培養(yǎng)基制備和高壓滅菌

1、關(guān)于培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌第一張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月微生物基礎(chǔ)實驗注意事項1、提高安全意識，正確操作儀器；2、培養(yǎng)無菌操作的觀念；3、自覺清洗器皿；4、注重保持環(huán)境衛(wèi)生和實驗室秩序； 第二張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月培養(yǎng)基的制備與滅菌 一、目的： 1、學(xué)習(xí)一般培養(yǎng)基的制備方法； 2、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾種常用的滅菌方法。 第三張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、原理 1、培養(yǎng)基(culture medium)：培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工的方法配制而成的一種基質(zhì)。 培養(yǎng)基的種類：根據(jù)培養(yǎng)基的成分可分為天然培養(yǎng)基、合

2、成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基；按物理性狀不同，可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。第四張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 天然培養(yǎng)基：主要成分是天然有機物質(zhì)，如馬鈴薯、玉米粉、豆餅粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，其成分未完全了解，且各批次不均一。適用于生產(chǎn)上大規(guī)模培養(yǎng)微生物。 合成培養(yǎng)基：成分明確的化學(xué)藥品配制而成的培養(yǎng)基。如：高氏一號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等。一般適用于在實驗室范圍內(nèi)研究微生物的形態(tài)、營養(yǎng)代謝、分類鑒定、生物測定、菌種選育和遺傳分析等工作。 半合成培養(yǎng)基：在天然有機物的基礎(chǔ)上，適當補充一些成分

3、已知的化學(xué)藥品所配制的培養(yǎng)基。具有廣泛的應(yīng)用，如馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，適合很多霉菌的生長。第五張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 液體培養(yǎng)基：配好后成為液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。如糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基等。廣泛用于理論研究和大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵。 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑形成的固態(tài)培養(yǎng)基。常用凝固劑有瓊脂、明膠、硅膠。硅膠用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基；對于其他多數(shù)微生物來講，瓊脂最為合適，一般加入1.5-2.5%，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。此培養(yǎng)基可供微生物的分離、鑒定、菌種保藏等。 半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即配成為半固體培養(yǎng)基，如，加入0.2-0.7%瓊脂作

4、為凝固劑。用來觀察細菌運動特征、鑒定菌種、菌種保藏和噬菌體的效價滴定等。第六張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途分類： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般細菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)，常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，也是作為某些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。 加富培養(yǎng)基：是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血、血清、動物組織提取液或植物組織提取液，主要用于培養(yǎng)某些對營養(yǎng)要求較為苛刻的微生物。 第七張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學(xué)條件的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。 根據(jù)某些微生物對碳、氮源的特殊要求來設(shè)計選擇性培養(yǎng)基，可以分離

5、到能分解某些物質(zhì)的微生物。 在培養(yǎng)基中加入某些化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長繁殖。如在分離放線菌時，在培養(yǎng)基中添加10%的酚數(shù)滴可抑制細菌和霉菌的生長。 鑒別培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某種化合物或化學(xué)試劑，使培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物與該化合物或化學(xué)試劑發(fā)生明顯的特征性反應(yīng)，根據(jù)這一特征性反應(yīng)可以將此種微生物與其他種微生物區(qū)別開來，如伊紅美藍培養(yǎng)基 。第八張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、滅菌： 消毒與滅菌是兩個不同的概念。 消毒：一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體而言，而不能殺死全部芽孢，因此，消毒對微生物的殺滅是不徹底的，而且往往只能作用到物體表面，只能作為一般的

6、衛(wèi)生措施。如使用酒精、84消毒液浸泡或煮沸法對器械的表面消毒處理，用紫外燈對房間進行照射等。 滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子，因此，滅菌后的物品不再帶有活體微生物。滅菌的方法很多，如加熱(干熱或濕熱)、過濾等。第九張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 干熱法滅菌： a) 火焰燒灼：適用于接種環(huán)、接種針、鑷子等金屬用具，無菌操作時的試管口和瓶口也在火焰上短暫燒灼滅菌。 b) 熱空氣滅菌：使用電熱干燥箱，借助熱空氣在160-1700C下保溫2小時進行滅菌，此法適用于玻璃器皿（如吸管和培養(yǎng)皿）等的滅菌，對帶膠皮的器物或培養(yǎng)基不適用。 第十張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 濕

7、熱滅菌： a) 高壓蒸汽滅菌 高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分鐘進行滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基等的滅菌。 b) 間歇滅菌法 少數(shù)培養(yǎng)基，例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等，高溫高壓滅菌易被破壞，適用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行滅菌，將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內(nèi)，每天加熱1000C，30分鐘，連續(xù)3天，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物去出放室溫下18-24小時，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱1000C，30分鐘，發(fā)育的營養(yǎng)體又被殺死，但可能仍有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。第十一張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于

8、2022年6月 三、材料： 1、藥品：NaCl 蛋白胨 牛肉膏 可溶性淀粉 K2HPO4 HCl NaOH 瓊脂 葡萄糖 蔗糖 Na2SO4 黃豆芽 馬鈴薯 伊紅 美藍等。 2、器材：臺秤 三角瓶 試管 漏斗 電爐 搪瓷杯（鋁鍋） 試管架 玻棒 滴管 稱量紙 pH試紙 棉花 紗布 牛皮紙 棉線 滅菌鍋 干燥箱等。 第十二張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、方法及步驟： 1、培養(yǎng)基的配制一般可分為稱量、溶化、pH調(diào)節(jié)、過濾和分裝等步驟 稱量：按照培養(yǎng)基配方，稱取各種成分； 溶化：在容器中先加入所需蒸餾水水量的一部分，依次將各成分加入，使全部溶解，最后補足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物質(zhì)

9、配制培養(yǎng)基時，需加熱溶解，并補足水分。配制固體培養(yǎng)基時，先將上述配好的液體培養(yǎng)基加熱到快沸時，再將稱好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱到瓊脂完全熔化，在加熱過程中要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢。 第十三張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 矯正pH值：初配制好的培養(yǎng)基，往往不能符合所需求的pH值，故必須矯正，用精密pH試紙，以1N HCl或1N NaOH調(diào)節(jié)至所需要的pH值。 過濾：用濾紙、棉花或雙層紗布過濾。 分裝：將制成的培養(yǎng)基分裝于三角瓶或試管內(nèi)。第十四張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 成分：馬鈴薯 200g 蔗糖 20g 瓊脂 25g

10、 水 補足1000ml 方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，放入搪瓷杯中，摻適量水加熱煮沸30分鐘（注意不時用玻棒攪拌，避免糊底），用雙層紗布濾去薯塊，在薯汁中加入瓊脂，加熱熔化，再加入葡萄糖，完全溶化后，用水補足體積，趁熱分裝到三角瓶中，121滅菌20 min。 注：無須調(diào)pH值，保持自然的酸性。第十五張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB) 成分1：蛋白胨 10 g NaCl 5 g 乳糖 4 g 瓊脂 25 g 蒸餾水 1000 ml pH 7.6 成分2： 2%伊紅水溶液2 ml，0.5%美藍水溶液 1 ml 方法：先配成分1，調(diào)好pH值后才可加入成分2，混勻，趁

11、熱分裝到三角瓶中，115滅菌 20 min。第十六張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3倍濃縮乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基 成分1：蛋白胨 30 g 牛肉膏 9 g 乳糖 15 g NaCl 15 g 蒸餾水 補足1000 ml pH 7.2 成分2： 1.6%溴鉀酚紫乙醇溶液3 ml 方法：先配成分1，調(diào)好pH值后才可加入成分2，混勻，分裝到三角瓶及大試管中，并加入倒置的事先充滿該培養(yǎng)液的杜氏管（勿留氣泡），封口后115滅菌 20 min。第十七張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、滅菌： 干熱滅菌步驟： 將要滅菌的器皿（培養(yǎng)皿、吸管等）包扎好，放入恒溫干燥箱內(nèi)。 接通電源，打開開關(guān)

12、；旋動恒溫調(diào)節(jié)器至1400C，當達到此溫度時，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持恒溫兩小時。 兩小時后，關(guān)掉電源，當溫度降至600C以下后，才可打開箱門，取出滅菌物品。第十八張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）高壓蒸汽滅菌 原理：在密閉容器中加熱形成的蒸汽不斷堆積，使蒸汽壓力升高，溫度也相應(yīng)升高，超過水的沸點。利用過熱的蒸汽來使細菌及其耐熱芽孢蛋白質(zhì)凝固變性，以致失去生命力，從而達到徹底滅菌的效果。高壓蒸汽滅菌是最有效的滅菌方法。 一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分鐘進行滅菌，就可殺死一切微生物細胞及其芽孢或孢子。滅菌對象是培養(yǎng)基、玻璃器皿和各種

13、不因高溫處理而變質(zhì)的物品材料。但對不耐高溫、高壓的溶液或培養(yǎng)基不宜用此種方法。 第十九張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月手提式蒸汽滅菌鍋立式蒸汽滅菌鍋（電加熱、自動或半自動）臥式蒸汽滅菌鍋第二十張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月高壓蒸汽滅菌鍋的使用： 鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三腳擱架相平為宜。 把要滅菌的材料裝入鍋內(nèi)，注意不要放得太擠，防礙蒸汽流通，影響滅菌效果。 蓋好滅菌鍋鍋蓋，按對角線形式均勻擰緊鍋蓋上的螺栓，螺栓松緊一致，以免漏氣。 打開電源，開啟排汽閥，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。 待冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排汽開關(guān)。讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內(nèi)壓力升到所需壓力

14、時?？刂茻嵩?，維持壓力至所需時間。本實驗根據(jù)培養(yǎng)基不同，分別采用：1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持20分鐘； 0.7kg/cm2（10磅/英寸2），115.60C保持20分鐘。 第二十一張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 滅菌所需時間到后，關(guān)閉熱源。 讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當壓力降至“0”時，打開排汽閥。 打開滅菌鍋蓋，取出已滅菌的物品及培養(yǎng)基。 第二十二張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月五、培養(yǎng)基的配制及器材準備： 1：配牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基2000 ml，分裝于16個250 ml三角瓶；2：配牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基500 ml，分裝于100支試

15、管；3：高氏1號固體培養(yǎng)基1000 ml，分裝于8個250 ml三角瓶；4：淀粉固體培養(yǎng)基1000 ml，分裝于8個250 ml三角瓶；5：馬鈴薯固體培養(yǎng)基2000 ml，分裝于16個250 ml三角瓶；6：豆芽汁培養(yǎng)基1000 ml,分裝于8個250 ml三角瓶+20支試管；7：無氮培養(yǎng)基500 ml,分裝于4個250 ml三角瓶8：伊紅美藍固體培養(yǎng)基1000 ml，分裝于8個250 ml 三角瓶； 第二十三張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月五、培養(yǎng)基的配制及器材準備： 9：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基700 ml,分裝于90支試管（7 ml）；10：蛋白胨水培養(yǎng)基400 ml，分裝于50支試管（7 ml）； 11：3倍乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基100 ml，20只大試管（5 ml），均加入倒置小管；12：乳糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基700 ml，分裝于90支試管（7 ml