基因工程與基因重組

1、基因重組與基因工程1生物工程定義 生物工程是生物技術的總稱，是對生命有機體在分子水平、細胞水平、組織水平、個體水平進行不同層次的創(chuàng)造性設計和改造，使之能定向組建具有特定性狀的新物種或新品系，從而造福人類的現(xiàn)代應用技術學科。2生物技術的四大體系基因工程細胞工程酶工程發(fā)酵工程3 重組DNA技術（recombinant DNA technique），又叫DNA克?。―NA cloning）。在體外將各種來源的遺傳物質同源的或異源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA與載體DNA結合成一具有自我復制能力的DNA分子（復制子），繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增

2、，以獲得該DNA分子的大量拷貝。這類克隆是在分子水平上操作，故又稱分子克隆（molecular cloning）。一、重組DNA技術相關概念（一）DNA克隆4 由于DNA克隆研究對象常常是特異的基因片段，所以又稱作基因克隆（gene cloning）。實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關工作統(tǒng)稱為基因工程（genetic engineering）。51997年2月23日英國 Wilmut6 從復雜的生物有機體基因組中，分離出目的基因片段。 用合適的酶切割目的基因和載體，產生匹配的末端 在體外，將目的基因片段連接到能自我復制的并且具有 選擇標記的載體分子上，形成重組DNA分子。 將重組DNA分子轉移到

3、適當?shù)氖荏w細胞（亦稱宿主細胞）， 并與之一起增殖。 篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆。從篩選出的陽性克隆中提取出擴增的目的基因片段，供進一步研究使用?；蚩寺〉幕静襟E7基因克隆的基本步驟8粘性末端質粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端9酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質粒DNA分子10重組質粒目的基因大腸桿菌轉(轉化)染色體真好玩!11篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌12大量生長提取大量質粒酶切鑒定13您已經掌握基因克隆的主要步驟！分離目的基因和載體DNA。用合適的酶切割上述兩者，產生匹配的末端。連接酶將目的基因裝入載體。轉入細菌。篩選具

4、有抗藥性克隆。14（二）重組DNA中的工具酶 限制性核酸內切酶 連接酶 聚合酶 多聚核苷酸激酶 堿性磷酸酶151. 限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）定義：能識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內切酶。 主要來源于原核生物，可將侵入宿主細胞的外源性DNA迅速降解，而對細菌自身的DNA，則通過甲基化酶在該限制酶切位點甲基化修飾而保護自身的DNA不被降解。限制性內切酶和甲基化酶共同構成細菌的限制和修飾系統(tǒng)。限制性內切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。16限制酶的命名 限制酶的命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定。通常有三個斜體字母

5、的縮寫表示。第一個大寫字母取自細菌屬名的第一個字母；第二、三個小寫字母取自微生物種名的頭兩個字母；第四個字母代表該微生物同種內不同的株系；如果同一株名發(fā)現(xiàn)幾種限制酶，則根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序，用羅馬數(shù)字表示。例如，從大腸桿菌（Escherichia Coli）RY13株中發(fā)現(xiàn)分離的第一種限制酶，稱為EcoR I。17限制性內切酶的分類和特點 根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割DNA方式不同，可分為 I、II、III型。重組DNA技術中常用的是II型限制性內切酶。II型酶作用特點是有嚴格的識別、切割順序，以內切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產生的DNA片段5 端為磷酸基，3 端為羥基。識別

6、順序一般為46個堿基，通常是回文結構（palindrome）。18回文結構 II類限制性核酸內切酶識別DNA 位點的核苷酸序列呈二元旋轉對稱，通常稱這種特殊的結構順序為回文結構。 EcoR I 5 GAATT C3 3 C TTAAG5 19II型酶切割雙鏈DNA產生3種不同的切口： 在對稱軸中心同時切割雙鏈，產生平末端或稱鈍性末端（blunt end），如Hpa I：5 GTTAAC3 Hpa I 5 GTT AAC33 CAATTG5 3 CAA TTG 5 20 在對稱軸兩側相對位點分別切割一條鏈。從 5 端切割產生 5 端突出的粘性末端，如EcoRI ：5 GAATT C3 EcoR

7、I 5 G AATTC33 C TTAAG5 3 CTTAA G 5 從3 端切割產生3 端突出的粘性末端。如Pst I：5 C TGCAG3 Pst I 5 CTGCA G33 GACGT C5 3 G ACGTC 5 21表15-2一些常用的限制性內切酶位點22 一些限制酶雖然識別序列不完全相同，但能產生相同類型的粘性末端，稱為同尾酶，所產生的末端稱配伍末端（compatible end），可進行相互連接。產生平末端的酶切割DNA后，也可彼此連接。23 連接酶可催化DNA分子中相鄰5 磷酸和3 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接。常用的有T4（噬菌體）

8、DNA連接酶和E.Coli DNA連接酶。2. DNA連接酶3. 聚合酶 重組DNA技術中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA為模板在體外合成DNA或RNA?？煞譃镈NA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。24 名稱 功能及應用大腸桿菌DNA聚合酶I 以DNA為模板，催化5 3 核酸鏈的延長，另有3 5 的外切酶 大片段 （klenow） 活性。常用于DNA 3 末端的標記和填充、cDNA第二鏈的合成、 DNA測序。Taq DNA聚合酶 以DNA為模板，催化5 3核酸鏈的延長，另有弱的5 3的外切 酶活性，耐高溫。常用于PCR及DNA測序。末端轉移酶 催化NTP中的NMP通過

9、其磷酸基與DNA 3 -OH連接而使DNA鏈 延長，無需模板。常用于3 端標記或形成DNA共聚尾巴。逆轉錄酶 以RNA為模板，合成cDNA鏈（5 3），另有RNA酶H活性。常 用于cDNA第一、二鏈的合成及反轉錄PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶 以DNA為模板合成RNA。常用于離體條件下，合成單鏈RNA作為 雜交探針。25 T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）催化ATP的-磷酸基轉移至DNA或RNA的5 末端羥基上。常用于單鏈或雙鏈DNA和RNA探針的5 端標記。4. 多聚核苷酸激酶5. 堿性磷酸酶 牛小腸堿性磷酸酶（calf intestinal alkalin

10、e phosphatase, CIP），催化DNA或RNA的5 磷酸基水解。常用于去除線狀載體DNA兩端的5 磷酸基團，防止載體自身連接環(huán)化；也用于用32P標記DNA的5 末端之前除去原來的5 磷酸基。26 應用重組DNA技術有時是為分離、獲得某一感興趣的基因或DNA片段，或是獲得感興趣的表達產物 蛋白質。這些感興趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有兩種類型，即cDNA和基因組DNA。（三）目的基因（target gene）27（四） 基因工程載體基因載體：或稱克隆載體（cloning vector）,是在基因工程中為“攜帶”感興趣的外源DNA（目的基因、外源基因）、實現(xiàn)外源DNA的無

11、性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子，具有自我復制和表達功能。其中，為使插入的外源DNA 序列可轉錄、進而翻譯成多肽鏈而特異設計的克隆載體又稱表達載體。 28 能自主復制并能帶動插入的目的基因一起復制。 具有一個以上的單一限制性酶切位點（多克隆位點，multiple cloning sites），以便目的基因的 插入。 具有合適的篩選標記（如抗藥性基因，酶基因等），以 便篩選陽性克隆。 載體分子量小，以便容納較大目的基因，拷貝數(shù)高。 在細胞內穩(wěn)定性高，以便確保重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。理想載體應具備的基本條件29載體的分類 質粒（plasmid） 噬菌體（phage） 病毒（vir

12、us） 克隆載體（cloning vector） 表達載體（expression vector）常用的載體按來源分為載體按得到的產物分類可分為30質粒（plasmid） 質粒是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，能在宿主細胞獨立自主地進行復制，并在細胞分裂時保持恒定地傳給子代細胞。質粒帶有某些遺傳信息，會賦予宿主細胞新的遺傳性狀。因為質粒DNA有自我復制功能及攜帶遺傳信息等特性，可作為重組 DNA操作的載體。染色體質粒31 pBR322 質粒圖譜氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克隆位點32噬菌體載體 噬菌體是一種細菌病毒，可作為克隆載體。目前使用的噬菌體載體主要有噬菌體衍生物載體、M

13、13噬菌體載體等。除M13噬菌體載體外，這類載體的特點是其容量比質粒載體大，即可插入較大的外源DNA片段（如20kb以上）?？梢栽隗w外包裝產生感染性很高的噬菌體顆粒。33噬 菌 體頭部尾部尾絲34 噬菌體 噬菌體（lambdla bacteriophage）是一種大腸桿菌病毒，為線性雙鏈DNA，它的兩端各有12個堿基的互補粘性末端，稱COS位點。當噬菌體侵入宿主細胞，兩個粘性末端互補結合，形成環(huán)狀分子。DNA在體外可包裝成病毒顆粒，并高效感染大腸桿菌。35 噬菌體侵入細菌后，即可裂解生長（環(huán)狀DNA在細菌中多次復制，合成大量噬菌體基因產物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌），又可以溶源生長（噬菌體

14、DNA整合到細胞染色體基因組DNA中，與染色體DNA一起復制，并遺傳給子代細胞，宿主細胞不被裂解）。36噬菌體感染細菌示意圖裂解生長37 噬菌體基因組中有較大區(qū)域僅與溶源生長有關，而對裂解生長并非絕對需要，因此可以缺失或被外源DNA取代。經改造的噬菌體衍生載體可分兩類: 一類是插入型載體，即外源基因插入到載體上單一的限制酶位點，如gt系列等。 另一類是置換型，即兩個限制酶位點之間的DNA片段可被外源DNA取代，如Charon，EMBL系列等。3839 M13噬菌體載體 M13噬菌體基因組是單鏈環(huán)狀DNA，當它侵犯宿主菌后，在細菌胞內酶的作用下，單鏈DNA轉變成復制型雙鏈DNA，可提取出來做基因

15、重組。 經改造的M13噬菌體有M13 mp系列和pUC系列。40 M13噬菌體載體pUC19互補：單獨存在的及 片段都沒有半乳糖苷酶的活性，只有宿主細胞與克隆載體同時表達兩個片段時，宿主細胞內才有 半乳糖苷酶活性，使特異性作用物（X-gal）變?yōu)樗{色化合物。突變型lac- E.coli表達-半乳糖苷酶的 片段。如果插入的外源基因是在lacZ基因內，就會影響lacZ的表達，利用lac- E.coli為轉染或感染細胞，在含X-gal的培養(yǎng)基上生長時會出現(xiàn)白色菌落；若無外源基因插入，則出現(xiàn)藍色菌落。多克隆位點編碼-半乳糖苷酶的片段41病毒載體 是一類真核載體，能把基因引入到 真核細胞中，并在其中被表

16、達。因此是研究真核細胞表達及調控的有力工具。如:腺病毒、逆轉錄病毒、乳頭瘤病毒等。42二、重組DNA技術基本原理 目的基因的獲取 克隆載體的選擇和構建 外源基因與載體的連接 重組DNA導入受體菌 重組體的篩選 克隆基因的表達43（一）目的基因的獲取 化學合成法 基因組DNA cDNA 聚合酶鏈反應441. 化學合成法 已知某種基因的核苷酸序列，或根據(jù)某種基因產物的氨基酸序列推導出編碼該多肽鏈的核苷酸序列，再利用DNA合成儀通過化學合成原理合成目的基因。 利用該法合成的基因有：人生長激素釋放抑制因子、 胰島素原、 腦啡肽、干擾素基因等452. 基因組DNA 利用限制性核酸內切酶將染色體DNA切割

17、成一定基因水平的許多片段，將這些片段與適當?shù)目寺≥d體拼接成重組DNA分子，繼而轉入受體菌擴增，使每個細菌內都攜帶一種重組DNA分子的多個拷貝。 不同細菌所包含的重組DNA分子可能為不同的染色體DNA片段，這樣全部轉化細菌所攜帶的各種染色體片段就代表了染色體的整個基因組。存在于轉化細菌內、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合稱為基因組DNA文庫（genomic DNA library）。基因組DNA文庫涵蓋了基因組全部的遺傳信息。46 建立基因組文庫后，需結合適當篩選方法從眾多轉化子菌落中選出含有某一基因的菌落，再進行擴增，將重組DNA分離、回收，以獲得目的基因。473. cDNA 把細

18、胞總mRNA通過逆轉錄合成總cDNA，再與適當載體連接后轉入受體菌，從而得到含有某種生物體全部cDNA集合（稱為cDNA 文庫，cDNA library）。然后用適當?shù)姆椒◤腸DNA文庫中篩選出目的cDNA。48 cDNA文庫的特點是它只包括已經被轉錄成mRNA的那些基因序列，且不包括內含子及調控序列，所以cDNA文庫的復雜性要比基因組文庫低的多。 但由于不同的細胞類型、發(fā)育階段以及細胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達所決定的，因此各自的mRNA種類就不同，由此產生的cDNA又是獨特的。與基因組DNA文庫類似，由總mRNA制作的cDNA文庫包含了細胞表達的各種mRNA信息，自然也含有我們感興趣

19、的編碼cDNA。494. 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR） 參見437頁50Chain ReactionPolymerase chain reactionPCR的產物數(shù)目以指數(shù)級方式增長中子的釋放數(shù)目以指數(shù)級方式增長中子原子核短時間內巨大的能量釋放，原子爆炸DNA片段Cycle 1Cycle 2Cycle 3Cycle N理論上可達2n個拷貝原料（pg） 產物(ug)51PCR 的基本原理體外高效、快速、特異地擴增目的基因或DNA片段的技術。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合

20、酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復性及延伸的溫度與時間等，使目的DNA得以迅速擴增 52DNA的體內復制：原料：模板DNA（基因組DNA），隨機小分子RNA引物，dNTPs酶：DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶反應條件：胞液環(huán)境，37 反應過程：模板DNA解旋、引發(fā)體的形成、延長（三階段）產物：模板DNA （基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍 原料：模板DNA（基因組DNA ，cDNA）一對特異性寡核苷酸引物，dNTPs酶：Taq DNA聚合酶反應條件：合適的緩沖液，三種變化的溫度（94，50-70，72 ），一定的循環(huán)數(shù)（25-35）反應過程：DNA模板變性（解鏈）、 模板與引物退火 、引物延伸 （三

21、階段，多循環(huán)）產物：目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍PCR：53DNA模板變性與體內DNA解鏈過程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過95左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA 54模板與引物退火 PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時的引物（primer）,這兩個引物分別與待擴增模板DNA的目標片段兩端的序列互補。在降低溫度的過程中，通過控制退火條件，引物就能準確地與擴增區(qū)域的兩端配對。primers55引物短，不易纏繞；設計的引物是與模板DNA兩端序列互補；引物的量遠大于模板分子的量，引物與模板DNA形成雙鏈的幾率遠遠高于DNA分子自身的復性。 56引物延伸在PCR反應體系中

22、的DNA聚合酶，能夠催化反應體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物53方向，按堿基配對的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補的復制鏈。Taq 酶dNTPS 新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應的模板。 57 熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán) 每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴增DNA產量是呈指數(shù)上升的，即n個循環(huán)后，產量為2n拷貝。而實際上，PCR的擴增倍數(shù)為（1+X）n，X為擴增效率，平均為75% 熱變性-復性-延伸25-35 次循環(huán)百萬倍擴增58盡管PCR擴增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴增并不是一個無限制的過程。在正常的反應條件下，經30次循環(huán)之后，酶的催化

23、反應趨于飽和，就會出現(xiàn)平臺效應 (Plateau) ，產物的量不再增加?！捌脚_效應”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。 59（三）外源基因與載體的連接（二）克隆載體的選擇 粘性末端連接 平端連接 同聚物加尾連接 人工接頭連接601. 粘性末端連接 外源DNA片段與載體用同一種限制性內切酶切割，獲得相同的粘性末端，相互互補配對，在DNA連接酶作用下，形成重組DNA分子。5CCG G3 5C CGG33G GCC5 3G GC C 5Hpa II612. 平端連接 因載體分子和目的DNA分子之間并不一定都產生互補的粘性末端，有的限制性內切酶只能切成平末端。平末

24、端仍用T4DNA連接酶連接，只是效率低，需要的DNA濃度更高。623. 同聚物加尾連接 同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如polyG與poly C之間的退火作用完成連接。 在末端轉移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如將poly（dC）加到雙鏈DNA片段3 羥基上，而將poly（dG）加到質粒載體3 羥基上，制造出粘性末端，然后進行粘性末端連接。634. 人工接頭連接 接頭（linker）是指人工合成的一段雙鏈寡核苷酸，其中包含一個（或兩個）酶切位點。首先將接頭與目的DNA片段進行平末端連接，繼而用適當?shù)膬惹忻笇⒔宇^部位切出粘性末端，最后與載體進行粘性末端連接。64（四）重組體導入受體

25、細胞 在分子克隆中，將質?；蛞运鼮檩d體構建的重組分子導入受體細胞的過程稱為轉化（transformation）。 以噬菌體和真核病毒作載體構建的重組分子導入受體細胞的過程稱為轉染（transfection）。 基因片段（特別是純化的DNA）很難直接導入受體細胞，通常將受體細胞預先加以處理，使其提高基因導入細胞的效率。例如用低溫CaCl2（冰?。┨幚泶竽c桿菌，可以大大提高質粒的轉化效率。這種經過預處理的、容易導入外源核酸分子的受體細胞被稱作“感受態(tài)細胞”（competent cell）。65（五）重組體的篩選 通過轉化、轉染等方式，重組體DNA分子被導入受體細胞，經適當涂布的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到大量轉

26、化子菌落或轉染噬菌斑。因為每一重組體只攜帶某一段外源基因，而轉化或轉染時每一受體菌又只能接受一個重組體分子，所以設法將眾多的轉化菌落或噬菌斑區(qū)分開來，并鑒定哪一菌落或噬菌斑所含的重組DNA分子確實帶有目的基因，即可得到目的基因的克隆，這一過程即為篩選（screening）。66 根據(jù)載體體系、宿主細胞特性及外源基因在受體細胞表達情況不同，可采取不同的篩選方法。1.直接篩選法 （1）抗藥性標志篩選 （2）標志補救 （3）分子雜交法2.非直接篩選法 免疫學方法67抗藥性標志篩選 如果克隆載體攜帶有某種抗藥性標志基因，如Ampr或Tetr，轉化后只有含這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含該抗生素的培養(yǎng)板

27、上生存并形成菌落，這樣就可將轉化菌與非轉化菌區(qū)別開來。 如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內，如插入Tetr內，使標志基因Tetr失活，陽性重組子則不能在含有Tet的培養(yǎng)板上生長。用插入失活篩選的重組子載體往往帶有另一個抗生素抗性基因如Ampr，因此可以通過雙抗生素對照篩選，即陽性轉化子可以在含Amp的培養(yǎng)板上生長而不能在含Tet的培養(yǎng)板上生長。68標志補救 若克隆的基因能夠在宿主菌內表達，且表達產物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補，則可以利用營養(yǎng)突變菌株進行篩選，這就是標志補救（marker rescue）。-互補：通過藍白斑篩選可以篩選、鑒定重組體與非重組體載體。69當外源基因插入后，LacZ基

28、因被破壞，不能合成完整的-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成藍色菌落。70分子雜交法（molecular hybridization）參見435頁71核酸分子雜交（molecular hybridization）：指用標記的已知DNA或RNA片段（探針）檢測樣品中未知核酸序列，通過堿基互補配對原則發(fā)生同源性結合，再經顯影或顯色的方法，將結合的核酸序列的位置或大小顯示出來。探針：帶有可檢測標記的已知序列的DNA或RNA片段。核酸分子雜交的基本原理變性（denaturation）復性（renaturation） 雜交（hybridization）

29、預雜交（prehybridization）72變性（denaturation）概念：在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙股螺旋或發(fā)夾結構打開，有規(guī)則的結構被破壞，形成單鏈分子。變性的因素：加熱、酸、堿、尿素、甲酰胺等增色效應（hyperchronic effect）：核酸變性時，紫外吸收值A260隨之升高的現(xiàn)象。73熱變性 DNA的熔解曲線Tm值（melting temperature）:熱變性時，50%DNA分子變性的溫度。又叫解鏈溫度、熔解溫度。74復性（renaturation） 概念：在適當條件下，變性DNA的兩條互補單鏈重新締合，形成雙鏈的過程。

30、熱變性后，緩慢降低溫度至比Tm值低20-30時，變性的單鏈DNA可恢復其雙鏈結構，稱為退火。雜交（hybridization） 來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補可形成異源雙螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA雜交分子。75預雜交（prehybridization） 概念：為了減少探針與廣泛存在的非互補核酸的非特異性結合，在雜交前用封閉物將這些非特異性位點封閉。這一雜交前的處理過程稱為預雜交。 常用的封閉物：變性的非特異性DNA，如鮭魚精子DNA、小牛胸腺DNA，又稱為覆蓋DNA。76變性、復性、雜交示意圖77核酸探針：帶有可檢測標記的已知DNA或RNA片段，用于檢測待測

31、樣品中的靶核酸序列。探針分類放射性標記核酸探針非放射性標記核酸探針78印跡雜交 概念：指將待測核酸序列結合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進行雜交的過程。 探針與待測核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針分子顯示的位置及其量的多少可反應出待測的核酸分子是否存在相應的基因序列及其大小。 分類DNA印跡雜交（Southern blotting）RNA印跡雜交（Northern blotting）79提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉移到NC膜與DNA或RNA探針雜交放射自顯影DNA印跡雜交（Southern blotting）檢測靶分子為DNA, 檢測靶分子是否含有目的

32、基因80將瓊脂糖凝膠上的DNA分子轉移到硝酸纖維素膜上81 菌落原位雜交（In situ hybridization）含有與探針互補序列的菌落或噬菌斑經放射自顯影后，在X光底片上出現(xiàn)雜交點。將轉化后得到的菌落或噬菌斑原位轉移到NC膜上，得到一個與平板菌落或噬菌斑分布完全一致的復制品。原位裂解細胞，堿變性，核酸分子被固定于膜上加入標記的DNA或RNA探針進行雜交根據(jù)陽性反應位置，可從保留的母板上挑出所需的陽性克隆。82RNA印跡雜交（Northern blotting） 檢測靶分子為RNA。主要用于檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平，或比較不同組織或細胞的同一基因的表達情況。 與S

33、outhern blotting不同的是在轉移前不需進行限制性內切酶切割。 83核酸雜交分類表雜交方法適 用 范 圍Southern 印跡檢測經凝膠電泳分開的DNA分子，需轉印到膜上Northern 印跡檢測經凝膠電泳分開的RNA分子，需轉印到膜上斑點雜交檢測未經分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑雜交檢測固定在膜上的、經裂解后從細菌或噬菌體中釋放出的DNA分子原位雜交檢測細胞或組織中的DNA或RNA分子84免疫學方法 免疫學篩選是利用特異抗體與目的基因表達的抗原產物相互作用進行篩選，特異性和敏感性也較高，尤其適用于篩選不為宿主菌提供任何選擇標記的基因，或者是已獲得了該基因編碼的蛋白質產物的多克隆或單克隆抗體，用這些抗體來檢測目的基因表達的產物。免疫學方法很多，如We