NGS在精準醫(yī)療中應(yīng)用課件

1、二代測序（NGS）技術(shù)在腫瘤精準醫(yī)療中的應(yīng)用典型的肺癌治療策略I期II期III期Iv期TNM治療策略原發(fā)腫瘤體積增大及侵犯淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移遠處轉(zhuǎn)移手術(shù)化療靶向治療晚期化療與靶向治療的抉擇化療靶向藥靶點非特異性特異性殺傷療效+毒副反應(yīng)+價格相對較低較高化療與靶向治療的抉擇靶向治療口服，在家靶向藥發(fā)展-肺癌JAMA. 2014;311(19):1998-2006. doi:10.1001/jama.2014.3741肺癌靶向藥物發(fā)展超過十年，晚期非小細胞肺癌中位生存期提高三倍以上，達到3.5年；生存質(zhì)量也大幅提高靶向治療與伴隨診斷先檢測EGFR突變先檢測ALK融合吃靶向藥前需要檢測對應(yīng)基因變異Month

2、:02468101214At risk:1692134887648425210331 病人存活比例(%)易瑞沙安慰劑中位生存期（月）5.65.11年存活率27%22%HR = 0.89 (0.78, 1.03), P = .11N = 1692, deaths = 969Cox analysis, P = .0421.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0易瑞沙-安慰劑ISEL研究，所有病人同時入組，用易瑞沙無獲益，但亞裔不吸煙肺腺癌患者獲益靶向治療與伴隨診斷NCCN NSCLC 2014V2 以前，晚期轉(zhuǎn)移NSCLC推薦EGFR及ALK檢測前文提及：DNA攜帶了全套遺

3、傳信息，很穩(wěn)定；但是總難免有差錯的時候，基因的DNA片段某個地方序列發(fā)生變化，和原來的DNA不同了，這就是基因變異。什么是基因變異？基因變異有哪些類型？突變：某個堿基變成另一個了插入缺失：某段序列插入了幾個或者丟失了幾個堿基基因變異有哪些類型？我們主要需要了解的幾種變異類型包括：點突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異（擴增、缺失）、重排（融合）拷貝數(shù)變異：人體內(nèi)每個基因原始都是兩份，如果某個基因超過了兩份或者少于兩份就是拷貝數(shù)變異重排：A基因的一段直接跟另外一個B基因融合在一起形成新的融合基因基因變異如何影響功能？蛋白質(zhì)的氨基酸序列最終是由DNA序列決定的，當DNA發(fā)生變異后很可能會影響蛋白質(zhì)功能。但

4、也不是一定會影響。（思考一下為什么）許多腫瘤的形成與基因變異有著密切的關(guān)聯(lián)，了解基因突變有利于了解腫瘤的發(fā)生?；蜃儺愑心男╊愋?？突變：某個堿基變成另一個了插入缺失：某段序列插入了幾個或者丟失了幾個堿基基因變異有哪些類型？我們主要需要了解的幾種變異類型包括：點突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異（擴增、缺失）、重排（融合）拷貝數(shù)變異：人體內(nèi)每個基因原始都是兩份，如果某個基因超過了兩份或者少于兩份就是拷貝數(shù)變異重排：A基因的一段直接跟另外一個B基因融合在一起形成新的融合基因靶向治療與伴隨診斷NCCN NSCLC 2014V2 以前，晚期轉(zhuǎn)移NSCLC推薦EGFR及ALK檢測靶向藥伴隨診斷靶向藥伴隨診斷傳

5、統(tǒng)分子診斷手段FISHIHCBRAC1/2 等點突變，插入缺失EGFR、HER2、BRAF、KRAS等基因的點突變、插入缺失SANGER測序檢測ALK、ROS1、RET等融合，HER-2擴增等Arms-PCR檢測融合（蛋白），HER-2、VEGFR擴增（高表達）等樣本微量高侵入性腫瘤異質(zhì)性液體活檢對低豐度變異的高敏感性檢測多基因與多變異形式的平行檢測傳統(tǒng)分子診斷手段的挑戰(zhàn)NGSNGSNGS高通量（千萬序列/次）多基因平行測序檢測準確、靈敏采樣提取基因組基因組片段化形成測序文庫+。二代測序（NGS）一代測序：Sanger法，單基因測序二代測序：高通量測序NCCN 指南關(guān)于NCCL靶向藥伴隨診斷建

6、議檢測基因型靶向藥通用名生產(chǎn)廠商商品名英文名腺癌人群比例（中國）EGFR突變厄洛替尼瑞士羅氏特羅凱erlotinib42-52%吉非替尼英國阿斯利康易瑞沙gefitinib阿法替尼德國勃林格殷格翰GilotrifafatinibALK重排/融合克唑替尼美國輝瑞賽可瑞crizotinib6-7%色瑞替尼瑞士諾華ZykadiaCeritinibshiHer2突變曲妥珠單抗瑞士羅氏赫賽汀trastuzumab1%阿法替尼德國勃林格殷格翰GilotrifafatinibBraf突變威羅菲尼瑞士羅氏Zelborafvemurafenib2%達拉菲尼英國葛蘭素史克TafinlardabrafenibMet

7、擴增克唑替尼美國輝瑞賽可瑞crizotinib5%色瑞替尼瑞士諾華ZykadiaCeritinibshiRos1重排/融合克唑替尼美國輝瑞賽可瑞crizotinib1%色瑞替尼瑞士諾華ZykadiaCeritinibshiRet重排/融合卡博替尼美國ExelixisCometriqcabozantinib1%Kras突變K-ras突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益,反而徒增不良反應(yīng)危險和治療費用7%Koh Y, et al. 2013 ASCO Abstract 7525. NGS檢測優(yōu)勢-更多用藥機會美國foundation medicine公司在文獻中報道：FMI利用NGS技術(shù)檢測了2

8、000個腫瘤FFPE樣本，在76%的腫瘤組織中都檢測到了actionable的變異，3倍于傳統(tǒng)金標準；平均每個樣本檢測到3.06個變異，其中1.57個為actionable的變異。燃石的多基因平行檢測，與傳統(tǒng)檢測方法相比，同樣能在更大概率上發(fā)現(xiàn)多actionable驅(qū)動突變（多陽性）的案例平行檢測優(yōu)勢-多陽性檢出傳統(tǒng)檢測方法為什么檢測不到多陽性1. 逐項檢測EGFR：ARMS檢測ALK：FISH檢測KRAS：ARMS檢測ROS1, MET, HER2 2. 標本用量大病理評估EGFR：ARMS檢測ALK：FISH檢測樣本沒了3. 檢測基因少突變豐度NCCN:EGFR和ALK檢測可以并入多重/二

9、代（NGS）測序分子檢測。NCCN強烈推薦比現(xiàn)有方法更高通量的分子檢測，篩查商品化靶向藥的靶點突變，或適當建議病人參加臨床實驗。多部指南對二代測序（NGS）方法的推薦ASCO將會根據(jù)臨床經(jīng)驗，把更多地分子靶標列入檢測范圍。在標本有限的前提下，現(xiàn)有方法對每個分子單獨檢測將會非常困難。而新的檢測方法（如NGS）可以進行多位點同時檢測，在臨床中對比傳統(tǒng)方法有很大的優(yōu)勢。ESMO:多通道平行檢測，例如二代測序技術(shù)（特指Panel檢測組合），可同時分析多個可能的靶向藥靶點變異，是一種節(jié)約成本和標本的檢測方法。已有充分質(zhì)控表明，這是一種適合臨床使用的突變檢測方法。強烈推薦多基因平行檢測-更精確的分子分型，

10、更多靶向用藥機會逐項檢測 vs 平行檢測： 節(jié)約時間，不遺漏多陽性；提示突變豐度，提供更多信息；節(jié)約檢測成本與樣本用量；基于捕獲的NGS能覆蓋基因全外顯子，熱點+罕見+未知變異位點精準治療首先要精準診斷NGS方法的優(yōu)勢NGS與精準醫(yī)療的發(fā)展 - 首先要精準診斷William Pao, Lancet Onc. 2011新分子分型不斷被發(fā)現(xiàn)精準分子分型-精準醫(yī)療靶點不斷增加與細分需要多基因檢測-明確分子分型需要多種變異類型全覆蓋需要契合臨床實際情況-腫瘤異質(zhì)性/樣本稀缺性美國NCIMATCH計劃3000名不同癌種患者NGS檢測143基因20余種靶向藥物根據(jù)分子分型精準治療NGS在腫瘤精準醫(yī)療中的應(yīng)

11、用Part 1靶向藥物的優(yōu)勢醫(yī)生為何用NGS吃靶向藥先伴隨診斷NGS比傳統(tǒng)伴隨診斷優(yōu)勢精準醫(yī)療NGS與腫瘤精準醫(yī)療NGS的應(yīng)用及產(chǎn)品線燃石技術(shù)優(yōu)勢Outline臨床檢測樣本來源組織血液手術(shù)活檢：穿刺等其他：胸水等血漿白細胞產(chǎn)品線癌種產(chǎn)品名靶向藥物用藥指導基于組織肺癌朗克TM 朗康TM乳腺癌燃石貝康TM結(jié)直腸癌燃石凱康TM胃腸道間質(zhì)瘤燃石吉康TM胃癌燃石蓋康TM胰腺癌燃石帕康TM腎癌燃石瑞康TM泛癌種OncoscreenTM無創(chuàng)靶向藥物用藥指導基于血液ctDNA肺癌燃石朗清TM泛癌種燃石普清TM燃石靶向用藥指導產(chǎn)品線下一個問題：檢測哪些基因告訴醫(yī)生為什么要測這些基因 要有臨床意義病人情況不一樣：

12、經(jīng)濟條件、能取得的樣本 提供不同選擇1. 組織 - 朗克 -8基因入選基因均有NCCN指南推薦，證據(jù)充分朗克靶向藥物指導alectinibEGFR TKIEGFR TKI第二代EGFR-TKI 阿法替尼 EGFR/ERBB2/ERBB4EGFR TKIAZD9291獲批，針對EGFR-TKI治療進展T790M攜帶患者，TagrissoKRAS基因位于EGFR下游，正常時EGFR給信號才暫時激活往下游傳遞突變型KRAS導致蛋白持續(xù)激活此時即使無EGFR活化信號仍處于激活狀態(tài)，導致細胞增殖失控。對EGFR的抑制可能失去作用。在NSCLC中突變率高，西方人群肺腺癌約20-30%通常與其他驅(qū)動突變互斥

13、有證據(jù)表明Kras基因突變與靶向藥的耐藥相關(guān)。深入了解癌基因的情況、了解各種癌癥的發(fā)展預(yù)后重要指標。KRAS基因檢測臨床意義醫(yī)生可以得到什么信息？目標患者：肺癌初診患者傳統(tǒng)檢測EGFR陰性患者產(chǎn)品目標群體產(chǎn)品優(yōu)勢1.入選基因均有NCCN指南推薦，證據(jù)充分2.NGS同時檢測8個基因的突變、融合以及擴增等多種變異3.靶向藥物治療與基因突變對應(yīng)明確，便于解讀4.可檢測1%的低豐度突變6.直銷與入院合作等多種合作模式結(jié)合5.價錢合理，周期短7.已知+未知全覆蓋，快速響應(yīng)研究進展靶向藥物靶點少數(shù)證據(jù)比較充分的化療敏感位點組織樣本NGS檢測產(chǎn)品- 朗康-56基因 臨床實驗信息肺癌II/III期臨床實驗在研

14、藥物 - 入組其他癌種獲批藥物-跨適應(yīng)癥用藥依據(jù)分子分型由醫(yī)生做決策考慮療效+毒副反應(yīng)在標準治療失敗后；籃子試驗：相同分子分型的不同癌種放一起做臨床實驗；代表：ALKoma，ALK在NSCLC, 淋巴瘤、腎癌、神經(jīng)母細胞瘤等均為驅(qū)動基因。正在進行中的克唑替尼A8081013臨床試驗（吳一龍）為什么測56基因哪些客戶需要測56基因初診：跟朗克差不多價格，多測很多基因，且節(jié)約標本量常規(guī)初診陰性復發(fā)/耐藥收集點數(shù)據(jù)，做做科研藥物代謝及毒性相關(guān)基因（SNP）-化療敏感性及毒副作用指導位點為什么這么少？跟靶向藥不同，大部分沒有非常充足的證據(jù)及數(shù)據(jù)庫支撐5-FU類藥物化療敏感位點5-FU類藥物有哪些呢？氟

15、尿嘧啶(化學名：5-FU)、希羅達（化學名：卡培他濱）、替加氟、卡莫氟（孚貝）、氟脲苷等。基因檢測有據(jù)可查美國FDA明確指出：在使用5-FU，卡培他濱時，建議檢測DPYD基因型。中國國家衛(wèi)生部在新的臨床檢驗項目目錄中，也增列了5-FU用藥指導的基因檢測。血液檢測產(chǎn)品-朗清晚期；無法穿刺 / 患者不愿意穿刺；經(jīng)濟條件能承擔；Heitzer et al. Genome Medicine 2013, 5:73 朗清測的是什么？ - ctDNA （循環(huán)腫瘤DNA）ctDNA檢測的特點可在DNA水平上檢出突變+融合NCCN指南明確推薦的用藥指導相關(guān)靶點全覆蓋所有NSCLC中突變熱點（用藥指導相關(guān)與否）全

16、覆蓋大幅增加ctDNA檢出敏感性代替組織活檢進行用藥指導進行治療后復發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)控比影像學更靈敏EGFR敏感性及抗藥性突變ALK/ROS1/RET融合及抗藥性突變MET 14號外顯子可變剪切突變及擴增BRAF V600E等熱點突變HER2 20號外顯子插入突變肺癌-ctDNA panel 設(shè)計理念-朗清-168 可準確檢測0.2%的超低豐度突變； 唯一可以在血液中檢測融合的方法（ALK等） IB-IIIA 的檢測敏感性60% IIIB-IV 的檢測敏感性 85% 所有樣本的特異性 98%朗清的主要特點組織測出來的變異，血液能否檢測出來推廣策略目標患者：晚期肺癌初診患者（無法穿刺或者手術(shù)）治療后（用

17、藥或手術(shù)）的復發(fā)監(jiān)測靶向藥物的耐藥機制科研目標科室：呼吸科 、 腫瘤內(nèi)科Sample from internal data 用藥指導肺腺癌晚期，傳統(tǒng)檢測（EGFR，ALK，ROS1，MET）陰性，病人只能計劃接受化療，經(jīng)醫(yī)生推薦試試看的心態(tài)送檢了朗清ctDNA檢測。BLPR結(jié)果提示：根據(jù)cMET 14外顯子點突變結(jié)果服用克唑替尼，病人PR，該位點在血液中的變異豐度降低，提示治療效果。 Sample from internal dataSample from internal data 通過ctDNA檢測對病程實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)控肺腺癌晚期，經(jīng)I代EGFR-TKI治療后耐藥，后一直服用III代EGFR-

18、TKI，全身其他病灶PR，但肝區(qū)腫塊PD，4/2經(jīng)第一次ctDNA檢測發(fā)現(xiàn)ALK融合，后經(jīng)克唑替尼治療3個月后血中ALK融合消失，近期ctDNA開始檢出EGFR T790M與C797S突變4.26.36.307.278.17T790M出現(xiàn)ALK融合消失C797S出現(xiàn)血液檢測開發(fā)方向NCCN指南明確推薦8-基因熱點區(qū)域超深度測序液體活檢初診無法穿刺的患者有針對性的用藥指導168-基因TCGA熱點突變區(qū)域超深度測序液體活檢晚期患者用藥后或手術(shù)患者術(shù)后復發(fā)監(jiān)測靶向治療耐藥機制NGS在腫瘤精準醫(yī)療中的應(yīng)用Part 1靶向藥物的優(yōu)勢醫(yī)生為何用NGS吃靶向藥先伴隨診斷NGS比傳統(tǒng)伴隨診斷優(yōu)勢Part 2組

19、織樣本血液樣本燃石提供哪些NGS產(chǎn)品組織8/56為什么放這些基因；適用的患者；血液168血檢優(yōu)勢、產(chǎn)品特性精準醫(yī)療NGS與腫瘤精準醫(yī)療NGS的應(yīng)用及產(chǎn)品線燃石技術(shù)優(yōu)勢OutlineNGS測腫瘤的公司那么多，為什么要選燃石燃石技術(shù)有什么優(yōu)勢嗎？基于捕獲Capture基于多重PCRAmpliconIlluminaLife建庫實驗方法測序儀器測序深度NGS在腫瘤伴隨診斷領(lǐng)域的方法選擇1000X300-500X決定能測什么決定測序數(shù)據(jù)準不準決定變異能不能被檢出EGFR exon19EGFR exon21KRAS exon2多重PCR針對已知位點設(shè)計特異性引物測序優(yōu)勢方便，建庫步驟少，時間短；起始量低（

20、2-6 FFPE）Amplicon 技術(shù)原理（了解）Amplicon 技術(shù)原理（了解）EGFR exon19EGFR exon21KRAS exon2多重PCR測序缺陷1.擴增效率不一致-無法檢測拷貝數(shù)變異，無法報告突變豐度；2.僅檢測熱點區(qū)域；3.僅能RNA水平檢測融合EGFR Gene AGene BKRAS Gene C片段化，加入相同接頭探針雜交目的基因全外顯子EGFR 全外顯子KRAS 全外顯子Capture 技術(shù)原理（了解）捕獲相同引物擴增測序不足1.步驟多；2.起始量要求高一些；優(yōu)勢1. 擴增效率一致，可以檢測拷貝數(shù)變異及突變豐度；2. 全外顯子-可檢測所有變異位點；3. DNA

21、水平檢測融合Capture 技術(shù)原理（了解）Amplicon vs Capture -檢測變異類型的差別變異類型點突變插入缺失融合擴增Amplicon僅熱點區(qū)域突變僅通過RNA檢測組織樣本血液無法檢測融合XCapture檢測所有已知+未知突變通過DNA樣本檢測所有融合事件可檢測并提供擴增倍數(shù)值代表基因EGFR, KRAS, BRAFEGFR, ERBB2ALK, ROS1, RETMET, ERBB2注：基于Amplicon無法報告突變豐度IlluminaLife測序儀器NGS在腫瘤伴隨診斷領(lǐng)域的方法選擇決定測序數(shù)據(jù)準不準illuminaMiseq，通量適合，數(shù)據(jù)質(zhì)量好，非常適用于臨床。Nex

22、tseq 500 集合高通量與臺式測序儀的簡約，通量靈活（中、高通量兩種模式）；各廠家主流測序儀-Thermo fisher-LifeLife-Proton運行時間短，價格低適用于panel或外顯子組測序Life-PGM運行時間更短，通量低適用于小基因組等Illumina 測序平臺基于光信號的測序原理Life 測序平臺基于電信號的測序原理Illumina vs life邊合成邊測序的方法提供了極高的準確性，但犧牲了部分測序時間。半導體測序的方法速度快，但由于微電流的干擾，測序無法避免隨機的Indel較多以及準確率低的問題。Illumina MiseqIllumina Nexseq 500Lif

23、e PGMLife Proton通量6G40/120G2G10G數(shù)據(jù)質(zhì)量Q30Q30Q17Q17測序周期24 h24 h4 h4.5+4+4 h分析開源開源自動化的黑匣子優(yōu)點小結(jié)數(shù)據(jù)質(zhì)量高可精確檢測低豐度突變與插入缺失可進行個性化定制化分析通量小靈活性高測序周期短無需生物信息學支持適用腫瘤組織與ctDNA體細胞突變檢測無創(chuàng)產(chǎn)前或胚系點突變檢測Illumina life測序儀比較Q30：0.1%錯誤率Q17：1.5%錯誤率測序深度：某位點被測了多少次3. 測序深度AA.參考基因組序列測序得到的序列GAAGAAGA1000條=1000X此位點測序深度1000X，A是野生型，G是突變型例：EGFR

24、21E什么叫突變豐度突變豐度=4/14=28.5%未突變的DNA來自正常組織或腫瘤中的其他亞克隆EGFR L858組織需要多少測序深度？平均測序深度檢測到突變的概率豐度為20%的突變豐度為10%的突變豐度為5%的突變豐度為2%的突變平均測序深度500X可以觀測到95%的5%低豐度突變事件500X0.95為何選擇1000X測序深度？1000X的測序深度能保證大部分低豐度變異不被漏檢，不造成假陰性，不使病人失去靶向治療機會；很多重要的驅(qū)動突變在組織檢測中突變豐度很低，臨床上需要較高測序深度以增加低頻變異的檢出；Nature Medicine,6 April 2014; doi:10.1038/nm

25、.3519.血液檢測需要多少X？-國際頂尖雜志數(shù)據(jù)CAPP-Seq技術(shù)待測樣本DNA基于捕獲目的區(qū)域富集超深度測序數(shù)據(jù)分析測序深度10000報告解讀1. 包含 COSMIC+TCGA數(shù)據(jù)已知驅(qū)動基因+文獻報道的變異區(qū)域2. 基因共139個，包含融合檢測區(qū)域后Panel大小125kb CAPP-Seq檢測突變豐度下限非常靈敏，適用于ctDNA檢測，同時對于NSCLC人群變異的覆蓋度很高 檢測成本合理，適于臨床應(yīng)用 不僅可應(yīng)用于NSCLC，未來可能應(yīng)用于攜帶不同腫瘤基因型的各種實體瘤II-IV期的NSCLC中100%能檢測到ctDNA變異I期的NSCLC中50%能檢測到ctDNA變異96%的病人都可以檢測到變異，最低檢測到0.02%的變異平均每個樣本檢測到4個變異結(jié)果與文章意義血液需要多少X？在ctDNA中，來自正常組織的DNA量大大增多，因此朗清需要比朗康更深的深度和更精致的分析方法來甄別假陽性與真陽性EGFR L858思考一下：為什么血液中很難檢