《酶工程復習提綱》word版

1、酶工程復習提綱第二章 酶的定義、組成、特征及分類 一、從化化學本質上講酶到底是一種什么物質？二、一般催化劑的特性：1.只能進行熱力學上允許進行的反應；2.可以縮短化學反應到達平衡的時間，而不改變反應的平衡點；3.通過降低活化能加快化學反應速度。4.它本身的數(shù)量和化學性質在化學反應后不發(fā)生改變。三、酶作為催化劑的顯著特點：高效、專一、溫和、可調節(jié)四、酶的分類(一)、酶的組成分類單純酶:它們的組成為單一的蛋白質。 結合酶（全酶）: 蛋白質（酶蛋白）+輔因子酶蛋白決定反應的特異性，輔因子決定反應的類型與性質。輔因子： 輔酶：與酶蛋白結合疏松，可用透析或超濾的方法除去的輔因子。 輔基：與酶蛋白結合緊密

2、，不能可用透析或超濾的方法除去的輔因子。(二)、酶的結構分類(1)、單體酶(monomeric enzyme) :僅具有三級結構的酶，即只由一條肽鏈組成的酶。 (2)、寡聚酶(oligomeric enzyme)：兩個或兩個以上的相同或不同亞基以共價鍵方式連接而形成的酶。 (3)、多酶復合體(多酶體系，multienzyme system):由幾種功能不同的酶聚合在一起，分工合作。共同催化一個生化反應過程。 (4)、多功能酶(multifunctional enzyme)：一些多酶體系在進化的過程中由于基因融合，致使多種不同催化功能存在于一條多肽鏈上，這種一條肽鏈具有多種催化功能的酶叫多功能酶

3、。（三）、酶的功能組成酶的活性中心 酶的活性中心：與底物結合并進行催化反應的特殊的必需基團。 結合基團：決定酶的專一性活性中心內的必需基團必需基團： 催化基團：決定酶的催化性質活性中心外的必需基團：維持酶的空間結構和催化功能所必需的基團五、酶的專一性;第三章 酶的作用機理一、酶作用專一性的機制(一)“三點結合”的催化理論三點結合”的催化理論認為酶與底物的結合處至少有三個點，只有當三點完全結合的情況下。催化作用才能實現(xiàn)，酶促反應才能進行。（二）鎖鑰學說鎖鑰學說認為整個酶分子的天然構象是具有剛性結構的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結合如同一把鑰匙對一把鎖一樣，那把鑰匙開那把鎖。也就是說，只有當

4、底物的形狀與酶的活性中心的構象完全匹配時，酶與底物才能結合，催化反應才能進行。(三)誘導嵌合學說(Induced fit model）酶活性中心的結構有一定的靈活性，當?shù)孜铮せ顒┗蛞种苿┡c酶分子結合時，在底物的誘導下，酶蛋白的構象發(fā)生了有利于與底物結合的變化，使反應所需的催化基團和結合基團正確地排列和定向，這樣酶與底物才能很好地結合，酶促反應才得以進行。二、酶高效催化的機制 (一)、酶為什么能催化化學反應、分子發(fā)生化學反應的必要條件：活化能和能障在化學反應體系中，并不是所有的分子都能參加化學反應，只有那些所含能量達到或超過一定限度（平均能量）的分子才能參與反應。這些能參與反應的分子稱為活化

5、分子，由常態(tài)分子轉變?yōu)榛罨肿铀璧哪芰糠Q為活化能?；罨肿雍械哪軈⑴c化學反應的最低限度的能量稱為化學反應的能閾或能障。因此，只有那些所含能量大于能障的分子才能參與化學反應。在一個化學反應體系中，活化分子越多，反應就越快。所以，設法增加活化分子數(shù)，就能加速化學反應。、增加活化能（活化分子）的途徑增加活化分子有兩種可能的途徑：一是加熱或光照射增加能量，使一部分分子獲得能量而活化，直接增加活化分子數(shù)目，以加速化學反應的進行。另一種途徑是降低活化能的閾值，間接增加活化分子數(shù)目。催化劑的作用就是降低反應的活化能。酶是如何降低化學反應的活化能的呢？（二）、有關酶高效率機理的假說 1、中間產物學說中間產

6、物學說是目前較公認的解釋酶作用機理的理論。這個理論認為：在酶促反應中，底物先與酶結合，形成不穩(wěn)定的中間產物ES復合物，然后再分解釋放出酶與產物。ES的形成，改變了原來反應的途徑。酶的活性中心與底物分子通過短程非共價鍵(如氫鍵,離子鍵和疏水鍵等)的作用，形成ES復合物，使底物的價鍵狀態(tài)發(fā)生形變或極化，從而激活底物分子和降低過渡態(tài)活化能，使底物的活化能大大降低，結果使反應加速。 2.趨近效應(approximation)和定向效應(orientation)通常底物濃度與化學反應速度成正比。若在反應系統(tǒng)的某一局部區(qū)域，底物濃度增高，則反應速度也隨之提高。趨近效應指由于活性中心的立體結構和相關基團的誘

7、導和定向作用，使底物分子中參與反應的基團相互接近，底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，并被嚴格定向定位，從而降低了進入過渡態(tài)所需的活化能。使酶促反應具有高效率。酶的活性中心部位，一般都含有多個起催化作用的基團，這些基團在空間有特殊的排列和取向，可以對底物價鍵的形變和極化及調整底物基團的位置等起到協(xié)同作用，從而使底物達到最佳反應狀態(tài)。3、張力作用(distortion or strain)底物的結合可誘導酶分子構象發(fā)生變化，比底物大得多的酶分子的三、四級結構的變化，也可對底物產生張力作用，使底物扭曲，促進ES進入活性狀態(tài)。4、酸堿催化 (acid-base catalysis)酸和堿是有機反應中

8、用途最廣和最普遍的催化劑。酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應一般都是廣義的酸堿催化方式。廣義酸堿催化是指通過質子酸提供部分質子,或是通過質子堿接受部分質子的作用，達到降低反應活化能的過程。酶的活性中心具有某些氨基酸殘基的R基團，這些基團往往是良好的質子供體或受體，在水溶液中這些廣義的酸性基團或廣義的堿性基團對許多化學反應是有力的催化劑。如氨基、羧基、巰基、酚羥基及咪唑基等。影響酸堿催化反應速度的因素有兩個：第一個因素是酸堿的強度。第二個因素是這些功能基供出質子或接受質子的速度。共價催化：催化劑通過與底物形成反應活性很高的共價過渡產物，使反應活化能降低，從

9、而提高反應速度的過程，稱為共價催化。某些酶與底物結合形成一個反應活性很高的共價中間產物，這個中間產物以較大的機率，轉變?yōu)檫^渡態(tài)，因此反應的活化能大大降低，底物可以越過較低的能障而形成產物。5、共價催化作用可分為親核催化作用和親電子催化作用兩大類。 親核催化作用：親核催化是指具有一個非共用電子對的基團或原子，攻擊缺少電子具有部分正電性的原子，并利用非共用電子對形成共價鍵催化反應。酶分子中具有催化功能的親核基團主要是：組氨酸的咪唑基、絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基。此外，許多輔酶也具有親核中心。酶中參與共價催化的基團主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等。 親電

10、子催化作用：在親電子催化作用中，催化劑和底物的作用與親核催化相反，就是說，親電子催化劑缺少電子，從底物中吸取一個電子對形成共價鍵催化反應。酶分子親電子的基團有親核堿基被質子化的共軛酸，如NH3+。在酶的親電子催化過程中，有時其必需的親電子物質不是上述的共軛酸，而是由酶中非蛋白組成的輔因子提供，其中金屬陽離子是很重要的一類。6、金屬離子催化作用（1）、提高水的親核性能：金屬離子可以和水分子的OH-結合，使水顯示出更大的親核催化性能。 （2）、電荷屏蔽作用（3）、電子傳遞中間體 第四章 影響酶促反應速度的因素一、底物濃度對酶反應速度的影響 （一）、單底物反應 1、米氏方程 底物濃度較低時，增加底物

11、濃度可加快酶促反應速度。當?shù)孜镲柡蜁r，酶促反應速度不會再隨底物濃度的增加而加快。底物濃度與酶促反應速度的關系通常用米氏方程來表示： 2、米氏常數(shù)的定義米氏常數(shù)是酶促反應速度達到最大反應速度的一半時的底物濃度。 Km是一個物理常數(shù)。 米氏常數(shù)的單位是mM。3、米氏常數(shù)的意義 （1）Km是酶的一個特征性常數(shù)，只與酶的性質有關，與酶的濃度無關。 （2）如酶能催化幾種不同的底物，對每種底物都有一個特定的Km值，其中Km值最小的稱該酶的最適底物。 （3）Km除了與底物類別有關，還與pH、溫度有關。 （4）Km表示酶和底物的親和力。 Km越大，表示和底物的親和力越小。判斷代謝反應的方向、途徑和限速步驟等。

12、 二、酶的抑制作用和抑制作用動力學 （一）、什么是抑制作用（inhibition）? 某些物質使酶活力下降的作用叫抑制作用，這些使酶活力下降的物質，稱為抑制劑（Inhibitor, I)（二）、抑制作用的種類 1、不可逆抑制（irreversible inhibition）：抑制劑與酶的必需基團以共價鍵結合，不能用稀釋或透析去除抑制劑使得酶活力恢復。 2、可逆抑制作用(reversible inhibition)及其動力學（1）競爭性抑制作用（competitive inhibition） 定義：抑制劑與底物競爭酶的活性結合部位競爭性抑制作用的特點：Km增加、Vmax不變（2）非競爭性抑制作用

13、（noncompetitive inhibition） 定義： I與S同時結合到酶的不同部位上 特點：Km不變、Vmax降低（3）反競爭性抑制作用（uncompetitive inhibition）定義：只有酶和底物結合之后，抑制劑才與酶和底物的 復合物結合。特點：Km降低、Vmax降低（三）一些重要的抑制劑及其實際意義 有機磷化合物 ：有機磷化合物能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，特別是強烈抑制膽堿酯酶。 巰基酶抑制劑 ：A、烷化劑：B、有機汞、有機砷化合物 重金屬抑制劑 ：Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等金屬鹽能使大多數(shù)酶失活。 第五章 核酶和抗體酶一、核酶的發(fā)現(xiàn)1982年Cech等發(fā)現(xiàn)

14、四膜蟲細胞大核期間26SrRNA前體具有自我剪接功能，并于1986年證明其內含子L-19IVS具有多種催化功能。1995年Cuenoud等發(fā)現(xiàn)有些DNA分子亦具有催化活性。稱之為脫氧核酶。 二、核酶作用的特點 1、化學本質：RNA 2、底物：RNA 3、反應特異性(專一性）堿基 4、催化效率 低 5、核酶是一種金屬依賴酶。金屬離子起以下的作用： （1）、特異的結構作用，或參與活性部位的化學過程 （2）、促進RNA的總體折疊 （3）、二價金屬離子（如Mg 2+ ）與底物活性部位直接相互作用，參與過渡中間復合物的形成三、核酶的應用1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人們已進行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV

15、)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。人工設計核酶多為錘頭狀結構，少部分是采用發(fā)夾狀核酶。 2、抗人類免疫缺陷病毒型（HIV- )。核酶免疫源性低，很少引起免疫反應。 1998年，美國加利福尼亞大學Wong-Staal等利用發(fā)夾核酶抑制HIV- 基因表達，并率先進入臨床期。 3、抗腫瘤治療 核酶能在特定位點準確有效地識別和切割腫瘤細胞的mRNA,抑制腫瘤基因的表達，達到治療腫瘤的目的。4、抑制疾病基因的表達和基因治療 通過識別特定位點而抑制目標基因的表達，抑制效率高，專一性強。針對錘頭核酶而言，催化結構域小，既可作為轉基因表達產物，也可以直接以人工合成的寡

16、核苷酸形式在體內轉運。 5、 在其他領域的應用 防治動、植物 病毒侵害：馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒負鏈的多價核酶構建，馬鈴薯卷葉病毒復制酶基因負鏈的突變核酶的克隆等。四、核酶技術面臨的問題1、核酶催化切割反應的可逆性問題，定向反應2、催化效率較低，設法提高催化效率3、尋找合適載體將核酶高效、特異地導入靶 細胞4、使核酶在細胞內有調控地高效表達5、增強核酶在細胞內的穩(wěn)定性6、對宿主的損傷問題有待進一步考察五、抗體酶（abzyme） （一）、抗體酶的定義： 抗體酶或催化抗體（Catalytic antibody)是指具有酶催化活性的抗體。是一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦

17、予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生物學與化學的理論與技術交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結合的產物?？贵w：與抗原特異結合的免疫球蛋白?？贵w酶：指具有催化功能的抗體分子，在抗體分子的可變區(qū) （即肽鏈的N端）是識別抗原的活性區(qū)域，這部分區(qū)域被賦予了酶的屬性。（二）、抗體酶的催化特征1、抗體酶的特點（與天然酶相比）：（1） 能催化一些天然酶不能催化的反應（2）有更強的專一性和穩(wěn)定性（3）催化作用機制不同 2、抗體酶和非催化性抗體作用的比較（1）更高的反應特異性（2）反應的可逆性（3）反應的量效性（4）反應過程（三）、抗體酶的催化作用機理1、過渡態(tài)理論與抗體酶2、抗體酶催化的三種重要

18、反應機制 水解作用機制 基團轉移 連續(xù)反應機制3、抗體酶催化反應的介質效應 酯解反應中介質效應 ：抗體酶在有機溶 劑中具穩(wěn)定性。 脫羧反應中介質效應 ；有機溶劑引起脫羧反應速率增加。 ?；D移反應中介質效應 ：在疏水溶劑中，活性較高。（四）、抗體酶的制備 1、細胞融合法：2、抗體結合位點化學修飾法：對抗體酶進行結構修飾的關鍵是找到一種溫和的方法在抗體結合位置或附近引入具有催化功能的基團。游離巰基就是適合的基團之一，它具有高親核性，易于氧化，及能通過二硫化物進行交換反應或親電反應而選擇性修飾的特點。3、引入輔助因子法：將此半抗原通過共價鍵連接在載體蛋白免疫動物產生的抗體，在金屬離子復合物作為輔因

19、子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵 .4、用生物工程的方法產生抗體：將編碼具有抗體酶活性的Fab片斷的基因是通過細菌的形式表達出來的。5、拷貝法：用酶作為抗原免疫動物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動物并進行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對抗抗體進行篩選，獲得具有原來酶活性的抗體酶。6、共價抗原免疫法：這是在親和標記抑制劑基礎上發(fā)展起來的新的抗體酶制備方法。以親和標記劑為半抗原，則抗體結合部位將產生與親和基團電荷性質相反的基團，如親核性，親電性氨基酸，酸性氨基酸，堿性氨基酸等。 第六章 酶的分離純化一、沉淀分離：1、沉淀劑的類型2、使用注意事項沉淀分離方法分離原理 鹽析沉

20、淀法利用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質分離等電點沉淀法利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質有不同的等電點這一特性，通過調節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離復合沉淀法在酶液中加入某些物質，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質分離二、層析分

21、離 層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達到物質分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質的等電點特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現(xiàn)組分分離 （一）離子交換層析1、如何根據(jù)酶的特性選擇離子交換介質？2、如何根據(jù)離子交換介質的特性選擇緩沖體系？ （二）凝膠層析操作（裝柱、

22、洗滌及洗脫）過程中要注意那些問題？ （三）親和層析的原理及操作要點第七章 固定化酶一、什么是固定化酶？通過化學方法將水溶性酶與不溶性載體鉸鏈而形成的不溶性酶稱為固定化酶。與天然酶比較，固定化酶具有可多次重復使用、可以裝塔連續(xù)反應、 純化簡單、 能提高產物質量、應用范圍廣 等多種優(yōu)點。二 固定化酶的優(yōu)缺點優(yōu)點： 可多次重復使用 可以裝塔連續(xù)反應 純化簡單 提高產物質量 應用范圍廣 缺點： 首次投入成本高 大分子底物較困難三、影響固定化酶性質的因素 1 酶本身的變化： 主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。 2 載體的影響 （1） 分配效應 （2） 空間障礙效應 （3）

23、擴散限制效應 3. 固定化方法的影響四、固定化后酶性質的變化1 固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應速度下降。 原因：酶結構的變化空間位阻2 固定化對酶穩(wěn)定性的影響 （1） 操作穩(wěn)定性提高 （2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。 (3 ) 對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。 (4 ) 對分解酶的穩(wěn)定性提高。 （5） 對變性劑的耐受力升高固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：a. 固定化后酶分子與載體多點連接。 b. 酶活力的釋放是緩慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。3、米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質變化（1） 載體與底物帶相同電荷，KmKm固定化酶降低了酶的親和力。 （2） 載體與底

24、物電荷相反，靜電作用，KmKm 五、固定化酶的制備（一）、各類固定化方法的特點比較: 比較項目 吸附法 結合法 交聯(lián)法 包埋法 物理吸附 .共價鍵結合 離子鍵結合 制備難易 易 難 易 較難 較難 固定化程度 弱 強 中等 強 強 活力回收率 較高 低 高 中等 高 載體再生 可能 不可能 可能 不可能 不可能 費用 低 高 低 中等 低 底物專一性 不變 可變 不變 可變 不變 適用性 酶源多 較廣 廣泛 較廣 小分子底物、藥用酶 （二） 選擇方法依據(jù)： （1） 酶的性質 （2） 載體的性質 （3） 制備方法的選擇（三）選擇載體的原則 （1）要有巨大的比表面積 （2）要有活潑的表面（3）便于

25、裝柱進行連續(xù)反應（四）載體活化的方法A重氮法 B疊氮法 C烷基化反應法 D硅烷化法 E溴化氰法（五）、固定化后酶的考察項目：（1） 測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率。 （2） 考察固定化酶穩(wěn)定性 （2） 考察固定化酶最適反應條件第八章 化學酶工程第一節(jié) 酶分子的化學修飾一、酶化學修飾的定義用化學試劑對酶的側鏈基團進行共價改造，從而賦予酶分子以特殊功能和提高酶的活力的方法，稱為酶的化學修飾。二 酶的化學修飾原因1 穩(wěn)定性不夠，不能適應大量生產的需要。 2 作用的最適條件不符。 3 酶的主要動力學性質的不適應。 4 臨床應用的特殊要求。三、酶化學修飾的目的1、改變活性部位的構象。酶

26、蛋白的主鏈經蛋白酶的水解作用，去掉部分肽段或者取代蛋白質一級結構上某些氨基酸殘基，使活性部位的結構發(fā)生改變，以達到人們所需要的各種目的。 2、提高生物活性。酶分子側鏈基團的化學轉變，改變基團的電化學性質、分子內基團的相互作用力等，某些情況下能提高酶的生物活性。 3、增強酶的穩(wěn)定性。一般酶反應條件基本接近中性，但在工業(yè)應用上，由于生產條件、底物等帶來的影響，作用的pH常常不在中性；生產溫度的提高，酶往往易變性失活。這些都直接影響酶作用的發(fā)揮。用雙功能試劑讓酶分子基團之間、內部側鏈基團之間進行交聯(lián)，可以達到提高酶的穩(wěn)定性的目的。 4、降低酶類藥物的抗原性。酶是蛋白質，作為藥物使用時，這些異源蛋白進

27、入人體后可能成為抗原，誘導相應的抗體產生，這些酶類藥物就會通過抗原抗體反應被清除掉，從而不能發(fā)揮藥效，有的甚至還會產生過敏反應。通過對酶的化學修飾，可以降低酶類藥物的抗原性。 5、改變酶學性質。利用有機小分子或大分子物質對活性部位或活性部位之外的側鏈基團進行化學修飾，達到改變酶學性質的目的。四、 酶化學修飾的基本原理1 如何增強酶天然構象的穩(wěn)定性與耐熱性 2 如何保護酶活性部位與抗抑制劑 3 如何維持酶功能結構的完整性與抗蛋白水解酶 4 如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境 因此，在酶的化學修飾過程中需要注意以下幾個方面：（1）、充分了解被修飾酶。開始設計酶化學修飾反應時，對被修飾酶的活性部位、

28、穩(wěn)定條件、側鏈基團性質及酶反應的最適條件等應盡可能全面了解。（2）、修飾劑的選擇 選擇修飾劑時要求修飾劑具有較大的相對分子質量，對蛋白質的吸附有良好的生物相容性和水溶性，修飾劑分子表面有較多的活性基團，還要考慮修飾劑上的反應基團的活化方式和活化條件，以及修飾后酶活性的半衰期。（3）修飾反應條件的選擇 修飾反應一般要選擇在酶穩(wěn)定的條件下進行，盡可能少破壞酶的必需基團，選擇酶與修飾劑的結合率和酶活回收率都較高的反應條件。對反應體系中酶與修飾劑的分子比例、反應溫度、pH、時間、溶劑性質和離子強度等在確定反應條件時也必須考慮。 五、 酶修飾方法（一）、 酶分子側鏈基團的化學修飾 （二）、 酶分子表面的

29、化學修飾 （三）、 蛋白質類及其他對酶的化學修飾。六、 修飾酶的性質及特點1熱穩(wěn)定性提高 修飾劑與酶多點交聯(lián)，固定了酶的分子構象，增強酶天然構象的穩(wěn)定性減少了酶熱失活，增強了酶的熱穩(wěn)定性。 2抗原性降低 當酶被修飾以后，酶分子表面上許多抗原決定簇在反應過程中被修飾劑結合，在空間結構上使這些抗原決定簇被屏蔽，從而降低了酶分子的抗原性或抗原抗體的結合能力。3體內半衰期延長經過化學修飾后，由于增強了抗蛋白水解酶、抗抑制劑和抗失活因子的能力以及對熱穩(wěn)定性的提高，所以其半衰期都比天然酶長。4最適pH變化 修飾酶的微環(huán)境更為穩(wěn)定。5酶的動力學性質的改變A、米氏常數(shù)Km增大：交聯(lián)于酶上的大分子修飾劑造成空間

30、障礙，影響了底物對酶的接近和結合，使米氏常數(shù)Km增大。B、修飾酶抵抗各種失活因子的能力增強。C、體內半衰期的延長6對組織的分布能力變化第二節(jié) 模擬酶一模擬酶概述（一）、模擬酶的概念： 用合成高分子來模擬酶的結構、特性、作用原理以及酶在生物體內的化學反應過程，它研究吸收酶中起主導作用的因素，利用有機化學、生物化學等方法設計和合成一些較天然酶簡單的非蛋白質分子或蛋白質分子，以這些分子作為模型來模擬酶對其作用底物的結合和催化過程，也就是說，模擬酶是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結構特征，以及酶的作用機理和立體化學等特性。模擬酶又稱人工酶或酶模型，它是生物有機化學的一個分支。 （二

31、）、模擬酶的研究目的：研究模擬酶主要是為了解決酶容易受多種物理、化學因素的影響而失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑等缺點。二、模擬酶的理論基礎和策略 （一）酶學基礎 酶的催化機制： Pauling的穩(wěn)定過渡態(tài)理論(二)超分子化學基礎 主-客體化學：主體和客體在結合部位的空間及電子排列的互補三、 模擬酶的分類四、模擬酶的制備第九章 生物酶工程第一節(jié) 酶基因的克隆和表達一、酶基因的克隆1、獲得目的基因（target gene）（1）已知序列的目的基因的獲取方法：同源克隆法（PCR）人工化學合成（2）已知探針的基因的獲取方法構建基因組DNA文庫構建cDNA文庫（3）未知序列的基因的獲取方法隨機引物

32、PCR 差別顯示PCR 代表性差式分析PCR 2、選擇載體基因克隆載體的定義基因克隆載體是指可承載外源基因并將其帶入受體細胞且得以穩(wěn)定維持的DNA分子。理想克隆載體的的條件 分子?。?10 Kb），以容納較大的外源DNA。 有克隆位點（外源DNA插入點）即多個單一酶切位點； 是一個獨立的復制子，有復制起始序列，可在宿主細胞中獨立自主復制； 有足夠的copy數(shù) 帶篩選的標志：具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定； 克隆載體必須是安全的，不應含有對受體細胞有害的基因。（3）常用的克隆載體（vector）質粒（plasmid：柯斯質粒和酵母質粒） 噬菌體（phage） 病毒（virus）

33、 人工染色體3、目的基因與載體的重組（1）目的基因酶切/修飾 限制性核酸內切酶：一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶載體酶切DNA連接酶連接目的基因和載體用T4或Ecoli DNA連接酶可連接具互補黏性末端的DNA片段；用T4 DNA連接酶連接具平末端的DNA片段； 先在DNA片段末端加人工接頭，使其形成黏性末端，然后再行連接。常用的 DNA ligase：T4 DNA ligase只以雙鏈DNA為底物，不能有核苷酸的缺失只催化3端帶有羥基的斷點與5帶有磷酸基的斷點的連接 既可連接粘性末端，又可連接平末端（是目前已知的唯一的可以連接平末端的DNA連接酶）最適pH：7.2 -

34、7.8需要ATP參加反應 4、重組載體的轉化感受態(tài)細胞的制備 0-4 0.1mol/L CaCl2 冰浴15-30min 重組載體直接引入感受態(tài)細胞重組DNA導入原核細胞常用轉化或轉導，先制備細菌感受態(tài)細胞，然后用重組DNA分子轉化感受態(tài)細胞，并培養(yǎng)篩選轉化子重組DNA導入真核細胞常見的是導入酵母細胞，一般用蝸牛酶去除酵母細胞壁形成原生質體，再用CaCl2和聚乙二醇處理，重組DNA以轉化方式導入酵母細胞原生質體，將其置于再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使原生質體再生出細胞壁形成完整酵母細胞。導入哺乳動物細胞較簡便的是電穿孔法和微量注射法。體積大的動物細胞可用微量注射法將外源DNA注入細胞，如受精卵。5、重組

35、子的篩選與鑒定根據(jù)重組載體的表型抗藥性（Ampr 、Tetr）營養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)）其他marker（ a-互補篩選） 根據(jù)DNA限制性內切酶的酶譜分析利用核酸雜交和放射自顯影進行鑒定：原位雜交、Southern印跡 PCR法 DNA序列測定 免疫學法二、克隆基因的表達表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化(一)外源基因在原核細胞中的表達 目前應用最廣的是大腸桿菌表達系統(tǒng)。下面以大腸桿菌為例，講述原核生物基因表達系統(tǒng)。 1原核生物基因表達系統(tǒng)的特點 原核生物基因表達系統(tǒng)的特點如下： 只有一種RNA聚合酶(真核細胞有三種)識別原核細胞的啟動子； 表達是以操縱子為單位的； 轉

36、錄與翻譯偶聯(lián)，是連續(xù)進行的； 一般不含有內含子(intron)，缺少真核細胞轉錄后加工系統(tǒng)，故當含有內含子的真核基因在原核細胞中轉錄成mRNA前體后，其中內含子部分不能被切除； 原核生物基因的控制主要在轉錄水平，包括起始控制(啟動子控制)和終止控制(衰減子控制)； 在大腸桿菌mRNA的核糖體結合位點上，含有真核基因缺乏的轉譯起始密碼子及SD序列。 2. 真核表達體系 酵母、昆蟲、乳類動物細胞優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區(qū)域積累缺點：操作技術難、費時、經濟方法：磷酸鈣轉染DEAE葡聚糖介導轉染電穿孔 脂質體轉染 顯微注射 第二節(jié) 酶分子的改造一、概

37、述1、為什麼要改造酶分子？ 多數(shù)天然酶在工業(yè)生產的條件下，難以具備商業(yè)價值的酶學特性，對天然酶進行分子水平的改造，以獲得比天然酶活力更高或催化能力更強的新的非天然酶或改造天然酶。2、酶分子改造的內容 主要兩方面：理性設計和非理性設計 （1）理性設計 在研究天然酶及其突變體時，通常先獲得酶分子特征、空間結構以及結構與功能的關系等方面信息，這些用各種生物化學、光譜學、晶體學等方法來解決，然后根據(jù)這些信息進行酶分子的改造，這就是酶分子的理性設計，它包括化學修飾、定點突變等。 （2）非理性設計：不需準確知道酶蛋白結構與功能等信息，直接通過隨機突變、篩選等方法進行酶分子的改造，稱為酶分子的非理性設計，如

38、定向進化、雜合進化等。目前用于進行酶分子的改造方法主要是定點突變。二、改造酶分子的常用方法（一）、酶的定點突變 1、概念：定點突變(site-directed mutagenesis，SDM)指在基因的特定位點引入突變，即通過取代、插入或刪除已知DNA序列中特定的核苷酸序列來改變酶蛋白結構中某個或某些特定的氨基酸，以此來提高酶對底物的親和力，增強酶的專一性等。定點突變方式多樣，有改變特定的核苷酸，也有對一段最可能影響酶的功能與性質的基因序列進行隨機突變，從而產生一系列突變酶蛋白分子。 2、優(yōu)點：突變率高、簡單易行、重復性好的特點。 3、應用：定點突變技術通?？梢杂糜诟淖兒塑账嵝蛄蝎@得突變基因，

39、研究基因的結構與功能的關系；還能夠通過改變特定的氨基酸獲得突變酶蛋白，研究基因表達調控、基因結構與功能及蛋白質性質等，從微觀水平來闡明正常狀態(tài)下基因的調控機理以及疾病的病因和機理。在生物和醫(yī)學領域，該技術已經得到廣泛應用。（二）、常用方法1、寡核苷酸引物突變寡核苷酸引物突變法用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物合成DNA子鏈的一部分。 引物中除了所需的突變堿基之外，其余部分則應與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補。 這種突變的步驟如下： 將待突變基因克隆到突變載體上； 制備含待突變基因的單鏈模板； 突變寡核苷酸引物與待突變的核苷酸形成一小段堿基錯配的異源雙鏈的DNA； 合成突變鏈：在DNA聚合酶的

40、催化下，引物以單鏈DNA為模板合成全長的互補鏈，而后由連接酶封閉缺口，產生閉環(huán)的異源雙鏈的DNA分子； 轉化和初步篩選異源雙鏈DNA分子轉化大腸桿菌后，產生野生型、突變型的同源雙鏈DNA分子該法是應用范圍最廣的突變方法，其保真度比后面提到的PCR突變法高，其缺點是攜作過程環(huán)節(jié)復雜。2、PCR突變PCR介導的定點突變是應用PCR技術，置換DNA鏈上特定部位的氨基酸，插入特定幾個或消除特定幾個氨基酸。主要有經典的重組PCR定點突變法和大引物突變法。重組PCR定點突變法可在DNA區(qū)段的任何部位產生定點突變，這種方法，需要四種擴增引物，總共進行三輪PCR反應。3、盒式突變概念：盒式突變是利用一段人工合

41、成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應序列。這種突變的寡核苷酸是由兩條寡核苷酸組成的，當它們退火時，產生克隆所需要的黏性末端，由于不存在異源雙鏈的中間體，因此重組質粒全部是突變體。 優(yōu)點：盒式突變法與前兩者相比，更加簡單易行、突變效率高，可以在一對限制酶切位點內進行一次突變而獲得多個位點。 缺點：唯一不足的是靶DNA區(qū)段的兩側需存在一對限制酶單切位點。三、酶分子定向進化酶分子定向進化的關鍵是通過隨機以誘變和體外重組產生分子多樣性。其基本方法分三步進行： 1、通過隨機誘變和體外重組創(chuàng)造基因多樣性； 2、將突變或重組基因導入適當載體后構建突變文庫； 3、通過靈敏的篩選方法，選擇樣性突變子。第十章 有機介質中的酶反應一 有機相酶反應的優(yōu)點：1 有利于疏水性底物的反應。 2 可提高酶的熱穩(wěn)定性. 3 能催化在水中不能進行的反應 4 可改變反應平衡移動方向 5 可控制底物專一性6 可防止由水引起的副反應。 7 可擴大反應pH值的適應性。