微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告：環(huán)境中微生物

1、實(shí)驗(yàn)四環(huán)境中微生物的檢測(cè)和分離純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜こＳ梦⑸锱囵B(yǎng)基的配置方法。學(xué)習(xí)并掌握各種無(wú)菌操作技術(shù)，并用此技術(shù)進(jìn)行微生物稀釋分離、劃線分離接種。用平板劃線法和稀釋法分離微生物。認(rèn)識(shí)微生物存在的普遍性，體會(huì)無(wú)菌操作的重要性。二、實(shí)驗(yàn)原理土壤中有數(shù)量巨大、種類(lèi)豐富的微生物，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物的分離與純化。常用的是平板分離法。平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋?zhuān)蛊渲械奈⑸锍浞址稚⒊蓡蝹€(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的

2、一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品含菌數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)器材土樣10g,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板20個(gè)，未知菌種平板，當(dāng)天降雪；平皿，涂棒，接種環(huán)，無(wú)菌200ul,1000ul吸頭，記號(hào)筆，酒精燈，取液器:1000ul、200ul各一支，培養(yǎng)箱；0.9%無(wú)菌生理鹽水，250ml三角瓶中裝99ml生理鹽水，每瓶加約20粒玻璃珠，250ml三角瓶中99ml生理鹽水，作100倍稀釋用。四、實(shí)驗(yàn)步驟配置培養(yǎng)基：取牛肉膏5g,蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水1000ml配置培養(yǎng)基，調(diào)pH至7.2，滅菌。于講課前倒板20塊。采集野外樣品：選擇肥沃土壤，去表層土，挖520cm深度的土壤

3、數(shù)10g，裝入燒杯，帶回實(shí)驗(yàn)室;取校河水裝入燒杯，帶回實(shí)驗(yàn)室；取新積雪中間層轉(zhuǎn)入燒瓶，帶回實(shí)驗(yàn)室。制備土壤稀釋液：稱取土樣1.0g，放入盛99ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，用手振蕩5min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-2）。用200ul的無(wú)菌吸頭從中吸取0.1ml土壤懸液，注入事先分裝有0.9ml無(wú)菌水的試管中，吹吸3次，搖勻（10-3）。類(lèi)推制得10-4、10-5的土壤懸液。涂板：1）土壤稀釋液（9塊）：用無(wú)菌吸頭，分別吸取10-3、10-4、10-5濃度土壤稀釋液100ul，較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板。2）單菌落劃線（4

4、塊）：用接種環(huán)挑取未知平班上的菌落，做單菌落劃線分離，每人2板。3）手指（1塊）：分別用未洗過(guò)的手指頭，用自來(lái)水打濕的手指頭，用自來(lái)水洗過(guò)的手指頭，用肥皂洗過(guò)的手指頭和用酒精棉球擦過(guò)的手指頭（不用毛巾擦）在同一平板的不同分區(qū)涂抹（用力一致）。4）硬幣（1塊）：取3枚1角硬幣，按在平板的3個(gè)分區(qū)。5）頭發(fā)（1塊）：放置一根頭發(fā)，用無(wú)菌圖布棒壓緊在培養(yǎng)基上。6）牙垢（1塊）：用無(wú)菌牙簽取一點(diǎn)牙垢在培養(yǎng)基上劃線。7）空氣（2塊）：打開(kāi)培養(yǎng)皿置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上（空氣中）10min,按無(wú)菌操作要求在酒精燈火焰邊打開(kāi)皿蓋1min。8）積雪（1塊）：用移液器吸取100ul雪水，較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的牛肉蛋白胨培

5、養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌玻璃涂棒涂勻。培養(yǎng)：用報(bào)紙包好倒置35C培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24小時(shí)。觀察結(jié)果：對(duì)土壤稀釋液平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，單菌落劃線平板分離單菌落，其他平板觀察微生物種類(lèi)、數(shù)量。所有平板都要照相。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果土壤中微生物計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1。計(jì)數(shù)結(jié)果如表1。圖1.土壤稀釋液平板培養(yǎng)24h結(jié)果。a、b、c,稀釋10-3倍，1一3號(hào)；d、e、f,稀釋10-4倍，1-3號(hào);g、h、i,稀釋10-5倍，1一3號(hào)。表1土壤稀釋液微生物計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋倍數(shù)組號(hào)平均值/個(gè)微生物濃度/（個(gè)/ml）12310-3258280無(wú)法計(jì)數(shù)2692.69X10610-4無(wú)法計(jì)數(shù)122無(wú)法計(jì)數(shù)12210-51000.33單菌落劃線劃線結(jié)

6、果見(jiàn)圖2。圖2.單菌落劃線平板培養(yǎng)24h結(jié)果。由圖可以看出，只有b板有少許單菌落出現(xiàn)。其他樣品對(duì)比a和b,菌落數(shù)為11：2,可見(jiàn)平時(shí)無(wú)菌操作是有很大必要性的，但也說(shuō)明對(duì)于一些要求不高的實(shí)驗(yàn)，完全沒(méi)有必要謹(jǐn)小慎微地嚴(yán)守?zé)o菌操作要求，空氣中地微生物數(shù)量不是很多，與土壤、手指相比完全可以忽略。c板中頭發(fā)周?chē)L(zhǎng)了少量菌落，看似不多,但是要知道這只是1根頭發(fā),我們頭上有數(shù)萬(wàn)根這樣地頭發(fā),會(huì)有多少細(xì)菌藏身？可見(jiàn)保持個(gè)人衛(wèi)生的重要性。相比頭發(fā)，d板中牙垢就干凈些，可能與口腔中環(huán)境與空氣有區(qū)別有關(guān)。e為平時(shí)使用的硬幣，有培養(yǎng)結(jié)果可見(jiàn)上面微生物非常多，提醒我們平時(shí)接觸完貨幣后要洗手。說(shuō)到洗手，f板讓我們大吃一驚

7、，感覺(jué)上是越洗越臟！肥皂洗過(guò)后并不比沒(méi)洗時(shí)干凈！這是突然想起了XX佳香皂的廣告，感覺(jué)像是被騙了好多年g板更是顛覆了我們印象中雪花“潔白無(wú)暇”的美好印象，培養(yǎng)的結(jié)果比硬幣都臟。想到昨晚打雪仗時(shí)渾身的雪水，忍不住想要換洗全身衣服。六、討論土壤稀釋液平板計(jì)數(shù)稀釋103倍計(jì)數(shù)結(jié)果比較理想，但是2、3兩板還是出現(xiàn)了大片菌苔，說(shuō)明稀釋倍數(shù)還小。稀釋104倍雖然濃度適中，但是美中不足，沒(méi)有涂勻，無(wú)法計(jì)數(shù)。其中3號(hào)板懷疑是因?yàn)榈拱搴鬀](méi)有放平平板導(dǎo)致平面傾斜，而不是涂布的問(wèn)題，因?yàn)榫好黠@集中到了平板的一側(cè)。稀釋105倍時(shí)，居然沒(méi)有菌落，按濃度來(lái)說(shuō)不會(huì)出現(xiàn)這種情況，可能是稀釋時(shí)沒(méi)有吹打均勻，吸取了很多上清液，也

8、可能是涂板時(shí)涂布棒過(guò)熱，殺死了細(xì)菌。為什么沒(méi)有單菌落第一次單菌落劃線操作，結(jié)果慘不忍睹。究其原因，首先，手法不對(duì)，在開(kāi)始時(shí)應(yīng)該劃的密一些，讓大多數(shù)細(xì)菌在此階段進(jìn)入培養(yǎng)基，越往后劃的越疏松。但是我們的板子看起來(lái)前后基本一樣，這樣不利于菌種的分離。第二，挑取原菌落過(guò)多，用接種針扎一下就夠，但是我們因?yàn)榕_(tái)子上沒(méi)有準(zhǔn)備接種針，改用接種環(huán)，結(jié)果接觸面積大很多，帶出的菌種也就多很多了。第三，用力過(guò)大，劃板時(shí)經(jīng)常看到接種環(huán)進(jìn)入了固體培養(yǎng)基內(nèi)，運(yùn)動(dòng)阻力不均勻，劃線運(yùn)動(dòng)的也就不均勻，造成分離不理想。越洗手越臟？當(dāng)然這并不能說(shuō)明洗手利于微生物生長(zhǎng)，可能是因?yàn)橄词趾髿埩舻乃屛⑸锓植季鶆颍L(zhǎng)的面積更大；與干手指

9、印比較，有更多的水用于生長(zhǎng)、繁殖，長(zhǎng)得更好；更重要的是，自來(lái)水不是無(wú)菌水，肥皂也沒(méi)有滅過(guò)菌，自身都帶有很多細(xì)菌，只不過(guò)因?yàn)殚L(zhǎng)期和人體共存，雙方相安無(wú)事而已。因此最好不公用日常洗滌用品，避免發(fā)生交叉感染。日常洗手還是必要的，可以洗去污垢和有害化學(xué)物質(zhì)。好習(xí)慣需保持。雪水這么臟？我們盡情欣賞雪的潔白時(shí)一直忽略了它的形成原因：雪形成最基本的條件是大氣中要有“凝結(jié)核”存在，而大氣中的塵埃、煤粒、礦物質(zhì)等固體雜質(zhì)則是最理想的凝結(jié)核。如果空氣中水汽、溫度等氣象要素達(dá)到一定條件時(shí)，水汽就會(huì)在這些凝結(jié)核周?chē)Y(jié)成雪花。所以，雪花的“內(nèi)心”富集了空氣中的污染物，是很黑暗的難怪會(huì)有這么多微生物存在了。我們也不必因

10、此對(duì)雪來(lái)個(gè)180度大轉(zhuǎn)彎，比起河水、表層地下水來(lái)說(shuō)，雪水算是干凈的了，因此古人也有喝雪水、用雪水泡茶、治病的習(xí)俗。七、思考題從你周?chē)h(huán)境中微生物的觀察,你認(rèn)為無(wú)菌操作應(yīng)注意什么?盡量減少暴露時(shí)間，暴露時(shí)一定要在酒精燈的火焰旁，不能離太遠(yuǎn)。無(wú)菌部分和污染部分不能接觸，避免發(fā)生交叉污染。除了滅過(guò)菌的試劑、儀器外，不用任何“自認(rèn)為”干凈的器材。操作前一定要注意洗手、換實(shí)驗(yàn)服。說(shuō)明飯前洗手,飯后刷牙的重要性。通過(guò)手指、牙垢兩張片子，我們看出有大量微生物生活在那里。需要定期進(jìn)行清洗，避免外來(lái)菌大量繁殖，傷害身體健康。在日常生活中如何講究飲食衛(wèi)生?飯前洗手，飯后餐具廚具充分清洗滅菌。生、熟食分開(kāi)存放，分刀具、砧板操作，生食要清洗干凈，熟食要加熱徹底。條件允許的話采取分餐制。不吃變質(zhì)食品和長(zhǎng)時(shí)間存放的剩飯菜。試解釋夏天時(shí)煮好的飯如果放在鍋中保持蓋著鍋蓋不動(dòng)，不容易變質(zhì)，而一旦盛在碗里的飯就容易變質(zhì)，如果是吃剩的剩飯就最容易變質(zhì)的原因。夏天空氣溫度適宜微生物生長(zhǎng)。剛煮好的飯因?yàn)榻?jīng)過(guò)高溫殺菌，且鍋蓋將之與空氣隔離，組織微生物進(jìn)入；盛在碗里則直接把飯暴露在空氣中，會(huì)有細(xì)菌落在富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的飯上，快速繁殖使飯變質(zhì)；吃剩的飯之前與人的唾液、餐