威尼德紫外交聯(lián)儀：EMSA實(shí)驗(yàn)中常見問題總結(jié)

1、威尼德紫外交聯(lián)儀：EMSA實(shí)驗(yàn)中常見問題總結(jié)威尼德生物科技（北京），使用UVA（365nm）、UVB（302 nm） UVC（254 nm） 三種波長(zhǎng)制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B 系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián) 儀（三種波長(zhǎng)）滿足不同的科研需求。1、為什么看不到遷移帶？1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量缺乏。2）樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。3）探針與蛋白無特異性的相互作用。4）轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。5）曝光或者成像時(shí)間過短。在Su

2、per-Shift EMSA測(cè)定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因：6）抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA,只有對(duì)非變性蛋白的表 面抗原決定簇起反響的抗體才能夠用于Super-Shift EMSAo7）測(cè)定的活化的DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測(cè)的構(gòu)成成分存在。此時(shí)既看不到 Super-Shift的帶，也看不到DNA/蛋白復(fù)合物的量的減少8）使用的抗體過度稀釋。一般10-20U1的反響液需要使用0.5-lul原倍的抗體。9）多抗與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下，雖然看不到Super-Shift 的帶，

3、但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。威尼德生物科技（北京），使用UVA（365nm）、UVB（302nm）、UVC（254 nm） 三種波長(zhǎng)制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B 系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián) 儀（三種波長(zhǎng)）滿足不同的科研需求。2、為什么實(shí)驗(yàn)背景高？1）曝光或者成像時(shí)間過長(zhǎng)。2）封閉時(shí)間缺乏或者效率不高。3）洗滌效果不佳。4）實(shí)驗(yàn)過程中膜沒有一直處于濕潤(rùn)狀態(tài)。3、EMSA測(cè)定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針?I,使用 UVA(365nm)、U

4、VB(302 nm) UVC(254 nm) 5括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀(365nm)、VL-1OOOB 系列紫外交聯(lián)儀(254nm)、VL-3000系列紫外交聯(lián)所用的純化蛋白，局部純化蛋白，粗制核抽提液需U)OOng間，可將蛋白:DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特異的復(fù)合物。 局部純化蛋白與粗制核抽提液應(yīng)保存在-80、探針應(yīng)保存在-20以防止降解。無論探針或是結(jié)合蛋白都應(yīng)防止屢次凍融。4、Poly(dI:dC),非特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA,特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA在EMSA測(cè)定中的作用？ Poly(dI:dC)由肌昔和胞喀咤組成。在EMSA反

5、響中加入poly(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與標(biāo)記探針的非特異結(jié)合。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn) 行優(yōu)化，一般用量大約在0.05mg/ml左右。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反響時(shí)，不必一定加 入poly(dI:dC),如加入，那么普通反響中所用終濃度不超過5O-lOOng。對(duì)核抽提液，每2-3ug 核抽提液用1 ug poly(dI:dC)o為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含增量的特異競(jìng)爭(zhēng)DNA或非特異的競(jìng)爭(zhēng) DNA時(shí)，作結(jié)合反響的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。一般，特異競(jìng)爭(zhēng)探針是非標(biāo)記的DNA,其序列與標(biāo)記探 針相同，故能與標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)與結(jié)合蛋白的反響。非特異

6、競(jìng)爭(zhēng)探針的長(zhǎng)度組成和DNA探針 相同，但序列不同。如果結(jié)合蛋白與標(biāo)記探針的結(jié)合被特異競(jìng)爭(zhēng)探針抑制，而不受非特異探 針的影響說明靶結(jié)合蛋白的存在。特異與非特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競(jìng) 爭(zhēng)DNA通常是標(biāo)記的探針用量的30-100倍(w/w)o5、用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針別離開？將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性 聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳別離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%,在特定條件下可用高或低的 濃度。也可將TGE緩沖液(12.5mM Tris, pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mM EDTA)用于不 穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合物。在4進(jìn)行結(jié)合和電泳實(shí)驗(yàn)以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。當(dāng)帶型不緊密出現(xiàn)拖尾時(shí)，說明復(fù)合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以防止帶型拖 尾。如復(fù)合物不進(jìn)入凝膠那么說明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反響。 在含抽提液的帶中不含游離探針或復(fù)合物，但只含探針的帶中有探針說明抽提物有核酸或磷 酸酶污染，應(yīng)在抽提液中和結(jié)合反響中加入相應(yīng)的抑制劑。威尼德生物科技(北京)有限公 司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長(zhǎng)制造了四款紫外交