液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的基本原理和應(yīng)用

1、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的基本原理和應(yīng)用樣品的預(yù)處理常用方法a）超濾b）溶劑萃取去鹽c）固相萃取d）灌注（Perfusion）凈化去鹽e）色譜分離 反相色譜分離 親和技術(shù)分離f）甲醇或乙腈沉淀蛋白g）酸水解，酶解h）衍生化化合物鑒別全掃描方式（Q1掃描） 全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認(rèn)一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。 子離子分析（ MS/MS ） 子離子，用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級(jí)譜圖即碎片離子)和選擇離子對(duì)作多種反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。 子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內(nèi)CID）可能十分相似，所不同的是子離子質(zhì)譜圖已

2、知只有一種質(zhì)量通過(guò)MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息正離子方式常出現(xiàn)如下離子:-Na 22 Da. higher than M+H-K 38 Da. higher than M+H-Li 6 Da. higher than M+H-NH4 17 Da. higher than M+H-ACN 40 Da. higher than M+H2M+H,2M+Na等負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子:-TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background

3、)-Acetate 60 Da. higher then M-H-Formic 46 Da. higher then M-H-Cl 36 Da. higher than M-H 影響分子量測(cè)定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些，除對(duì)離子化有影響外，還影響LC的峰形。2）氣流和溫度：當(dāng)水含量高及流量大時(shí)要相應(yīng)增加。3）溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。4）溶劑和緩沖液的類(lèi)型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些5）選擇合適的液相色譜類(lèi)型：正相、反相、選擇合適的色譜柱6）合適的電壓：DP電壓高時(shí)，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時(shí)回使多電荷離子比例低，多

4、聚體也減少7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)使被測(cè)物離子化不好，同時(shí)使LC分離不好9）樣品濃度不夠，有時(shí)需要濃縮分子量測(cè)定中的誤判溶劑中的雜質(zhì)來(lái)自于塑料添加劑的峰樣品容器不干凈，常見(jiàn)表面活性劑的峰進(jìn)樣系統(tǒng)污染樣品在源內(nèi)碎裂，形成碎片離子LC-MS中常見(jiàn)的本底離子m/z 50-150, 溶劑離子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+m/z149, 管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+m/z 288, 2mm 離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z 279, 管路中鄰苯二甲酸二丁酯 C1

5、6H22O4H+m/z 316, 2mm 離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z 384, 瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子m/z391, 管路中鄰苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+m/z413, 鄰苯二甲酸二辛酯+鈉, C24H38O4Na+m/z 538, 乙酸+氧 +鐵（噴霧管）, Fe3O(O2CCH3)6 分子量測(cè)定失敗的原因a）流動(dòng)相不合適b）不揮發(fā)性鹽的影響c）成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多d) 樣品濃度不夠e）pH值不合適f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂目標(biāo)化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM） SIM用于檢測(cè)已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往

6、需要已知化合物的性質(zhì)。 若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測(cè)，那么可以同時(shí)測(cè)定幾種離子.目標(biāo)化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM） SIM用于檢測(cè)已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。 若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測(cè)，那么可以同時(shí)測(cè)定幾種離子.（3）母離子掃描母離子分析可用來(lái)鑒定和確認(rèn)類(lèi)型已知的化合物，盡管它們的母離子的質(zhì)量可以不同，但在分裂過(guò)程中會(huì)生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。 (4)中性丟失掃描 中性丟失掃描分析可用來(lái)鑒定和確認(rèn)類(lèi)型已知的化合物，例如新生兒遺傳疾病

7、篩查中某些檢測(cè)項(xiàng)目。也可以幫助進(jìn)行未知物結(jié)構(gòu)判斷，例如有中性丟失18Da的意味著-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。各種掃描方式的原理解釋?zhuān)篞1 Full Scan (Start Stop)(Q1全掃描)Q1 always used as single MS analyzerUsed primarily for ident. of precursor ionSIM - Selected Ion Monitoring(選擇離子監(jiān)測(cè))Used to optimize analyzer for specific ionsSIM used for quantita

8、tive analysesQ1 SIM used to “optimize” precursor ionMaximize signal in preparation for MS/MSProduct Ion Scan(子離子掃描)After identification, the precursor ion is sent into the collision cell and fragmented by CIDQ1 is fixed, Q3 sweeps a given mass rangeUsed for structural elucidationFirst step to develo

9、ping quantitative methodm3+ scannedm1+ fixedExample of Product Ion SpectrumEphedrine, MW = 165Precursor Ion Scan(母離子掃描)Q1 sweeps a given mass range, Q3 is fixedUsed to determine the “origin” of particular product ion(s) created in the collision cellFrequently used for drug metabolite identification

10、(common product ion observed in the metabolites)m3+ fixedm1+ scannedExample of Precursor Ion Spectrum600900120015001800m/z, amu587.5745.6895.6802.4633.4520.31105.01704.4600900120015001800m/z, amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity, cps608.3520.3802.4600900120015001800m/z, amu3.0e46.0e49.0e4Intensity, cpsP

11、recursors of 86 (Ile/Leu)Q1 Scan745.6FragmentationWhen an Ion fragments the following formulas apply:Positive mode (Parent)+ A+ + B NeutralNegative mode (Parent)- A- + B NeutralNeutral Loss Scan(中性丟失掃描)Q1 & Q3 both scan a given mass range but with a constant difference between ranges scannedSpectrum

12、 indicates which ions lose a neutral species equal to Q1 - Q3 differenceComplement to Precursor Ion ScanNeutral “gain” indicates a multiply charged precursor ion was fragmentedmm1+ scannedm3+ scannedMultiple Reaction Monitoring (MRM)Precursor ion fixedProduct ion fixedFragmentation(CAD)Many precurso

13、r to product ion pairs can be monitored (A-B, A-B, etc.)MRM is the best way to maximize signal intensity of product ionsMRM used primarily for quantitationWhy LC/MS/MS for Quantitation ?Retention Time Retention TimeIntensityIntensityPrecursor ion fixedProduct ion fixedFragmentation(CAD)Increased Sen

14、sitivity & Specificity儀器介紹:4000QTRAPTM四極桿-四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司最新推出的、具有革新性設(shè)計(jì)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀。它把四極桿-線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)首次結(jié)合在一起，既保留了串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀的優(yōu)點(diǎn)如母離子掃描（PS）、中性丟失掃描（NL）、MRM定量功能，又克服了傳統(tǒng)3D離子阱質(zhì)譜儀的缺點(diǎn)如低質(zhì)量截止點(diǎn)（1/3效應(yīng)）、“空間電荷效應(yīng)”、碰撞效率低、定量性能差等。它是一臺(tái)集優(yōu)異定性功能與定量功能于一體的質(zhì)譜儀，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)（組）研究、藥物開(kāi)發(fā)、藥物代謝、有機(jī)化學(xué)、環(huán)境分析、毒物分析、食品檢驗(yàn)、商品檢測(cè)、衛(wèi)生防疫、煙草品質(zhì)改良等眾

15、多領(lǐng)域。 q0Q1q2Q3線性離子阱：超大的離子容量：消除了傳統(tǒng)離子阱的“空間電荷效應(yīng)”低質(zhì)量截止(1/3 效應(yīng))低碰撞效率（離子缺失）多電荷增強(qiáng)掃描功能：有效消除單電荷離子的干擾，只檢測(cè)多電荷離子，更適合檢測(cè)微量的肽或蛋白質(zhì)MS3功能：MS3功能和串聯(lián)四極桿碰撞方式，只需進(jìn)行最少的實(shí)驗(yàn)卻提供最充分的結(jié)構(gòu)信息動(dòng)態(tài)線性范圍寬保留3Q質(zhì)譜儀的優(yōu)異MRM定量性能，能夠檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中的微量雜質(zhì)QTRAP實(shí)現(xiàn)MSn功能以利血平為例:第一步做母離子609的MS2譜，由于碰撞能量較高，既有一次碰撞碎片又有多次碰撞碎片，且無(wú)1/3質(zhì)量CUT OFF現(xiàn)象，故從低質(zhì)量端到高質(zhì)量端產(chǎn)生碎片很多。每個(gè)碎片均可做MS/

16、MS/MS，從中確證下一級(jí)的碎片歸屬，進(jìn)而推斷分子結(jié)構(gòu)。例如M/Z236和M/Z195是由M/Z448產(chǎn)生， M/Z365和M/Z174是由M/Z397產(chǎn)生。M/Z365,M/Z236和M/Z195還可繼續(xù)打碎。RESERPINE-MS/MSRESERPINE-MS/MS/MS（448）RESERPINE-MS/MS/MS（397）RESERPINE-MS/MS/MS（365）RESERPINE-MS/MS/MS（195）LC-MS技術(shù)的應(yīng)用以大氣壓電離為接口的LC-MS技術(shù)已經(jīng)在藥物、化工、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用具體應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然

17、產(chǎn)物分析生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機(jī)污染物、土壤/食品/水分析臨床醫(yī)學(xué)：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿病）、血紅蛋白變異、膽酸食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測(cè)獸醫(yī)學(xué)：興奮劑、磺胺類(lèi)藥物、抗體合成化學(xué)：有機(jī)金屬化合物、有機(jī)合成物有機(jī)化學(xué)：表面活性劑、染料藥物代謝研究 藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)上的最新重大進(jìn)展是LC-MS-MS的使用，電噴霧（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）以及大氣壓光電離（APPI）是其主要的離子源，由于具有高靈敏度（ng/mlpg/ml），高選擇性（檢測(cè)特定的碎片離子）、高效率（每天可

18、檢測(cè)幾百個(gè)生物樣品和對(duì)藥物結(jié)構(gòu)的廣泛適用性，對(duì)液態(tài)樣品和混合樣品的分離能力高，可通過(guò)二級(jí)離子碎片尋找原型藥物并推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)，LC-ESI-MS-MS已廣泛地應(yīng)用于藥物代謝研究中一期生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和二期結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定、復(fù)雜生物樣品的自動(dòng)化分析以及代謝物結(jié)構(gòu)闡述等，已在世界上大型制藥企業(yè)中取代HPLC而占據(jù)了主導(dǎo)地位，其測(cè)試的樣品量占總量的70%以上。天然產(chǎn)物天然藥物的研究目前中藥開(kāi)發(fā)研究有兩條途徑。一條途徑是從單一植物中提取一種有效成分(單體化合物)或提取物開(kāi)發(fā)成新藥。另一途徑則是中藥復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)研究。 采用現(xiàn)代多種儀器聯(lián)用新技術(shù)，特別是高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)，可

19、對(duì)其十幾種乃至幾十種化學(xué)成分進(jìn)行指紋圖譜分離鑒定。再?gòu)闹讣y圖譜中選擇四、五種指標(biāo)成分(有效成分或特征成分)進(jìn)行定量，可以確定出簡(jiǎn)化的指紋圖譜和指標(biāo)成分，又是最合理的中藥復(fù)方質(zhì)量控制的方法，是研究中藥復(fù)雜體系，尤其是復(fù)方的有力工具。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者已進(jìn)行了復(fù)方丹參、清開(kāi)靈、瀉心湯、人參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。 臨床診斷和疾病生物標(biāo)志物的分析 歐美等目前已廣泛采用HPLC/MS/MS法用于臨床診斷以及疾病生物標(biāo)志物的研究、檢測(cè)，具有專(zhuān)一性好、靈敏度高、成本低、分析快速，經(jīng)濟(jì)效益可觀等特點(diǎn)。目前可進(jìn)行新生兒遺傳疾病篩選（PKU、MCAD等四十種左右）、新生兒性激素變異的檢測(cè)、男女激素的監(jiān)測(cè)

20、、老年癡呆癥的早期診斷、抗排異藥物的檢測(cè)、磷酸脂的檢測(cè)、血紅蛋白變異檢測(cè)、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測(cè)）、某些心臟病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（Biomarker法、通過(guò)鑒定DNA損傷程度測(cè)定）、藥物劑量監(jiān)測(cè)、藥物相互作用監(jiān)測(cè)、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測(cè)等。 殘留、法醫(yī)學(xué)和環(huán)境樣品測(cè)定專(zhuān)家指出，中國(guó)入世后，食品工業(yè)最大的問(wèn)題就是安全壁壘，這將給中國(guó)的進(jìn)出口和國(guó)內(nèi)企業(yè)帶來(lái)極大的威脅。美國(guó)食品與藥品管理局 (FDA)、歐盟、日本、韓國(guó)等主要貿(mào)易國(guó)和地區(qū)公布了在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中禁止使用的藥物名單，提高了最高限量標(biāo)準(zhǔn)。這就要求中國(guó)加強(qiáng)農(nóng)、畜、水產(chǎn)品中的農(nóng)藥、獸藥等殘留的控制和檢測(cè)。同樣隨著人類(lèi)對(duì)

21、生存環(huán)境的倍加關(guān)注，要求對(duì)環(huán)境中各種污染物、有害或有毒物以及法庭科學(xué)中毒物、濫用藥物等進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)控。而配以ESI、APCI和APPI離子化技術(shù)的LC/MS/MS以分析速度快、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用與殘留和毒物分析。目前已成功地進(jìn)行數(shù)百種農(nóng)藥、獸藥、抗生素、興奮劑類(lèi)殘留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺類(lèi)、硝基呋喃類(lèi)、毒品、多環(huán)芳烴等等化合物的檢測(cè)。下面講解應(yīng)用示例高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定清開(kāi)靈復(fù)方中膽酸 采用HPLC/MS/MS技術(shù)，從清開(kāi)靈注射液中，通過(guò)分子量、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息定性測(cè)定了清開(kāi)靈復(fù)方中的膽酸。 直接進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)。清開(kāi)靈注射液經(jīng)過(guò)初步化學(xué)處理后采用電噴霧（ESI）離子

22、源，在負(fù)離子掃描方式下，得到一極質(zhì)譜圖、即分子離子峰M-H-，再用二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）掃描目標(biāo)分子離子的碎片峰。再以相同的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，做出其一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖。 通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行分子離子峰的掃描發(fā)現(xiàn)M-H-的峰中有一個(gè)很強(qiáng)的407，根據(jù)樣品處理過(guò)程以及對(duì)復(fù)方各單味藥材的研究，其應(yīng)該為一有機(jī)酸的負(fù)離子峰，并初步推斷其為膽酸。（膽酸的分子量為408）。如圖所示：通過(guò)對(duì)照樣品(右)和標(biāo)準(zhǔn)品（左）的二級(jí)質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)其主要碎片峰均吻合較好。 如何用API LC-MS/MS檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)代謝物第一步：配制衍生化后的硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，乙腈/水體系，濃度10PPM確認(rèn)儀器已經(jīng)校準(zhǔn)，氣體、電壓工作正常。測(cè)試條件：離子化方式: ESI+進(jìn)樣5ul/min， Q1 SCAN 觀察M/Z 335，236，249，209及同位素內(nèi)標(biāo)峰，通過(guò)調(diào)節(jié)DP，使這幾個(gè)峰最強(qiáng)。注意：1如買(mǎi)來(lái)的是已經(jīng)衍生化的標(biāo)準(zhǔn)品，則可四種混配。 2如是用戶(hù)由硝基呋喃代