TAE緩沖液教學(xué)內(nèi)容

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。TAE緩沖液TAE緩沖液：電泳緩沖液Tris-乙酸TAE緩沖液成分及終濃度：1、2mol/LTris堿2、1mol/L乙酸3、100mmol/LEDTA4、水配制1L的50TAE緩沖液各成分用量：1、Tris堿（242g）2、冰乙酸（57.1ml）3、EDTA【200ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0）】4、水（補(bǔ)足1L）50TAE緩沖液的配制方法：稱下列試劑，1L燒杯Tris242gNa2EDTA.2H2O37.2g然后加入800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加?7.1ml的醋酸，充分混勻。

2、加去離子水定容至1L，室溫保存。AE是使用最廣泛的緩沖系統(tǒng)。其特點(diǎn)是超螺旋在其中電泳時(shí)更符合實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量（TBE中電泳時(shí)測(cè)出的相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)大于實(shí)際分子質(zhì)量），且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%，電泳大于13kb的片段時(shí)用TAE緩沖液將取得更好的分離效果，此外，回收DNA片段時(shí)也易用TAE緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳。TAE的缺點(diǎn)是緩沖容量小，長(zhǎng)時(shí)間電泳（如過(guò)夜）不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。loadingbufferloadingbuffer的中文名字叫上樣緩沖液,6*的緩沖液中可以顯示兩條帶，前面的藍(lán)色的條帶是溴酚藍(lán)，代表的片段大小是300bp，后面的有點(diǎn)綠

3、色的條帶是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。loadingbuffer的功能主要有兩個(gè)。第一，里邊的指示劑溴酚藍(lán)和二甲苯酚起到指示的作用，顯示電泳的進(jìn)程，以便我們適時(shí)終止電泳；第二，里邊的成分甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大于TAE，從而沉降到點(diǎn)樣孔中，防止樣品飄出點(diǎn)樣孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都會(huì)寫(xiě)明。SDS主要是促使聚合酶變性，因?yàn)闆](méi)有除盡的聚合酶會(huì)結(jié)合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。細(xì)胞裂解后的裂解液，加loading100加熱，也是為了中止酶促反應(yīng)，防止提取的蛋白質(zhì)降解。6loadingbuffer一般配置：6Loadingbuffer:30mMEDTA

4、36%(v/v)Glycerol（甘油）0.05%(w/v)XyleneCyanolFF（二甲苯青FF)0.05%(w/v)BromophenolBLUE(溴酚藍(lán))5SDSLoadingBuffer配制方法組份濃度：250mMTris-HCl（pH6.8）10（W/V）SDS0.5（W/V）BPB50（V/V）甘油5（W/V）-巰基乙醇配制量：5mL配制方法：1.量取下列試劑，置于10mL塑料離心管中。1MTris-HCl1.25mLSDS0.5gBPB25mg甘油2.5mL2.加入去離子水溶解后定容至5mL。3.小份（500l/份）分裝后，于室溫保存。4.使用前將25l的2-ME加到每小份中

5、。5.加入2-ME的LoadingBuffer可在室溫下保存一個(gè)月左右1.生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定義聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR（英文全稱：PolymeraseChainReaction），HYPERLINK/image/9dc3cf58f0bc34ba800a181bo查看圖片t_blank聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具體內(nèi)容點(diǎn)擊：HYPERLINK/view/29641.htmt_blank聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，簡(jiǎn)稱PCR。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其英文PolymeaseChainReaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA

6、得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病病的診斷或任何有DNA,RNA的地方聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡(jiǎn)稱PCR）又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。由美國(guó)科學(xué)家PE（PerkinElmer珀金-埃爾默）公司遺傳部的Dr.Mullis發(fā)明，由于PCRPCR技術(shù)在理論和應(yīng)用上的跨時(shí)代意義，因此Mullis獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。技術(shù)原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟

7、動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在HYPERLINK/image/f29faa8faa51ccd5f01f36e5o查看圖片t_blank聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶-Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90以上的高溫而不

8、失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。工作原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)HYPERLINK/image/a1ad16fa953b7eac59ee90e7o查看圖片t_blank聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，

9、引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100

10、ulPCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)工作步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2.退火（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和

11、延伸同時(shí)在60-65間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-

12、12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(g=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。循環(huán)參數(shù)1、預(yù)變性（Initiald

13、enaturation）模板DNA完全變性對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，一般95加熱3-5分鐘。2、引物退火（Primerannealing）退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)（經(jīng)驗(yàn)）決定。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。3、引物延伸引物延伸一般在72進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定。4、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般95，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性：變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。5、循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。6、最后延伸在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72維持5-15分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。PCR-PC

14、R常見(jiàn)問(wèn)題電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否

15、因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部

16、分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)

17、高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交

18、叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引

19、物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2

20、+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)?？寺CR產(chǎn)物1)克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul2X連接液,50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4過(guò)夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4過(guò)夜。2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高

21、比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。3)如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ngDNA，用SOC稀釋到1000u后含10ngDNA，用1/1

22、0鋪板，共用1ngDNA。轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10（3次方）ng/鋪板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。C）如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4DNA連接酶替換。D）用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cf

23、u/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40藍(lán)斑,沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題？A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4過(guò)夜。B）插入片段帶有污染，使3-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy載體3-T缺失。C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚

24、體，不利于連接，DNA必需重新純化。D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú)A，后者是pGEM-T或pGEM-TEasy載體克隆所需。加TaqDNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資料（TM042）。E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞。反應(yīng)五要素參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)

25、計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物中有或能加上合適的

26、酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密

27、切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消

28、化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200

29、umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退

30、火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394min足以使模板DNA變性，若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G

31、+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(510)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080150核苷酸/S/酶分子7060核苷酸/S/酶分子5524核苷酸/S/酶分子高于90時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板

32、的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。HYPERLINK/view/2764.html#編輯本段2.電子信息學(xué)的光電導(dǎo)繼電器定義光電導(dǎo)繼電器簡(jiǎn)稱PCR（英文全稱：photoconductiverelay），采用固體半導(dǎo)體元件組裝而成無(wú)觸點(diǎn)開(kāi)關(guān)（接通和斷開(kāi)無(wú)機(jī)械接觸部件）優(yōu)點(diǎn)：開(kāi)關(guān)速度快工作頻率高使用壽命長(zhǎng)噪聲低工作可靠使用場(chǎng)合：取代常規(guī)電磁式繼電器，廣泛用于：數(shù)字程控裝置，數(shù)據(jù)處理系

33、統(tǒng)，計(jì)算機(jī)終端接口電路尤其：動(dòng)作頻繁防爆耐潮耐腐蝕的場(chǎng)合缺點(diǎn)：漏電流大接觸電壓高觸點(diǎn)單一使用溫度范圍窄過(guò)載能力差價(jià)格高基本特點(diǎn)控制功率?。狠斎牒苄〉目刂齐娏鞅隳苷９ぷ鳎敵霾捎么蠊β使芸煽毓杵骷?，具有功率放大作用可靠性：絕緣防水材料澆鑄，沒(méi)有可動(dòng)部件抗干擾能力強(qiáng)：無(wú)觸點(diǎn)動(dòng)作，無(wú)火花等電磁干擾，輸入/輸出之間隔離動(dòng)作快：直流SSR響應(yīng)時(shí)間幾十S過(guò)零交流SSR轉(zhuǎn)換時(shí)間10Ms（1/2fsf=50Hz）壽命長(zhǎng)：10121013次（普通電磁式繼電器105106次）承受的浪涌電流大：610倍額定值對(duì)電源電壓適應(yīng)范圍廣：交流SSR30220VAC任意選擇耐壓水平高：輸入/輸出介質(zhì)耐壓2.5kV以上分類按

34、切換負(fù)載性質(zhì)分：直流固態(tài)繼電器交流固態(tài)繼電器按輸入/輸出之間的隔離分：光電隔離磁隔離按控制觸發(fā)信號(hào)方式分：過(guò)零型非過(guò)零型有源觸發(fā)型無(wú)源觸發(fā)型工作原理（以光電耦合式SSR為例說(shuō)明）無(wú)輸入信號(hào)：T3截止，T4導(dǎo)通，VT1關(guān)斷（控制極被箝位在低電位）有信號(hào)輸入：T3導(dǎo)通，T4截止。當(dāng)電源電壓大于過(guò)零電壓（約25V），A點(diǎn)電壓大于T5的Vbe5T5導(dǎo)通，VT1控制極處于低電壓而關(guān)斷，VT2控制極無(wú)觸發(fā)信號(hào)而關(guān)斷。當(dāng)電源電壓小于過(guò)零電壓時(shí)，A點(diǎn)電壓小于T5的Vbe5T5截止，VT1控制極通過(guò)R5、R6分壓獲觸發(fā)信號(hào)VT2導(dǎo)通B、C兩點(diǎn)接通負(fù)載回路接通。VT2導(dǎo)通過(guò)程：電源電壓“+”：電源R8D6VT1D

35、9R9負(fù)載VT2控制極獲得觸發(fā)脈沖電源電壓“-”：電源負(fù)載R9D8VT1D7R8電源VT2控制極獲得觸發(fā)脈沖當(dāng)輸入信號(hào)取消后：T4導(dǎo)通VT1關(guān)斷但VT2仍導(dǎo)通（負(fù)載電流大于維持電流），直至負(fù)載電流隨電源電壓減小，下降到雙向晶閘管維持電流以下，VT2關(guān)斷，從而切斷負(fù)載電流。HYPERLINK/view/2764.html#編輯本段3.計(jì)算機(jī)學(xué)的程序控制暫存器定義程序控制暫存器簡(jiǎn)稱PCR（英文全稱：programcontrolregister），它經(jīng)歷了可編程序矩陣控制器C、可編程序順序控制器PSC、可編程序邏輯控制器PLC（英文全稱：ProgrammableLogicController）和可編

36、程序控制器PC幾個(gè)不同時(shí)期。為與個(gè)人計(jì)算機(jī)（PC）相區(qū)別，現(xiàn)在仍然沿用可編程邏輯控制器這個(gè)老名字。歷史1987年國(guó)際電工委員會(huì)（InternationalElectricalCommittee）頒布的PLC標(biāo)準(zhǔn)草案中對(duì)PLC做了如下定義：“PLC是一種專門為在工業(yè)環(huán)境下應(yīng)用而設(shè)計(jì)的數(shù)字運(yùn)算操作的電子裝置。它采用可以編制程序的存儲(chǔ)器，用來(lái)在其內(nèi)部存儲(chǔ)執(zhí)行邏輯運(yùn)算、順序運(yùn)算、計(jì)時(shí)、計(jì)數(shù)和算術(shù)運(yùn)算等操作的指令，并能通過(guò)數(shù)字式或模擬式的輸入和輸出，控制各種類型的機(jī)械或生產(chǎn)過(guò)程。PLC及其有關(guān)的外圍設(shè)備都應(yīng)該按易于與工業(yè)控制系統(tǒng)形成一個(gè)整體，易于擴(kuò)展其功能的原則而設(shè)計(jì)?！碧攸c(diǎn)可靠性高，抗干擾能力強(qiáng)PLC

37、用軟件代替大量的中間繼電器和時(shí)間繼電器，僅剩下與輸入和輸出有關(guān)的少量硬件，接線可減少到繼電器控制系統(tǒng)的1/101/100，因觸點(diǎn)接觸不良造成的故障大為減少。高可靠性是電氣控制設(shè)備的關(guān)鍵性能。PLC由于采用現(xiàn)代大規(guī)模集成電路技術(shù)，采用嚴(yán)格的生產(chǎn)工藝制造，內(nèi)部電路采取了先進(jìn)的抗干擾技術(shù)，具有很高的可靠性。例如三菱公司生產(chǎn)的F系列PLC平均無(wú)故障時(shí)間高達(dá)30萬(wàn)小時(shí)。一些使用冗余CPU的PLC的平均無(wú)故障工作時(shí)間則更長(zhǎng)。從PLC的機(jī)外電路來(lái)說(shuō)，使用PLC構(gòu)成控制系統(tǒng)，和同等規(guī)模的繼電接觸器系統(tǒng)相比，電氣接線及開(kāi)關(guān)接點(diǎn)已減少到數(shù)百甚至數(shù)千分之一，故障也就大大降低。此外，PLC帶有硬件故障自我檢測(cè)功能，出

38、現(xiàn)故障時(shí)可及時(shí)發(fā)出警報(bào)信息。在應(yīng)用軟件中，應(yīng)用者還可以編入外圍器件的故障自診斷程序，使系統(tǒng)中除PLC以外的電路及設(shè)備也獲得故障自診斷保護(hù)。這樣，整個(gè)系統(tǒng)具有極高的可靠性也就不奇怪了。硬件配套齊全，功能完善，適用性強(qiáng)PLC發(fā)展到今天，已經(jīng)形成了大、中、小各種規(guī)模的系列化產(chǎn)品，并且已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化、系列化、模塊化，配備有品種齊全的各種硬件裝置供用戶選用，用戶能靈活方便地進(jìn)行系統(tǒng)配置，組成不同功能、不同規(guī)模的系統(tǒng)。PLC的安裝接線也很方便，一般用接線端子連接外部接線。PLC有較強(qiáng)的帶負(fù)載能力，可直接驅(qū)動(dòng)一般的電磁閥和交流接觸器，可以用于各種規(guī)模的工業(yè)控制場(chǎng)合。除了邏輯處理功能以外，現(xiàn)代PLC大多具有完善的

39、數(shù)據(jù)運(yùn)算能力，可用于各種數(shù)字控制領(lǐng)域。近年來(lái)PLC的功能單元大量涌現(xiàn)，使PLC滲透到了位置控制、溫度控制、CNC等各種工業(yè)控制中。加上PLC通信能力的增強(qiáng)及人機(jī)界面技術(shù)的發(fā)展，使用PLC組成各種控制系統(tǒng)變得非常容易。易學(xué)易用，深受工程技術(shù)人員歡迎控制技術(shù)PLC作為通用工業(yè)控制計(jì)算機(jī)，是面向工礦企業(yè)的工控設(shè)備。它接口容易，編程語(yǔ)言易于為工程技術(shù)人員接受。梯形圖語(yǔ)言的圖形符號(hào)與表達(dá)方式和繼電器電路圖相當(dāng)接近，只用PLC的少量開(kāi)關(guān)量邏輯控制指令就可以方便地實(shí)現(xiàn)繼電器電路的功能。為不熟悉電子電路、不懂計(jì)算機(jī)原理和匯編語(yǔ)言的人使用計(jì)算機(jī)從事工業(yè)控制打開(kāi)了方便之門。系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、安裝、調(diào)試工作量小，維護(hù)方便，容易改造PLC的梯形圖程序一般采用順序控制設(shè)計(jì)法。這種編程方法很有規(guī)律，很容易掌握。對(duì)于復(fù)雜的控制系統(tǒng)，梯形圖的設(shè)計(jì)時(shí)間比設(shè)計(jì)繼電器系統(tǒng)電路圖的時(shí)間要少得多。PLC用存儲(chǔ)邏輯代替接線邏輯，大大減少