工業(yè)微生物 chap5 微生物的代謝調(diào)節(jié)與控制

1、第五章 微生物的代謝調(diào)節(jié)與控制 微生物代謝 (microbial metabolism) 是微生物最基本的特征之一，包括在微生物細(xì)胞中進(jìn)行的所有生物化學(xué)反應(yīng)。微生物的代謝作用包括合成代謝 (anabolism) 和分解代謝 (catabolism)，合成代謝又稱同化作用，是指生物體從體內(nèi)或體外環(huán)境中取得原料，合成生物體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分的過程，此過程需要提供能量；分解代謝又稱異化作用，它與合成代謝正好相反，是指生物體內(nèi)所有的分解作用，包括各種營養(yǎng)物質(zhì)或細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)降解成簡單分子，此過程往往伴隨能量的釋放。無論是合成代謝還是分解代謝，代謝途徑都是由一系列連續(xù)的酶促反應(yīng)構(gòu)成的，前一步反應(yīng)的產(chǎn)物是后續(xù)反

2、應(yīng)的底物。而且，合成代謝與分解代謝在生物體中偶聯(lián)進(jìn)行，分解代謝為合成代謝提供所需要的能量、中間產(chǎn)物和還原力，而合成代謝則是分解代謝的基礎(chǔ)，提供酶、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長繁殖。微生物可通過氧化還原反應(yīng)或光合作用產(chǎn)生能量，同時又通過生物合成作用利用這些能量來制造生物體的必需物質(zhì)，在代謝活動中存在著明顯的多樣性。微生物細(xì)胞通過各種方式有效地調(diào)節(jié)相關(guān)的酶促反應(yīng)，來保證整個代謝途經(jīng)的協(xié)調(diào)性與完整性，從而使微生物細(xì)胞的生命活動得以正常進(jìn)行。 第一節(jié) 微生物代謝的多樣性一、微生物生物氧化的類型和產(chǎn)能生物氧化 (biological oxidation) 就是發(fā)生在活細(xì)胞內(nèi)的一系列產(chǎn)能性氧化反應(yīng)的總和。生物氧化不同于

3、普通的氧化反應(yīng)。首先，它們是由一系列酶在溫和的條件下按一定次序催化的多步式梯級反應(yīng)；第二，生物氧化反應(yīng)放能是分段逐級進(jìn)行的；第三，生物氧化反應(yīng)中釋出的能量一部分以化學(xué)能的形式儲藏在ATP分子等能量載體內(nèi)。根據(jù)微生物進(jìn)行生物氧化時有無外界的最終電子受體，可以把微生物生物氧化分為呼吸和發(fā)酵兩大類。沒有任何外源的最終電子受體的生物氧化類型稱為發(fā)酵，有外源的最終電子受體的生物氧化類型稱為呼吸。再根據(jù)外源最終電子受體是不是分子氧，又可以把呼吸分為有氧呼吸和無氧呼吸。1. 有氧呼吸又稱好氧呼吸 (aerobic respiration)，是一種最普遍又最重要的生物氧化或產(chǎn)能方式，其特點(diǎn)是底物脫下的氫經(jīng)完整

4、的呼吸鏈（respiratory chain，RC）又稱電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）傳遞，最終被外源分子氧接受，產(chǎn)生了水并釋放出ATP形式的能量。這是一種遞氫和受氫都必須在有氧條件下完成的生物氧化作用，是一種高效產(chǎn)能方式。有氧呼吸是好氧和兼性厭氧微生物在有氧條件下進(jìn)行氧化的方式。這時，化能異氧微生物以有機(jī)物為呼吸底物（能源）；化能自養(yǎng)微生物以還原態(tài)的無機(jī)化合物（如H2，H2S，S，S2O3，NH3和NO2等）作為呼吸底物（能源）。有氧呼吸中還存在兩種形式：典型的一種是呼吸底物逐步被徹底氧化（如葡萄糖徹底氧化成CO2和水），釋放的能量可與磷酸化過程相偶聯(lián)

5、，產(chǎn)生大量ATP；另一種是非典型的，呼吸底物脫下的氫和電子在氧化酶的作用下直接交給氧，產(chǎn)生脫了氫的底物和H2O2（如葡萄糖H2OO2葡萄糖酸H2O2能量），這個過程釋放的能量不能與磷酸化過程偶聯(lián)，即不產(chǎn)生ATP。參與這類反應(yīng)的氧化酶都是以FAD或FMN為輔基的黃素蛋白，可稱為黃素蛋白水平呼吸。2. 無氧呼吸又稱厭氧呼吸 (anaerobic respiration)，指一類呼吸鏈末端的氫受體為O2以外的外源氧化物。這是一類在無氧條件下進(jìn)行的、產(chǎn)能效率較低的特殊呼吸。其特點(diǎn)是底物脫氫后，經(jīng)部分呼吸鏈遞氫，最終由氧化態(tài)的無機(jī)物或有機(jī)物受氫，并完成氧化磷酸化產(chǎn)能反應(yīng)。一些厭氧微生物和兼性厭氧微生物在

6、無氧條件下營無氧呼吸。如：脫氮副球菌有：C6H12O64NO36 CO26 H2O2N2能量奧氏甲烷桿菌有：2C2H5OHCO22CH3COOHCH4能量值得注意的是在無氧呼吸過程中，電子供體和電子受體之間也需要細(xì)胞色素等起傳遞作用并伴隨有磷酸化作用。由于有些能量隨著電子轉(zhuǎn)移至最終電子受體中，因此所生成的能量不如有氧呼吸多；此外，由于無機(jī)氧化物電子受體的氧化還原電位一般比較低（氧的氧化還原電位最高），因而還原酶系統(tǒng)產(chǎn)生的ATP通常比有氧呼吸時涉及的細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的ATP少。3. 發(fā)酵發(fā)酵（fermentation）是指在無氧等外源氫受體的條件下，底物脫氫后所產(chǎn)生的還原力H未經(jīng)呼吸鏈傳遞

7、而直接交某一內(nèi)源中間代謝物接受，以實(shí)現(xiàn)底物水平磷酸化產(chǎn)能的一類生物氧化反應(yīng)。其特點(diǎn)是以有機(jī)化合物作為電子供體（被氧化）和電子受體（被還原），電子的傳遞不經(jīng)過細(xì)胞色素等中間電子遞體，直接由電子供體交給電子受體，因此可以看作是分子內(nèi)的轉(zhuǎn)移。這種氧化作用不徹底，最終形成還原性產(chǎn)物，只放出一部分化學(xué)能，而大部分能量仍儲存在還原性產(chǎn)物中。一個有機(jī)化合物完全氧化時產(chǎn)生的能量比其發(fā)酵作用大的多，例如，1mol葡萄糖完全氧化能釋放出2.9106J的能量，而酵母菌利用葡萄糖進(jìn)行酒精發(fā)酵時，糖的發(fā)酵作用只能釋放大約十分之一的能量（2.3105J），其中9.6104J儲存在ATP中，多余的能以熱的形式散失，而大部分

8、能量仍儲存在酒精中。發(fā)酵作用是通過底物水平磷酸化合成ATP的；底物水平磷酸化也在呼吸作用中存在，但在呼吸作用中，更多的ATP是通過氧化磷酸化產(chǎn)生的。因而，每摩爾底物通過呼吸代謝產(chǎn)生的ATP比發(fā)酵代謝大的多。產(chǎn)能效率比：有氧呼吸無氧呼吸發(fā)酵。各種微生物都能進(jìn)行發(fā)酵模式的生物氧化，除進(jìn)行無氧呼吸的厭氧微生物外，發(fā)酵作用是許多厭氧微生物取得能量的唯一方式。好氧微生物在進(jìn)行有氧呼吸的過程中也要經(jīng)過發(fā)酵階段，但在這種情況下，有機(jī)化合物的利用速度要比無氧時慢。無論是發(fā)酵作用還是呼吸作用，在氧化時都是先使輔酶NAD(P)還原成NAD(P)H（有少數(shù)是把脫氫酶的輔基，如FAD或FMN還原），但NADH上的電子

9、和氫的去路不同，發(fā)酵時，電子轉(zhuǎn)移給代謝中間物，形成發(fā)酵產(chǎn)物；呼吸時通過電子傳遞鏈將電子傳遞給外源最終電子受體。二、工業(yè)微生物重要的分解代謝途徑及產(chǎn)物工業(yè)上使用的微生物絕大多數(shù)屬化能異氧型，以糖類作為最重要和最普遍的碳源和能源。糖類作為氧化基質(zhì)，通過各種降解方式形成構(gòu)建菌體成分的中間代謝物，同時伴以能量的產(chǎn)生。微生物可利用的糖類包括多糖、雙糖和單糖。淀粉、纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和幾丁質(zhì)等多糖可被不同的微生物所利用，但必須被微生物分泌的相應(yīng)的胞外酶水解成單糖或雙糖后，才能被細(xì)胞所吸收。葡萄糖和果糖是化能異氧微生物的主要碳源和能源，戊糖是經(jīng)轉(zhuǎn)化后中途進(jìn)入葡萄糖降解途徑的。糖以外的其它有機(jī)化合物（包

10、括醇、醛、有機(jī)酸、氨基酸、烴類、芳香族有機(jī)化合物）的代謝也都是經(jīng)轉(zhuǎn)化后進(jìn)入葡萄糖降解途徑的。因此，化能異氧型微生物進(jìn)行分解代謝的最基本的途徑就是葡萄糖降解的途徑，或稱單糖降解途徑。微生物降解葡萄糖的方式很多，遠(yuǎn)比高等生物復(fù)雜，其降解途徑及最終產(chǎn)物因微生物種類和發(fā)酵條件而異，主要有下列方式。（一）酵解途徑糖的酵解是各種發(fā)酵的基礎(chǔ)，發(fā)酵作用是酵解過程的發(fā)展。糖酵解（glycolysis）又稱EMP途徑（Embden-Meyerhof pathway），或雙磷酸己糖降解途徑。這是氧化葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸的過程，它通常是碳水化合物分解過程的第一階段。許多微生物能進(jìn)行該途徑的反應(yīng)。事實(shí)上，它存在于大多數(shù)活細(xì)

11、胞中。酵解途徑包括10個獨(dú)立的，但又是連續(xù)的反應(yīng)，其順序及所需的酶見圖5-1。糖酵解中的酶催化六碳葡萄糖裂解生成兩個三碳糖，這些糖然后進(jìn)一步被氧化釋放能量，同時進(jìn)行原子的重排而形成了兩分子丙酮酸。糖酵解期間NAD被還原成NADH，并且通過底物水平磷酸化作用凈產(chǎn)生兩分子的ATP。因此，葡萄糖經(jīng)EMP途徑降解成丙酮酸的總反應(yīng)式為：C6H12O62NAD2Pi2ADP2CH3COCOOH2NADH22ATP2H2O反應(yīng)中所生成NADH2必須重新氧化為NAD后才能繼續(xù)不斷地推動全部反應(yīng)。糖酵解過程不需要氧的參與，它能夠在無氧或有氧的條件下發(fā)生。在無氧的條件下，如以乙醛作為受氫體，即是酒精發(fā)酵；如以丙酮

12、酸作為受氫體，即是乳酸發(fā)酵。在有氧情況下，NADH2經(jīng)呼吸鏈氧化，同時丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)。EMP途徑是多種微生物所具有的代謝途徑，其產(chǎn)能效率雖低，但生理功能極其重要：供應(yīng)ATP形式的能量和NADH2形式的還原力，厭氧微生物是以此途徑作為獲得能量的唯一方式；是連接其它幾個重要代謝途徑的橋梁，包括三羧酸循環(huán)（TCA）、HMP途徑和ED途徑等；為生物合成提供多種中間代謝物；通過逆向反應(yīng)可進(jìn)行多糖合成。若從EMP途徑與人類生產(chǎn)實(shí)踐的關(guān)系來看，則它與乙醇、乳酸、甘油、丙酮和丁醇等的發(fā)酵生產(chǎn)關(guān)系密切。圖5-1 酵解途徑簡圖（二）HMP途徑除了通過糖酵解氧化葡萄糖外，大多數(shù)微生物還有一條徹底分解葡萄糖為C

13、O2和水的途徑，即是葡萄糖在轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖酸后就分解為CO2和5-磷酸核酮糖，也就是在單磷酸己糖的基礎(chǔ)上開始降解，故稱單磷酸己糖途徑（hexose monophosphate pathway，簡稱HMP途徑）。又因?yàn)樗傻牧姿嵛焯强芍匦陆M成磷酸己糖，形成循環(huán)反應(yīng)，所以又常稱為磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway），見圖5-2。圖5-2 HMP途徑簡圖HMP途徑基本過程可分為3個階段：葡萄糖分子通過幾步氧化反應(yīng)產(chǎn)生5-磷酸核酮糖和CO2；5-磷酸核酮糖發(fā)生結(jié)構(gòu)變化形成5-磷酸核糖和5-磷酸木酮糖；幾種磷酸戊糖在無氧參與的條件下發(fā)生碳架重排，產(chǎn)生了磷酸己糖和磷酸

14、丙糖，后者既可以通過EMP途徑轉(zhuǎn)化成丙酮酸而進(jìn)入TCA循環(huán)進(jìn)行徹底氧化，也可通過醛縮酶的作用而轉(zhuǎn)化為磷酸己糖。HMP途徑的總反應(yīng)式為：G-6-P12NADP6H2O6CO212（NADPHH）PiHMP途徑比EMP途徑復(fù)雜，可以獲得很多產(chǎn)物，如C3、C5、C7等磷酸糖酯。該途徑主要特點(diǎn)是葡萄糖直接脫氫和脫羧，不必先經(jīng)三碳糖的階段；另一特點(diǎn)是只有NADP參與反應(yīng)。HMP途徑在微生物生命活動中意義重大，主要有：供應(yīng)5-磷酸核糖，以合成嘌呤和嘧啶核苷酸，最后合成核酸、輔酶等；提供大量的還原力NADPHH，除了部分被轉(zhuǎn)氫酶催化變?yōu)镹ADHH，再進(jìn)入呼吸鏈氧化，可生成大量的ATP外，主要還是作為細(xì)胞合成

15、脂肪酸、膽固醇、谷氨酸等需氫的一種重要來源；途徑中的4-磷酸赤蘚糖是合成芳香族氨基酸的前體；磷酸戊糖循環(huán)的功能對于光能和化能自養(yǎng)菌具有重要作用，這兩類微生物細(xì)胞中的含碳成分都是由CO2和1,5-二磷酸核酮糖縮合而成，而后者是由5-磷酸核糖轉(zhuǎn)變而來；生成的6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛等可進(jìn)入EMP途徑，進(jìn)而代謝為丙酮酸，這樣HMP途徑與EMP途徑相聯(lián)系。因此，HMP途徑在物質(zhì)代謝中很重要，在大多數(shù)好氧和兼性厭氧微生物中都有這條途徑。HMP途徑與EMP途徑、TCA循環(huán)可以同時存在于一細(xì)胞內(nèi)，只有少數(shù)細(xì)菌以HMP途徑作為有氧分解的唯一途徑，例如弱氧化醋桿菌（Acetobacter suboxydan

16、s）和氧化醋單胞菌（Acetomonas oxydans）。（三）ED途徑N. Entner和M. Doudorff兩人（1952年）在對Pseudomonas saccharophila（嗜糖假單胞菌）的研究時發(fā)現(xiàn)，該菌缺少6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，從葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖酸之后不氧化脫羧，而是在脫水酶作用下脫水，生成2酮3脫氧6磷酸葡萄糖酸（KDPG），后者由脫氧酮糖醛縮酶催化裂解成為3-磷酸甘油醛和丙酮酸（見圖5-3），這就是ED途徑（Entner-Doudorff pathway），又稱2酮3脫氧6磷酸葡萄糖酸（KDPG）途徑，其關(guān)鍵步驟是KDPG的3，3裂解，成為兩個C3化合物。3-

17、磷酸甘油醛轉(zhuǎn)入EMP途徑后半部分可轉(zhuǎn)化為丙酮酸，因而ED途徑的總反應(yīng)式為：C6H12O6NADNADPPiADP2CH3COCOOHNADHNADPH2HATP圖5-3 ED途徑簡圖ED途徑是少數(shù)EMP途徑不完整的細(xì)菌所特有的利用葡萄糖的替代途徑。由于它可與EMP途徑、HMP途徑和TCA循環(huán)等代謝途徑相聯(lián)，故可相互協(xié)調(diào)，滿足微生物對能量、還原力和不同中間代謝產(chǎn)物的需要。所以ED途徑也是微生物的一條重要代謝途徑，廣泛分布在細(xì)菌尤其是革蘭氏陰性菌中。（四）PK途徑和戊糖的利用除了常見的EMP途徑、HMP途徑和ED途徑外，尚有兩個磷酸酮縮酶途徑（phosphoketolase pathway，簡稱P

18、K途徑）是少數(shù)細(xì)菌所有的，例如異型乳酸發(fā)酵的乳酸桿菌、雙叉乳桿菌和雙歧桿菌等，因?yàn)樵撏緩降牟糠峙cHMP途徑相同，所以可認(rèn)為是HMP途徑的分叉。1. 磷酸戊糖酮縮酶途徑磷酸戊糖酮縮酶途徑（phospho-pentose-ketolase pathway，簡稱PPK途徑）是HMP途徑的變異途徑。葡萄糖或戊糖都可作為碳源，當(dāng)以葡萄糖為碳源時，經(jīng)HMP途徑的前部分，分解為5-磷酸核酮糖和CO2，然后5-磷酸核酮糖異構(gòu)化生成5-磷酸木酮糖；戊糖作碳源時，它們進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)生磷酸化，然后也轉(zhuǎn)化成5-磷酸木酮糖。5-磷酸木酮糖是戊糖代謝的關(guān)鍵中間代謝物，在磷酸戊糖酮縮酶催化下進(jìn)行2，3裂解，生成乙酰磷酸和3-

19、磷酸甘油醛，該酶是PPK途徑的關(guān)鍵酶，所催化的磷酸戊糖2，3裂解是關(guān)鍵步驟。生成的乙酰磷酸被還原為乙醇，3-磷酸甘油醛沿EMP途徑后半部分轉(zhuǎn)化為乳酸，同時產(chǎn)生2ATP，扣除發(fā)酵開始時用來激活葡萄糖所消耗的1個ATP，凈得1ATP（見圖5-4a），這就是腸膜狀明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）等以及真菌中的根霉所進(jìn)行的異型乳酸發(fā)酵路線，總的反應(yīng)式為：葡萄糖ADPPi乳酸乙醇CO2ATP乳酸菌如戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和腸膜狀明串珠菌（Leuc

20、onostoc mesenteroides）以及真菌中的鐮刀菌（Fusarium）進(jìn)行戊糖發(fā)酵時，通過磷酸戊糖2，3裂解的途徑，但產(chǎn)物中有乙酸而沒有乙醇，產(chǎn)生的能量也比以葡萄糖為碳源的異型乳酸發(fā)酵高，這是因?yàn)樵谏梢宜岬倪^程中有ATP的產(chǎn)生（見圖5-4b），其總反應(yīng)式為：戊糖2ADP2Pi乳酸乙酸2ATP圖5-4 PPK途徑a為利用葡萄糖，b為利用核糖。圖中由3-磷酸甘油醛至丙酮酸的5步反應(yīng)仍沿EMP途徑。己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶，6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，5-磷酸核酮糖異構(gòu)酶，磷酸戊糖酮縮酶，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶，乙醛脫氫酶，醇脫氫酶，同EMP途徑相應(yīng)酶，乳酸脫氫酶2. 磷酸己糖酮縮酶途徑少數(shù)細(xì)

21、菌，如兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）等缺少6-磷酸葡萄糖脫氫酶（則不可能有HMP途徑），又缺少果糖二磷酸醛縮酶（則不可能有EMP途徑），在利用葡萄糖的途徑也不同于ED途徑或PPK途徑，而是走一條特殊的磷酸己糖酮縮酶途徑（phospho-hexose-ketolase pathway，簡稱PHK途徑）。其特點(diǎn)是該途徑有兩步反應(yīng)是由磷酸酮縮酶所催化的，第一步是由6-磷酸果糖酮縮酶將6-磷酸果糖分解為乙酰磷酸和4-磷酸赤蘚糖，另一步是5-磷酸木酮糖酮縮酶將5-磷酸木酮糖分解為3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，在沒有氧化作用和脫氫作用的反應(yīng)參與下，2分子葡萄糖分解為3分子乙酰磷

22、酸和2分子3-磷酸甘油醛，后者在3-磷酸甘油醛脫氫酶和乳酸脫氫酶參與下轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，乙酰磷酸則與ATP的生成反應(yīng)相偶聯(lián)成為乙酸（見圖5-5）。從葡萄糖開始，總反應(yīng)式為：2葡萄糖5ADP5Pi2乳酸3乙酸5ATP圖5-5 PHK途徑己糖激酶和6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，6-磷酸果糖酮縮酶，轉(zhuǎn)醛醇酶，轉(zhuǎn)酮醇酶，5-磷酸核糖異構(gòu)酶，5-磷酸核酮糖異構(gòu)酶，5-磷酸木酮糖酮縮酶，乙酸激酶，同EMP途徑相應(yīng)酶（五）葡萄糖直接氧化途徑上述四條途徑都是葡萄糖先磷酸化后才逐步被降解的。有些微生物如酵母屬（Saccharomyces）、假單孢菌屬（Pseudomonas）、氣桿菌屬（Aerobacter）和醋桿菌屬（Ac

23、etobacter）的某些菌，它們沒有己糖激酶，但有葡萄糖氧化酶，便直接將葡萄糖先氧化成葡萄糖酸，再磷酸化生成6-磷酸葡萄糖酸，假單孢菌中的6-磷酸葡萄糖酸經(jīng)6-PG脫水酶轉(zhuǎn)化為KDPG，按ED途徑進(jìn)一步降解；氣桿菌屬和醋桿菌屬以及另一些假單孢菌中的6-磷酸葡萄糖酸經(jīng)6-PG脫氫酶轉(zhuǎn)化為5-磷酸核酮糖，進(jìn)入HMP途徑。（六）三羧酸循環(huán)葡萄糖除了上面幾種途徑降解，得到各種中間體的代謝產(chǎn)物外，好氧微生物在有氧情況下，通過三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，簡稱TCA循環(huán)）完全氧化，生成各種生物合成的中間體、CO2和水，同時產(chǎn)生大量的還原力（NADPH2、NADH2和FAD

24、H2），這些還原力通過電子傳遞鏈生成ATP。這是一個廣泛存在于各種生物體中的重要生物化學(xué)反應(yīng)，在各種好氧微生物中普遍存在。葡萄糖經(jīng)EMP途徑降解為丙酮酸后，丙酮酸不能直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)。在有氧情況下，丙酮酸需要失去1分子的CO2，降解成乙酰CoA，此反應(yīng)分五步由丙酮酸脫氫酶復(fù)合物催化完成。這一反應(yīng)本身并非是三羧酸循環(huán)的一部分，但它是所有糖類經(jīng)丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)所必須經(jīng)過的。三羧酸循環(huán)也叫檸檬酸循環(huán)（citric acid cycle）或Krebs循環(huán)（the Krebs cycle）。在三羧酸循環(huán)中，通過一系列的生化反應(yīng)途徑，儲存在乙酰CoA中大量潛在的化學(xué)能被逐步釋放出來。在這個循環(huán)中，通

25、過一系列氧化和還原反應(yīng)把化學(xué)潛能以電子的形式轉(zhuǎn)移到電子載體（主要是NAD）上。丙酮酸的衍生物被氧化，輔酶被還原。三羧酸循環(huán)的主要化學(xué)反應(yīng)見圖5-6，3C化合物丙酮酸脫羧后，形成NADHH，并產(chǎn)生2C化合物乙酰CoA，由它與4C化合物草酰乙酸縮合形成6C化合物檸檬酸。通過一系列氧化和轉(zhuǎn)化反應(yīng)，6C化合物經(jīng)過5C化合物又重新回到4C化合物草酰乙酸，再由它接受來自下一個循環(huán)的乙酰CoA分子。整個三羧酸循環(huán)的總反應(yīng)式為：丙酮酸4NADFADGDPPi3H2O3CO24（NADHH）FADH2GTP圖5-6 三羧酸循環(huán)簡圖三羧酸循環(huán)不僅為機(jī)體提供大量的能量，而且三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物是細(xì)胞進(jìn)行生物合成的原

26、料，它們是合成反應(yīng)的起點(diǎn)成分。例如-酮戊二酸和草酰乙酸分別可合成谷氨酸族和天冬氨酸族氨基酸；琥珀酰CoA可作為卟啉環(huán)的前體；檸檬酸作為脂肪酸生物合成中線粒體內(nèi)乙酰CoA的前體等。因此，三羧酸循環(huán)位于一切分解代謝和合成代謝中的樞紐地位。（七）乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)（dicarboxylic acid cycle，DCA循環(huán)）又稱二羧酸循環(huán)或TCA循環(huán)支路。DCA循環(huán)兩個關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。某些二碳化合物難通過上述途徑轉(zhuǎn)化生成乙酰CoA，因此，它們不能從乙酰CoA進(jìn)入TCA循環(huán)，如乙酸、乙醇酸、草酸等。乙酸通過乙酰CoA合成酶催化生成乙酰CoA；乙醇酸和草酸先轉(zhuǎn)化成乙醛酸，然后借助

27、于乙醛酸循環(huán)徹底氧化成CO2和H20，并生成2分子NADH2。DCA循環(huán)中，先在異檸檬酸裂解酶催化下異檸檬酸裂解為乙醛酸和琥珀酸，再在蘋果酸合成酶作用下將乙醛酸和乙酰CoA合成蘋果酸。DCA循環(huán)的生理功能是使微生物可在乙酸為唯一的碳源基質(zhì)上生長；又可彌補(bǔ)TCA環(huán)中四碳化合物之不足；同時，在脂肪酸轉(zhuǎn)化為糖的過程中起齒輪作用。DCA循環(huán)的總反應(yīng)式為：2乙酸2NAD蘋果酸2NADH2乙酰CoA乙醛酸2NAD蘋果酸2NADH2（八）工業(yè)微生物重要的發(fā)酵類型及其產(chǎn)物微生物的發(fā)酵類型極其多樣，不同的微生物對葡萄糖的發(fā)酵，其產(chǎn)物就很不一樣，微生物所進(jìn)行的各種發(fā)酵，常以其終產(chǎn)物命名。在糖酵解過程中生成的丙酮酸

28、可被進(jìn)一步代謝。在無氧條件下，不同的微生物分解丙酮酸后會積累不同的代謝產(chǎn)物。目前發(fā)現(xiàn)多種微生物可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙醇，能進(jìn)行乙醇發(fā)酵的微生物包括酵母菌、根霉、曲霉和某些細(xì)菌。根據(jù)在不同條件下代謝產(chǎn)物的不同，可將酵母菌利用葡萄糖進(jìn)行的發(fā)酵分為三種類型：如果以乙醛（丙酮酸脫羧）為受體生成乙醇，這種發(fā)酵稱為酵母的一型發(fā)酵；當(dāng)環(huán)境中存在亞硫酸氫鈉時，不能以乙醛作為受體，而以磷酸二羥丙酮作為受體時，產(chǎn)物為甘油，稱為酵母的二型發(fā)酵；在弱堿性條件下（PH7.6），乙醛因得不到足夠的氫而積累，兩個乙醛分子間會發(fā)生歧化反應(yīng)，一個作為還原劑形成乙酸，一個作為氧化劑形成乙醇，受體為磷酸二羥丙酮，發(fā)酵產(chǎn)物為甘油、乙醇

29、和乙酸，稱為酵母的三型發(fā)酵。這種發(fā)酵方式不產(chǎn)生能量，只能在非生長的情況下進(jìn)行。不同的細(xì)菌進(jìn)行乙醇發(fā)酵時，其發(fā)酵途徑也各不相同。如厭氧發(fā)酵單胞菌是利用ED途徑分解葡萄糖為丙酮酸，最后得到乙醇。腸桿菌則是利用EMP途徑來進(jìn)行乙醇發(fā)酵。許多細(xì)菌能利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸，這類細(xì)菌稱為乳酸細(xì)菌。根據(jù)產(chǎn)物的不同，乳酸發(fā)酵有三種類型：同型乳酸發(fā)酵（利用EMP途徑產(chǎn)物只有乳酸）、異型乳酸發(fā)酵（利用PK乳酸及部分乙醇或乙酸）和雙歧發(fā)酵（利用雙歧雙歧桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸的一條途徑）。許多厭氧菌可進(jìn)行丙酸發(fā)酵、丙酮-丁醇發(fā)酵；某些腸桿菌可進(jìn)行混合酸發(fā)酵，產(chǎn)物為乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、CO2和氫氣等。第二節(jié) 微生物初級

30、代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)節(jié)當(dāng)一個微生物細(xì)胞被置于含有糖、氨和無機(jī)鹽等培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)時，它就將糖降解為三碳和二碳化合物，并將這些小分子物質(zhì)送入三羧酸循環(huán)，提供合成細(xì)胞成分的中間產(chǎn)物和能量，再由這些中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成20種氨基酸、4種核糖核苷酸、4種脫氧核糖核苷酸，還有十多種維生素、幾十種脂肪酸類和糖類，然后，這些小分子物質(zhì)又合成為約兩千多種蛋白質(zhì)、DNA、RNA（mRNA、tRNA、rRNA）、多糖和脂類等生物大分子物質(zhì)，它們被用來構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、核糖體、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及線粒體等多種細(xì)胞器。所有這些分解和合成代謝都是由酶催化反應(yīng)的。一個細(xì)胞可以有三千種酶，而每個蛋白質(zhì)（多肽鏈）的合成需要

31、一套基因，如一個大腸桿菌染色體DNA約含400萬個堿基對，用于編碼一個含500個氨基酸多肽的基因約有3000個。 一個細(xì)菌在正常條件下，每2060min繁殖一代，同時它只在一定的環(huán)境條件下，才生成某些分解代謝的酶和回補(bǔ)途徑的酶。在一個細(xì)胞中存在著如此復(fù)雜的反應(yīng)，繁殖速度又如此之快，但所有反應(yīng)都是有條不紊、協(xié)調(diào)有效地進(jìn)行，使得在能量或中間產(chǎn)物的供應(yīng)上，既無不足又無過剩，保持各種代謝物的濃度相對穩(wěn)定和動態(tài)平衡，結(jié)果使細(xì)胞得以生長。這樣的能量利用之經(jīng)濟(jì)，對原料利用之合理，對細(xì)胞成分合成之迅速，以及對外界條件適應(yīng)之靈敏，都說明了微生物細(xì)胞內(nèi)具有高度嚴(yán)密的自我調(diào)節(jié)能力。 微生物具有比任何其它生物更為明顯

32、的自我代謝調(diào)節(jié)機(jī)能，這對于微生物本身非常重要，可使微生物有高度適應(yīng)環(huán)境和自我繁殖能力。而對于微生物在工業(yè)上的應(yīng)用，則有利也有弊：當(dāng)以獲得微生物細(xì)胞（如單細(xì)胞蛋白）為目的時，微生物的自我調(diào)節(jié)作用，避免了中間代謝產(chǎn)物的過量生成而造成能量和物料的浪費(fèi)，這樣使原料的利用更合理；對于以大量積累中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物的發(fā)酵（如有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、抗生素發(fā)酵），細(xì)胞的自我代謝調(diào)節(jié)，使中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物不能過量生成，也不能排出體外。為了使微生物大量積累中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物，必須破壞或解除原有的調(diào)控關(guān)系并建立新的調(diào)節(jié)機(jī)制，使它按照人們的意愿，改變或控制代謝方向，從而使目的產(chǎn)物大量生成和積累。 微生物的自我調(diào)節(jié)作

33、用都是通過協(xié)調(diào)控制酶來實(shí)現(xiàn)的，酶的生物合成受基因和代謝物的雙重控制。一方面，從DNA分子水平上，酶的合成與普通蛋白質(zhì)的合成一樣，受基因的控制，基因決定了所形成的酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)；另一方面，是從酶學(xué)的角度考慮，酶的合成還受代謝物，如酶反應(yīng)的底物、產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)類似物的控制和調(diào)節(jié)，僅有某種基因，并不能保證大量產(chǎn)生某種酶。概括來說，微生物的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制可分為以下3類：1. 通過控制基因的酶生物合成調(diào)控這類調(diào)控機(jī)制又可分為誘導(dǎo)與阻遏兩種方式：(1)酶的誘導(dǎo)合成（enzyme induction）當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時，酶的生成量可以幾倍乃至幾百倍地增加。 (2)酶的阻遏生成（enzyme repression

34、）這是停止或抑制酶合成的效應(yīng)。根據(jù)阻遏物的不同而有三種類型： a.終產(chǎn)物反饋?zhàn)瓒糇瓒粑餅楹铣赏緩降慕K產(chǎn)物； b.分解代謝物阻遏阻遏物為另一個分解途徑的產(chǎn)物； c.代謝互鎖阻遏物與被阻遏物的酶是幾乎不相關(guān)的合成途徑的產(chǎn)物。2. 酶活性的控制這是通過改變已存在的酶的催化活性來控制的，包括以下三種類型：(1)終產(chǎn)物的抑制或激活；(2)酶原的活化；(3)通過輔酶水平的活性調(diào)節(jié)。3. 通過細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)在微生物中，細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)也是非常重要的。透性調(diào)節(jié)一方面有選擇地將必需營養(yǎng)物輸送到細(xì)胞內(nèi)，另一方面使胞內(nèi)必需的代謝物和大分子保留在一定的濃度，當(dāng)終產(chǎn)物累積到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度時，細(xì)胞立即停止該物質(zhì)

35、的合成，這樣對微生物本身來說，不會造成浪費(fèi)，保證微生物細(xì)胞能正常生長。但是，對于以大量積累某種代謝物為目的的發(fā)酵生產(chǎn)，必須通過改變細(xì)胞膜通透性，把屬反饋控制因子的終產(chǎn)物迅速不斷地排出于細(xì)胞外，從而打破這種反饋控制，大幅度地提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生與反饋?zhàn)瓒粑⑸锛?xì)胞生長時，把碳、氮源和能源的高分子化合物分解為簡單物質(zhì)，再由此合成氨基酸、核苷酸、維生素和脂肪酸等中間產(chǎn)物，進(jìn)一步再合成為蛋白質(zhì)、核酸、脂類、多糖等高分子化合物，裝配成具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的單元，完成細(xì)胞的生長、分化和繁殖。這種包括分解代謝和合成代謝的，產(chǎn)生對細(xì)胞生長、分化和繁殖必需的物質(zhì)的代謝稱為初級代謝（primary me

36、tabolism），例如，氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸以及維生素等都屬于初級代謝產(chǎn)物。從初級代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物出發(fā)，合成一些生理功能不夠明確、化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊，與維持生命活動無關(guān)，并不影響生命活動的代謝產(chǎn)物，這一過程稱為次級代謝（secondary metabolism），例如，抗生素、色素、毒素等均屬于次級代謝產(chǎn)物。由于初級代謝產(chǎn)物都是微生物營養(yǎng)性生長所必需的，因此，除了遺傳上有缺陷的菌株外，活細(xì)胞中初級代謝途徑是普遍存在的，各種微生物的初級代謝途徑基本相同（只有幾種初級代謝產(chǎn)物的合成途徑在細(xì)菌和霉菌中略有差異，在同一類微生物，如細(xì)菌中不同的初級代謝產(chǎn)物合成途徑是十分罕見的），但在調(diào)節(jié)機(jī)制上有較大的差

37、異。而且初級代謝途徑上的酶的特異性比次級代謝的酶要高，因?yàn)槌跫壌x產(chǎn)物合成的差錯會導(dǎo)致細(xì)胞死亡的嚴(yán)重后果。初級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑是穩(wěn)定的，不同微生物種的調(diào)節(jié)機(jī)制現(xiàn)在已基本弄清楚了。其調(diào)節(jié)機(jī)制模型參見圖5-7，當(dāng)?shù)孜锲咸烟沁M(jìn)入微生物細(xì)胞之后，經(jīng)過輔酶補(bǔ)充能量，細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的各種誘導(dǎo)酶和合成酶1、2、3分別通過A、B、C、DX、Y各個階段形成了最終代謝產(chǎn)物Z，而Z又反饋抑制誘導(dǎo)酶、合成酶的活性，同時也反饋?zhàn)瓒粽T導(dǎo)酶、合成酶的產(chǎn)生。圖5-7 微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制模型(一)酶的誘導(dǎo)合成 微生物體內(nèi)參與代謝活動的酶，有些是細(xì)胞所固有的，經(jīng)常存在于細(xì)胞內(nèi)，以恒定速度和恒定數(shù)量生成，不隨微生物的代謝狀態(tài)而

38、變化，這一類酶稱為組成酶（constitutive enzymes）；而另一些酶，在一般情況下細(xì)胞內(nèi)不生成或數(shù)量很少，這些酶只有在底物或其結(jié)構(gòu)類似物存在時才生成，這一類酶被稱為誘導(dǎo)酶（induced enzymes），引起酶生成的化合物叫誘導(dǎo)物。例如：有些細(xì)菌只生長在含有淀粉的培養(yǎng)基中才能產(chǎn)生淀粉酶；曲霉只有生長在含有蔗糖的培養(yǎng)基中才產(chǎn)生蔗糖酶，以大腸桿菌的-半乳糖苷酶的合成為例，更清楚地看到這種誘導(dǎo)效應(yīng)。圖5-8表示-半乳糖苷酶的合成與乳糖利用的關(guān)系，向大腸桿菌的細(xì)胞懸液中添加乳糖，很快就會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中-半乳糖苷酶的水平上升。在沒有添加乳糖時，大腸桿菌細(xì)胞的這個酶的水平極低（只有用專門技術(shù)才能

39、測出來），加入乳糖，使該酶水平上升約1000倍。圖5-8 大腸桿菌細(xì)胞中-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)組成酶和誘導(dǎo)酶是相對的概念，同一種酶，在這種微生物中是誘導(dǎo)酶，而在另一微生物中可能是組成酶。例如-半乳糖苷酶在大腸桿菌K12野生株中是誘導(dǎo)酶，而在該菌的一個突變株中則是組成酶。 酶的誘導(dǎo)合成現(xiàn)象是微生物普遍存在的，許多分解代謝的酶屬于誘導(dǎo)酶類，如對糖、蛋白質(zhì)、氨基酸以及芳香族化合物的降解利用。但有些合成酶類也是誘導(dǎo)酶類，如細(xì)胞色素、細(xì)菌葉綠素等的合成也是適應(yīng)性的。例如，當(dāng)酵母菌在有氧條件下，可以生成細(xì)胞色素，無氧時就消失，有氧時又恢復(fù)。 酶合成的誘導(dǎo)對于微生物是十分有意義的。從營養(yǎng)的角度看，微生物可以根據(jù)

40、環(huán)境所提供的生長底物，誘導(dǎo)合成相應(yīng)的酶，以分解生長底物，吸收營養(yǎng)，進(jìn)行代謝活動，從而加強(qiáng)微生物對環(huán)境的適應(yīng)能力。從細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的角度看，微生物僅在需要時（存在底物時）才合成某些酶，在不需要時便不合成，這就避免了生物合成的原料和能量的浪費(fèi)。（二）酶合成的反饋?zhàn)瓒?當(dāng)代謝途徑中某終產(chǎn)物過量時，或培養(yǎng)基中已提供了此產(chǎn)物時，就會阻遏自身合成途徑中第一個酶或其它關(guān)鍵酶的進(jìn)一步合成，從而控制代謝的進(jìn)行，減少終產(chǎn)物的生成。這種效應(yīng)稱為終產(chǎn)物阻遏（end product repression），通常稱為反饋?zhàn)瓒簦╢eedback repression）。例如，大腸桿菌色氨酸合成酶（tryptophane synt

41、hetase）的生成就受到這種效應(yīng)的調(diào)控，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入色氨酸時，在23min內(nèi)細(xì)胞中酶的生物合成就停止了。 酶的阻遏在微生物中是很普遍的現(xiàn)象，常出現(xiàn)在與氨基酸、嘌呤、嘧啶的生物合成有關(guān)的酶中。 微生物具有終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使得微生物在已合成足夠它需要的物質(zhì)時，或由外源加入該物質(zhì)時，就停止生成其有關(guān)合成的酶類；而當(dāng)該物質(zhì)缺乏時，又開始生成這些酶，這種調(diào)節(jié)對微生物的好處也是顯而易見的，可以節(jié)約細(xì)胞內(nèi)大量的能量和原料。（三）酶合成的誘導(dǎo)和阻遏的機(jī)制 酶的誘導(dǎo)和阻遏以相反方向影響酶的生物合成，它們的作用機(jī)制是相似的，可以用Jacob和Monod提出的操縱子模型（Operon Model）來解釋

42、，并已得到實(shí)驗(yàn)上的證明。1. 操縱子學(xué)說 Jacob和Monod等于1960年代提出了操縱子學(xué)說，其要點(diǎn)是：在染色體的DNA鏈上有調(diào)節(jié)基因和操縱子（operon），操縱子包括一串功能相關(guān)連的結(jié)構(gòu)基因、操縱基因和啟動子。結(jié)構(gòu)基因（structural gene）攜帶遺傳信息，酶的合成是以結(jié)構(gòu)基因?yàn)槟０?，在RNA聚合酶作用下轉(zhuǎn)錄出mRNA ，mRNA在核糖體上通過tRNA轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)（酶）；操縱基因（operator gene）不編碼蛋白質(zhì)，是與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的部位，控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄；啟動子（promotor）不編碼蛋白質(zhì)，是與RNA聚合酶結(jié)合的部位，只有RNA聚合酶與啟動子結(jié)合后，才能啟動

43、結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，啟動子是比較短的DNA片段，約100個核苷酸對；調(diào)節(jié)基因（regulatory gene）編碼一種稱為調(diào)節(jié)蛋白的特殊蛋白質(zhì)，這是一種變構(gòu)蛋白，有兩個位點(diǎn)，一個位點(diǎn)與操縱基因結(jié)合，另一位點(diǎn)與稱為調(diào)節(jié)物的特殊小分子物質(zhì)結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的，當(dāng)調(diào)節(jié)物與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合后，便引起調(diào)節(jié)蛋白變構(gòu)，變構(gòu)了的調(diào)節(jié)蛋白能增加（即使其具有活性）或降低（即使其失去活性）與操縱基因結(jié)合的能力。2. 乳糖操縱子 大腸桿菌乳糖操縱子（圖5-9）包括三個結(jié)構(gòu)基因z、y、a（相應(yīng)編碼-半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶和-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶）和結(jié)構(gòu)基因前面的操縱基因（O）和啟動子（P），這三種酶都能被乳糖或-半乳糖苷系列

44、化合物所誘導(dǎo)。其作用機(jī)制是：當(dāng)不存在誘導(dǎo)物時，由調(diào)節(jié)基因所合成的阻遏物附著在操縱子“O”的部位，此時從啟動子部位開始的由RNA聚合酶合成mRNA的活動受到了阻遏，酶就無法生成。如果有誘導(dǎo)物質(zhì)存在，阻遏物與誘導(dǎo)物質(zhì)相結(jié)合失去了阻遏活性，此時與操縱基因相結(jié)合的部位就被解除了，從而能進(jìn)行mRNA的合成，此時酶即可產(chǎn)生。此外，cAMP以及CRP（cAMP receptor protein）都參與乳糖操縱子的調(diào)控，當(dāng)cAMP和CRP相結(jié)合附著在啟動子上游部位時，就能促進(jìn)從啟動子部位開始的RNA聚合酶的活動。 若操縱基因發(fā)生突變，就會降低它對阻遏蛋白的親和力，而在沒有誘導(dǎo)物的情況下也能提高這三個酶的合成速

45、度，這稱為操縱區(qū)組成突變體（Oc突變體）。另外還有阻遏物基因突變（Rc），不再產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白，因而就解除了控制。圖5-9 大腸桿菌乳糖操縱子的作用機(jī)制根據(jù)乳糖操縱子的作用機(jī)制可以畫出誘導(dǎo)的模式圖（圖5-10）。圖5-10 誘導(dǎo)的模式圖從模式圖可以看出誘導(dǎo)酶的合成機(jī)制，其本質(zhì)就是解阻遏（誘導(dǎo)物解除了阻遏蛋白對操縱基因的阻塞）。值得注意的是，這種誘導(dǎo)物與阻遏蛋白的結(jié)合是可逆的，結(jié)合或解除結(jié)合取決于細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)物的濃度。正因?yàn)榻Y(jié)合是可逆的，所有調(diào)節(jié)可以雙向進(jìn)行。3. 色氨酸操縱子 大腸桿菌的色氨酸操縱子含有五個結(jié)構(gòu)基因和一個操縱基因，見圖5-11。圖5-11 大腸桿菌生物合成色氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制它參與從

46、分支酸（chorismic acid）生物合成色氨酸的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。由于沒有過量的色氨酸存在，阻遏物質(zhì)沒有活性，因此不能附在操縱子部位而合成mRNA。一旦加入色氨酸，無活性阻遏物則與色氨酸相結(jié)合形成活性型附在操縱子上，從而阻止mRNA的合成。所以，當(dāng)培養(yǎng)基中有可以利用的色氨酸存在時，大腸桿菌就不會合成與色氨酸合成途徑有關(guān)的酶。根據(jù)色氨酸操縱子的作用機(jī)制可以畫出反饋?zhàn)瓒裟Ｊ綀D（圖5-12）。圖5-12 反饋?zhàn)瓒裟Ｊ綀D從模式圖可看到，反饋?zhàn)瓒裟Ｐ椭?，操縱子的開關(guān)情況正好與誘導(dǎo)模型相反。反饋?zhàn)瓒糁钥梢酝瑫r反饋調(diào)節(jié)相關(guān)的幾個酶，其原因即在于一條合成代謝途徑中的幾個酶的結(jié)構(gòu)基因往往成串地分布在同一個

47、操縱子上，或者盡管分散在不同的操縱子上，但這些操縱子受同一個調(diào)節(jié)基因編碼的原阻遏物的控制，因而有協(xié)同作用。 如果對應(yīng)于合成途徑的操縱子的操縱基因發(fā)生突變或調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使操縱基因的阻塞無法實(shí)現(xiàn)，那么該突變株就可以解除反饋?zhàn)瓒?，過量合成該途徑的酶和終產(chǎn)物。這樣的突變株可能在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。二、分解代謝產(chǎn)物阻遏分解代謝物阻遏（Catabolite repression）簡稱分解阻遏，在微生物代謝中普遍存在，即微生物在含有能分解的兩種底物的培養(yǎng)基中生長時，首先分解快速利用的碳、氮源底物，而不分解慢速利用的碳、氮源底物。是微生物在長期進(jìn)化過程中形成的一種重要代謝調(diào)節(jié)方式。1. 二次生長現(xiàn)象與葡萄糖

48、效應(yīng) 1942年Monod等研究大腸桿菌在同時含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中的生長情況，出現(xiàn)了二次生長（diauxie）現(xiàn)象。即在第一階段快速生長，大腸桿菌優(yōu)先利用葡萄糖作為能源和碳源，當(dāng)葡萄糖消耗完畢，細(xì)菌生長速度出現(xiàn)了一個下降的間隙（大約幾分鐘），然后又慢慢回升為第二階段，此時它改用乳糖作能源和碳源，生長速度比第一階段稍慢一些（見圖5-13）。從細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，在第一生長階段中，細(xì)胞內(nèi)的-半乳糖苷酶活性很低。由此可見，細(xì)菌在利用葡萄糖時，乳糖操縱子的表達(dá)受限制；當(dāng)葡萄糖耗盡時，生長明顯下降，幾分鐘后，細(xì)菌開始利用乳糖生長，此時測得的-半乳糖苷酶活性要比第一階段高得多。當(dāng)時把這種葡萄糖干擾其他碳

49、源利用的現(xiàn)象稱為“葡萄糖效應(yīng)”。隨后的研究表明：葡萄糖效應(yīng)并非由葡萄糖直接造成，而是其某種分解代謝產(chǎn)物所引起的。葡萄糖分解的某種產(chǎn)物阻遏了能夠產(chǎn)生該物質(zhì)的酶的合成，例如產(chǎn)氣桿菌的組氨酸裂解酶將組氨酸分解為-酮戊二酸和氨，而葡萄糖也可以降解為-酮戊二酸，故能阻遏組氨酸裂解酶的合成。如果某種酶的作用產(chǎn)物沒有與葡萄糖（或其它快速利用碳源）分解中間產(chǎn)物相同的物質(zhì)，便不發(fā)生葡萄糖效應(yīng)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對其分子機(jī)制的闡明，1961年的一次生物學(xué)會議上正式定名為“分解代謝物阻遏”這個術(shù)語來代替“葡萄糖效應(yīng)”這一俗稱。圖5-13 大腸桿菌在葡萄糖和乳糖混合碳源上的二次生長a靠葡萄糖生長，葡萄糖阻遏-半乳

50、糖苷酶的合成；b靠乳糖合成研究表明，分解阻遏并不僅限于葡萄糖，其它碳源和氮源（如NH4+、谷氨酰胺等）也能起相同作用。例如，固氮菌在NH4+存在時，固氮作用完全被阻遏。這種阻遏機(jī)制對微生物是很有利的，只要有一個容易同化的底物存在，細(xì)胞就不必耗費(fèi)能量和原料去合成效率較低的途徑的酶系，而使其代謝作用能更多地用于產(chǎn)生生長所必需的組分，因此，分解代謝物阻遏也是細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的一個方面。2. 分解代謝產(chǎn)物的阻遏機(jī)制 對分解阻遏機(jī)制的研究證明，葡萄糖的作用不是影響其它碳源進(jìn)入細(xì)胞，而是使細(xì)胞內(nèi)缺少cAMP而引起的。R.S.Makman等（1965年）發(fā)現(xiàn)生長在葡萄糖上的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)cAMP含量非常低（僅510

51、-7mol/L），-半乳糖苷酶合成也很少；當(dāng)葡萄糖耗盡后，cAMP濃度增高（達(dá)10-4mol/L），-半乳糖苷酶的合成顯著提高。相反，若先將細(xì)胞培養(yǎng)在葡萄糖含量很少的培養(yǎng)基中，然后迅速加入葡萄糖，則發(fā)現(xiàn)葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物對腺苷酸環(huán)化酶起抑制作用，而對磷酸二酯酶和cAMP透過酶起激活作用，從而造成cAMP被排出體外，體內(nèi)cAMP驟減；當(dāng)培養(yǎng)基液中同時含有葡萄糖與其它碳源時，體內(nèi)cAMP含量介乎上述二者之間。由此可見培養(yǎng)基中葡萄糖含量與細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度有一定關(guān)系。如果在培養(yǎng)基中加入cAMP，能解除因存在葡萄糖而使-半乳糖苷酶受到抑制的現(xiàn)象。 乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄需要cAMP，因?yàn)閏AMP與CRP（

52、cAMP受體蛋白，cyclic AMP receptor protein；或稱代謝產(chǎn)物活化蛋白，catabolite activator protein，CAP）形成的復(fù)合物可結(jié)合到乳糖操縱子的啟動基因（P）部位，而且只有當(dāng)發(fā)生這種結(jié)合時，乳糖操縱子才有可能被轉(zhuǎn)錄。這是因?yàn)閏AMP和CRP的復(fù)合物能通過與某些操縱子的啟動子結(jié)合而刺激轉(zhuǎn)錄，CRP與操縱子DNA的結(jié)合創(chuàng)造了一個新的供RNA聚合酶結(jié)合上去的位點(diǎn)的緣故。圖5-14是根據(jù)大腸桿菌分解代謝物阻遏的事實(shí)編繪的模式圖。圖5-14 分解代謝物阻遏模式圖當(dāng)葡萄糖耗完時，cAMP濃度上升，它與CRP結(jié)合后一起去激活啟動基因（P），提高RNA聚合酶與

53、P的親和能力，同時由于乳糖的誘導(dǎo)作用，乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄開始，從而誘導(dǎo)酶的合成。從圖中看出，有CRP存在時，cAMP才能表現(xiàn)其正調(diào)節(jié)作用（即解除對誘導(dǎo)酶的阻遏），如果某突變株的CRP基因缺失或突變，因而沒有正常的CRP產(chǎn)生，則對葡萄糖分解代謝阻遏的酶系不能起解阻遏作用。 在正常情況下，為受分解代謝物阻遏的酶系編碼的操縱子的啟動受cAMP-CRP復(fù)合物的調(diào)節(jié)。如果對應(yīng)操縱子的啟動子發(fā)生突變，使其與RNA聚合酶的親和力大大增加，從而排除cAMP-CRP對誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。這樣的突變株可能解除了分解代謝物阻遏。在生產(chǎn)實(shí)踐上有時使用一些避免引起分解阻遏的物質(zhì)，如青霉素發(fā)酵中常利用乳糖代替部分葡萄糖以提高青

54、霉素產(chǎn)量；如培養(yǎng)基中必須添加引起分解阻遏的物質(zhì)時，可采用分批添加或連續(xù)流加方式。三、酶活性的反饋抑制微生物的代謝調(diào)節(jié)控制解除了上述的調(diào)節(jié)合成酶量之外，還有調(diào)節(jié)已有酶活性的機(jī)制。酶活性調(diào)節(jié)是通過改變已存在的酶分子活性來調(diào)節(jié)代謝速度，包括酶活性的激活和抑制。能夠激活的物質(zhì)稱為激活劑（activator），抑制酶活性的物質(zhì)稱為抑制劑（inhibitor）。 調(diào)節(jié)酶活力比調(diào)節(jié)酶的合成更迅速及時而有效，這是微生物饑餓情況下的一種經(jīng)濟(jì)的調(diào)節(jié)方式。通過改變代謝途徑中一個或幾個關(guān)鍵酶的活力，以影響代謝途徑中各中間化合物的流量。這種活力調(diào)節(jié)通常由一特異的小分子代謝物（終產(chǎn)物等變構(gòu)效應(yīng)物）與酶的可逆性結(jié)合來進(jìn)行。

55、 在酶活性調(diào)節(jié)中，終產(chǎn)物對其合成途徑第一個酶的活性產(chǎn)生抑制效應(yīng)，叫做終產(chǎn)物抑制或者反饋抑制（feedback inhibition）。如圖5-7所示，末端代謝產(chǎn)物從主代謝途徑分出來，以其自己單獨(dú)的代謝途徑來抑制起初的酶1的酶活性，這樣的功能叫做反饋抑制。受到反饋抑制的酶，由于其作用底物與起抑制作用的終產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同，因此，不存在競爭性抑制關(guān)系。那么，為什么終產(chǎn)物過多時會抑制酶的活性，而在終產(chǎn)物濃度降低時，這種抑制作用又消失呢？Jacob和Monod等1963年提出了變構(gòu)酶（allosteric enzymes）學(xué)說，從而解釋了這種抑制作用機(jī)制。 研究認(rèn)為，受反饋抑制的酶一般是變構(gòu)酶（

56、又稱別構(gòu)酶），酶活力調(diào)控的實(shí)質(zhì)就是變構(gòu)酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)。變構(gòu)酶含有兩條或兩條以上的多肽鏈，具有至少兩個立體專一性不同的結(jié)合位點(diǎn)：一個是活性部位（或活性中心，催化中心），是與底物結(jié)合的部位；另一部位稱為變構(gòu)部位或別構(gòu)部位，與調(diào)節(jié)物（激活劑或抑制劑）非共價地可逆性結(jié)合的部位。酶的活性部位與變構(gòu)部位處于不同的空間位置。酶與調(diào)節(jié)物（例如終產(chǎn)物）復(fù)合體的形成引起酶分子的三級或四級結(jié)構(gòu)的可逆性變化，酶構(gòu)型的變化影響了底物與活性中心的結(jié)合，從而影響酶的催化效應(yīng)。終產(chǎn)物和酶的調(diào)節(jié)中心的結(jié)合是可逆的，因此當(dāng)終產(chǎn)物的濃度降低時，終產(chǎn)物與酶的結(jié)合隨即解離，從而恢復(fù)了酶蛋白的原有構(gòu)象，使酶與底物可以結(jié)合而發(fā)生催化作用。變

57、構(gòu)酶的作用程序如下：專一性的代謝物（變構(gòu)效應(yīng)物）與酶蛋白表面的特定部位（變構(gòu)部位）結(jié)合酶分子的構(gòu)象變化（變構(gòu)轉(zhuǎn)換）活性中心的修飾抑制或促進(jìn)酶活性。 由于反饋抑制使代謝鏈的第一個酶失去活性，因此其他的中間代謝產(chǎn)物也就不再被合成了。從利用能量的角度來看，這一點(diǎn)是最經(jīng)濟(jì)的，而且很有利用價值。在微生物的代謝活動中，三磷酸腺苷（ATP）是為許多反應(yīng)提供能量的高能化合物。ATP釋放出能量后轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷（ADP）或單磷酸腺苷（AMP），也可以由AMP或ADP合成ATP。ATP、ADP和AMP參與許多代謝反應(yīng)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞的能量狀態(tài)及其變構(gòu)調(diào)節(jié)物的均衡可用細(xì)胞的能荷（Energy charge，EC）來表示

58、，即ATPADPAMP系統(tǒng)中充滿高能磷酸根的程度。如果細(xì)胞中所有的腺苷酸都是ATP，則腺苷酸系統(tǒng)是滿荷的，此時的能荷可看作是1；如所有腺苷酸都是AMP，其系統(tǒng)的能荷為0；如果所有腺苷酸都是ADP，或?yàn)锳TP和AMP的等摩爾數(shù)混合物，其能荷為0.5。大腸桿菌在生長期的EC值為0.8，穩(wěn)定期時逐漸降低到0.5，當(dāng)EC值小于0.5時，細(xì)胞將死亡。已知細(xì)胞中ATP、ADP和AMP濃度，系統(tǒng)的能荷可按下式計算出來：EC= ATP+ADP/2 ATP+ADP+AMP酶活性受到細(xì)胞能荷的調(diào)節(jié)。能荷不僅能調(diào)節(jié)分解代謝形成ATP的酶活性，也能調(diào)節(jié)合成代謝利用ATP的酶活性，依賴能荷對生成和消耗ATP的反應(yīng)的調(diào)節(jié)

59、，微生物可以維持恒定的能量狀態(tài)，即恒定的能荷值。例如異檸檬酸脫氫酶和磷酸果糖激酶等分解代謝途徑中的酶受到高能荷的抑制，而丙酮酸羧化酶、乙酰CoA羧化酶和天門冬氨酸激酶等合成代謝途徑中的酶在同樣的高能荷下被激活。巴斯德在研究釀酒發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵作用與氧的濃度成反比。即厭氧條件下酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧條件下，酵母菌進(jìn)行呼吸作用，葡萄糖的消耗受到抑制，酒精產(chǎn)量也降低。這種呼吸抑制發(fā)酵作用的現(xiàn)象被后人稱為巴斯德效應(yīng)（Pasteur effect），巴斯德效應(yīng)的本質(zhì)是能荷調(diào)節(jié)，這種效應(yīng)的主要原因在于糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）途徑對ADP和Pi的競爭作用。在有氧條

60、件下，TCA循環(huán)活潑，呼吸鏈的氧化磷酸化大量合成ATP，細(xì)胞能荷增加，異檸檬酸脫氫酶受到ATP抑制，導(dǎo)致檸檬酸的積累，檸檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制劑，而該酶的激活劑又因線粒體對其有很高的親和力而競爭去了，因而它往往處于失活狀態(tài)，從而限制了葡萄糖的利用速度；在厭氧條件下，酵母菌無法通過呼吸鏈產(chǎn)生ATP，細(xì)胞能荷較低，ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生產(chǎn)酒精的速度加快。圖515說明了巴斯德效應(yīng)的機(jī)理。圖515 巴斯德效應(yīng)的本質(zhì)PFK磷酸果糖激酶；ID異檸檬酸脫氫酶；（E）表示抑制四、微生物代謝調(diào)節(jié)的特性 微生物細(xì)胞內(nèi)存在許多代謝途徑，這些途徑彼此之間錯綜復(fù)雜地連結(jié)在一起，在