統(tǒng)方法H2O2

4、2H2O + O2接 解 酶玻片法試管法第11頁，共32頁。氧化酶試驗(yàn)- 原 理 :TMPD氧化 TMPD氧 化 酶(TMPD = 2甲基一對(duì)一苯撐二胺)貨號(hào): 55922紙片:浸泡飽和TMPD儲(chǔ)存: 2-8C于暗處有效期: 1年組成: 2x30片小瓶裝 紙片貨號(hào): 70460儲(chǔ)存: 2-30C于暗處組成: 1個(gè)小瓶 液體試劑(深紫色)(透明)第12頁，共32頁。氧化酶紙片法第13頁，共32頁。液體 氧化酶試劑試劑方法:- 用2個(gè)試管載1-2ml無菌水- 第一管為陰性對(duì)照: 加一滴OX試劑- 第二管為測(cè)試管: 加可疑菌落然后再加二滴OX試劑- 比較二支管的顏色: 陰性對(duì)照:透明, 淺紫色 結(jié)果

5、:OX(-) : 透明,淺紫色OX(+): 紫色, 深紫色第14頁，共32頁。生化鑒定容易使用第15頁，共32頁。API結(jié)果原理：-生化結(jié)果組合跟資料庫內(nèi)的典型條目(Taxa)作出比較-經(jīng)計(jì)算後，鑒定百比率（%Id）機(jī)會(huì)率，指示出不同菌類的比較T值（T index）=指示出在同一個(gè)菌類的相似程度第16頁，共32頁。生化鑒定可靠及具創(chuàng)意的選擇最典型生化普菌種 XT 值資料庫生化結(jié)果 (菌種 X) (菌種X)第17頁，共32頁。API結(jié)果跟據(jù)T值及%Id的組合，作出評(píng)語：(i)Excellent Identification %Id 99.9及T0.75(ii)Very good Identifi

6、cation %Id 99.9及T0.75(iii)Good Identification %Id 90.9及T0.25(iv)Acceptable Identification %Id 80.0及T0(v)Doubtful profile其中一個(gè)生化反應(yīng)出現(xiàn)嚴(yán)重違反典型生化結(jié)果第18頁，共32頁。API 20E / Rapid 20E- 腸道桿菌科細(xì)菌在環(huán)境中及動(dòng)物產(chǎn)品中非常普遍，其中部份 (沙門氏、耶爾森氏)是致病菌-API 20E是常規(guī)鑒定中的標(biāo)準(zhǔn)-其他新鑒定系統(tǒng)比較的金標(biāo)準(zhǔn)-方便使用，4或24小時(shí)出報(bào)告第19頁，共32頁。API 20E試劑條接種要點(diǎn)先做氧化酶試驗(yàn)，氧化酶為陰性時(shí)接種A

7、PI 20E,氧化酶為陽性時(shí)接種API 20NE試劑條塑料培養(yǎng)盒中加水5 ml,放入試劑條，記錄標(biāo)本資料。取1個(gè)1mm 大小，1824hr菌齡的菌落，分散于5ml懸浮液（20150）中，使達(dá)0.5 Mac Farland 濁度。小心沿內(nèi)壁加菌懸液到微量生化杯中。其中：有U形框標(biāo)記的項(xiàng)目(CIT、VP、GEL)，將菌液加滿；有下劃線標(biāo)記的(ADH、LDH、ODC、H2S、URE、)，加好菌懸液后，用無菌液體石蠟封口。剩余的菌液可用于涂玻片、染色，接種于非選擇性平板做次代培養(yǎng)。蓋好孵育盒蓋，放置幾分鐘，觀察每個(gè)微量杯都應(yīng)呈陰性反應(yīng)的顏色。孵育盒放入37攝氏度溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。第20頁，共32頁。A

8、PI 20E反應(yīng)結(jié)果閱讀要領(lǐng)（）一、若GLU（葡萄糖）為陽性，則記錄GLU的結(jié)果，在TDA、IND、VP孔中加入相應(yīng)的附加試劑，1分鐘內(nèi)讀取TDA、IND的結(jié)果，510分鐘內(nèi)讀取VP的結(jié)果。同時(shí)讀并記錄取其它反應(yīng)的結(jié)果，用生化鑒定結(jié)果組成一個(gè)7位數(shù)編碼。二、若GLU(葡萄糖)為陰性，但有多于2個(gè)的反應(yīng)呈陽性，則按上述方法讀取并記錄結(jié)果。三、若GLU（葡萄糖）為陰性（非發(fā)酵菌），且其它呈陽性的反應(yīng)不多于2個(gè)，則不要加試劑，放回溫箱中再培養(yǎng) 24 hr后按第一條的方法讀取結(jié)果。同時(shí)用次代培養(yǎng)物接種2個(gè)API OF培養(yǎng)基證實(shí)葡萄糖代謝類型；接種1個(gè)API M培養(yǎng)基觀察動(dòng)力；劃線接種MacConkey

9、平板。培養(yǎng)24hr后將其結(jié)果記錄到API 20E報(bào)告單，與生化鑒定結(jié)果一起得到一個(gè)9位數(shù)編碼。第21頁，共32頁。API 20E反應(yīng)結(jié)果閱讀要領(lǐng)（）ONPG：淡黃色黃色為陽性，無色為陰性。ADH、LDC、ODC、URE以苯酚紅為指示劑，橙色紅色為陽性，黃色為陰性。CIT：管口處出現(xiàn)蘭色為陽性，黃色綠色為陰性。H2S：黑色為陽性，無色淺灰色為陰性。 TDA、IND、VP加試劑后出現(xiàn)紅色為陽性,不出現(xiàn)紅色為陰性。 GEL：黑色素?cái)U(kuò)散為陽性，不擴(kuò)散為陰性。GLUARA為糖類的酸化反應(yīng)，指示劑溴百里香酚蘭顯黃色為陽性，藍(lán)、綠色為陰性。第22頁，共32頁。GLU為陰性時(shí)，記錄其結(jié)果，并在GLU孔中按先后

10、順序分別加一滴NIT 1和NIT 2試劑，出現(xiàn)紅色時(shí) NO2為陽性，N2為陰性；不出現(xiàn)紅色時(shí)，加少許Zn粉，此時(shí)出現(xiàn)紅色，則NO2為陰性，N2為陽性。有動(dòng)力，MOB為陽性，無動(dòng)力則為陰性。 麥康凱平板上生長(zhǎng)，McC為陽性，不生長(zhǎng)為陰性O(shè)F培養(yǎng)管下部變色為發(fā)酵型，OF-F為陽性，下部不變色OF-F為陰性；OF培養(yǎng)管上部變色為發(fā)酵型，OF-O為陽性，上部不變色OF-O為陰性API 20E反應(yīng)結(jié)果閱讀要領(lǐng)（）第23頁，共32頁。API 20NE-非發(fā)酵G(-)桿菌存在于空氣、水及表面-部份細(xì)菌（如綠膿假單胞菌）為致病菌-試條主要由傳統(tǒng)生化反應(yīng)及同化反應(yīng)小管 所組成-64條目(Taxa)-非發(fā)酵G(-

11、)桿菌的標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法第24頁，共32頁。API 20NE試劑條接種要點(diǎn)（1）先做氧化酶試驗(yàn)，陽性者接種API 20NE。塑料培養(yǎng)盒中加水5 ml,放入試劑條，記錄標(biāo)本資料。取1824hr菌齡的菌落，分散于ml鹽水（20040）中，使達(dá)0.5 MacFarland 濁度（A液）。取A液200 ul(滴），加入AUX培養(yǎng)液中，小心混勻避免產(chǎn)生氣泡，制成同化試驗(yàn)接種液（B液）。用A液按API 20E相同的方法接種生化試驗(yàn)杯孔（NO3PNPG其中，GLU，ADH,URE用液體石蠟封口）第25頁，共32頁。用B液接種同化試驗(yàn)杯孔(下面有三條紅線者）。使液面與杯口平齊B液黏度很大，特別注意不要使菌懸液堵住

12、杯口，形成大的氣泡，影響反應(yīng)結(jié)果。嚴(yán)格無菌操作，避免空氣中的雜菌污染同化試驗(yàn)剩余的A液可用于涂玻片、染色，接種于非選擇性平板做次代培養(yǎng)。蓋好孵育盒蓋，放置幾分鐘，觀察每個(gè)微量杯都應(yīng)呈陰性反應(yīng)的顏色。孵育盒放入30攝氏度溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。API 20NE試劑條接種要點(diǎn)（2）第26頁，共32頁。API 20NE 技術(shù)要點(diǎn)同化試驗(yàn)項(xiàng)目接種要求- 接種液面與杯口平齊，太多或不足會(huì)造成錯(cuò)誤結(jié)果。第27頁，共32頁。API 20NE反應(yīng)結(jié)果閱讀要領(lǐng)（）一生化試驗(yàn)：不要打開塑料培養(yǎng)盒蓋，先讀取從GLU到PNPG的生化試驗(yàn)結(jié)果并記錄之在NO3杯孔中按先后次序分別加入一滴NIT1和NIT2試劑，出現(xiàn)紅色NO3為

13、陽性不出現(xiàn)紅色時(shí)，加少許Zn粉，此時(shí)出現(xiàn)紅色，則NO3為陰性，分鐘內(nèi)不出現(xiàn)紅色，則NO3陽性TPR杯孔中加一滴James試劑，立即出現(xiàn)紅色為陽性不出現(xiàn)紅色為陰性二同化試驗(yàn)：從杯口上方往下看，紅線模糊或菌懸液變渾濁，表明有菌生長(zhǎng)，為陽性否則，為陰性偶有弱生長(zhǎng)者可記錄為或第28頁，共32頁。三在報(bào)告單上做出一個(gè)位數(shù)編碼，查編碼手冊(cè)或API LAB軟件四如果，查不到編碼，或給出提示“IDENTIFICATION NOT VALID BEFORE 48-HR INCUBATION”,立即用液體石蠟將NO3和TRP封口繼續(xù)培養(yǎng)小時(shí),再讀結(jié)果而NO3 和TRP要記錄培養(yǎng)24小時(shí)的結(jié)果API 20NE反應(yīng)結(jié)果閱讀要領(lǐng)（）第29頁，共32頁。API STAPH-凝固酶陰性葡萄球菌于環(huán)境污染中常見-其中以金黃葡萄球菌為代表-以Kloos and Schleifer Classification為基礎(chǔ)-試條由傳統(tǒng)方法及發(fā)酵反應(yīng)小管組成-22個(gè)條目(葡萄球菌及微球菌)第30頁，共32頁。API STAPH 技術(shù)要點(diǎn)(i)附加試驗(yàn)第21 - 溶葡萄球菌素 (lysostaphi