試驗(yàn)報(bào)告十單光子分析儀與植物細(xì)胞活性氧檢測(cè)

1、課程名稱：生物儀器分析指導(dǎo)老師： 成績(jī)： 實(shí)驗(yàn)名稱：?jiǎn)喂庾臃治鰞x與植物細(xì)胞活性氧檢測(cè)實(shí)驗(yàn)類型：探究一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、主要儀器設(shè)備（必填）四、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析七、討論、心得 裝 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、了解并掌握單光子分析儀的原理。訂2、掌握用單光子分析儀測(cè)定植物活性氧的方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理線 內(nèi)容：1、用單光子分析儀測(cè)定植物活性氧。,2、同時(shí)制作對(duì)照組。B:原理：:1 、植物產(chǎn)生活性氧原理植物與病原物互作后的信號(hào)傳遞激活了包括活性氧（AOS ： active oxide species）的生成和其它各B類

2、防衛(wèi)反應(yīng)?；钚匝踹M(jìn)發(fā) （oxidative burst）被認(rèn)為是過(guò)敏反應(yīng)（HR： hypersensitive response）的特征：性反應(yīng)，也是植物對(duì)病原物應(yīng)答的最早期反應(yīng)之一。： AOS主要由病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)生，其中非親和病菌誘導(dǎo)AOSS發(fā)強(qiáng)烈且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。植物在處于一些逆 境（stress）條件下，（例如：低溫、紫外光），也能產(chǎn)生AOS：植物體內(nèi)主要的 AOS是：超氧陰離子（？O2-）、過(guò)氧化氫（H2Q）、羥自由基（？OH-）。它們之間可以相1互轉(zhuǎn)變。其中？ OH極為活潑，能與有機(jī)化合物作用產(chǎn)生自由基鏈反應(yīng)，氧化細(xì)胞質(zhì)膜成分，使酶失活、:核酸降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞損壞，組織壞死，產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)

3、。植物具有完整的體系來(lái)調(diào)節(jié)活性氧的生成和積累，確保有效信號(hào)傳導(dǎo)，這樣既可使植物能抑制病菌:的感染和再度侵入，又能使自身少受氧化脅迫。2、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)活性氧：H202可以氧化化學(xué)發(fā)光試劑如發(fā)光氨（魯米諾）并釋放出光子（photon），根據(jù)發(fā)光強(qiáng)弱得以定量測(cè)， 定。該方法是測(cè)定光子數(shù)而非反應(yīng)的化學(xué)產(chǎn)物，在植物活性氧檢測(cè)中應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。-3、單光子分析儀原理:單光子分析儀組成：圖像增強(qiáng)器、錐形光導(dǎo)纖維束、讀出相機(jī)：圖像增強(qiáng)器組成：輸入窗口、光電陰極、MCP熒光屏：工作原理：光電陰極將輸入的光子轉(zhuǎn)換為光電子，通過(guò)MCP各光電子增強(qiáng)，熒光屏將增強(qiáng)的光電子:重新轉(zhuǎn)換為光子，做到將微弱的光增強(qiáng)的原理。單

4、光子分析儀通過(guò)每一小段時(shí)間拍攝一張照片，記錄檢:測(cè)過(guò)程中光線的變化，電腦顯示器上的光照強(qiáng)度是多張照片疊加的結(jié)果。InputPholixis三、主要儀器設(shè)備單光子分析儀四、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟(1)植物葉的預(yù)處理，用打孔器去一片植物葉，加入 50 口 水放置一夜。(2)開(kāi)機(jī)預(yù)熱、清洗儀器、設(shè)定參數(shù)(3)第一列加入506水和魯米諾混合液，作為空白對(duì)照。第二列加入506 25nM鞭毛蛋白、水和魯米諾混合液。三四列不加任何東西。(4)測(cè)定發(fā)光信號(hào)。(5)觀察測(cè)試結(jié)果。(6)使用電腦軟件進(jìn)行分析。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1、檢測(cè)的過(guò)程中光變化圖5光照隨時(shí)間的變化2、使用軟件進(jìn)行分析圖6選才i 3個(gè)點(diǎn)各自做一

5、條光照隨時(shí)間的變化圖7做前4個(gè)點(diǎn)光照隨時(shí)間變化的平均值湖CWrllhT-auR 口 ULI出oom因必LfDClXl抽缸圖8做全部8個(gè)點(diǎn)光照隨時(shí)間變化的平均值表 1 Col-H 2Otime/sec time/min 1號(hào) 2號(hào) 3號(hào) 4號(hào) 5號(hào) 6號(hào) 7號(hào) 8號(hào) 平均值00183021862486235325512958193514042212.875601369727528905933988536585696.37512024022774001021567939702686624.25180344938456280077613751017790769.1252404636366407104

6、912751328971979876.37530058496577191091127516399937961002.375360679858176013831466146912336501042.54207755896114213691416176413778911201.254808702648106613911293156411657991078.55409475107289515941540205014678631244.560010700710121213311329177914898941180.5660116019741141154314532099139412321304.625

7、7201277376269715841660168213488491169.3757801374593585010171201186315268301120.8758401454874686214421338196713707721130.625900155846837331006175415039009961019.875960165167916119667791644750552826.12510201735854771282510471465892811832.1251080184855703849317691100734673705.75114019386416472512598948

8、528729573.6251200201883385257647721122377583583.625126021104281293353824911374528458.5132022256378311198367856511608435.625138023176139314417336697163539347.625144024143393913362735732254223071500252861317825821129617537322615602611178109241238673200206232162027430196162229272496189230275.5168028821

9、748532219061361236220.3751740291151010126164400246190167.751800301101273515614432161254151表 2 Col-flg22time/sec time/min1號(hào)2號(hào)3號(hào)45號(hào)67號(hào)8號(hào)平均值00238930793716324327172853338932163075.25601531543709386459532696738574.251202199015991052113718421154220599714971803666584373093618258279942903930036523.524041586

10、317898563517287144092158716105721714500.1253005277082735311924304782534536520221331355824377.3753606371303739917779433963056543216258091891931776.6254207435394113422884505383945354285307852128437987.754808483154725225068541594515357346372162741342740.2554095180547927314055959447954582783783129270455

11、08600105249846298334185992248171593143576231126 45813.62566011522045036034587592204580258032366533244446162.757201251032495343676457818470085324936558326934558278013511114694832660498184055848792319883161541686.2584014488284364731478474213508445120277942732738337.375900154097237252266163706529491372

12、23219762834532367.596016361763003625335312042335030210183422284827187.625102017280472332120274255131955421481151511832021457.625108018210451942515086192601503417806113591626916910.51140191673013475135471424695651247873421052012237.875120020122161030310915956670908576573583259090.75126021746855326497

13、547756825751394861835817.25132022580137295602364640573758308936274163.625138023310533763752254824792672172723262748.12514402421292013275920751977142314321968197215002516351261126214201024100710381065121415602697612941396872962627649572918.5162027100958699749078456345378270816802859379957835946648052

14、5313514.125174029776419464297447326241398421180030447429678303334194172375366.5表3 Col-H20和Col-flg22 隨時(shí)間的變化time/minCol-H20Col-flg2202212.8753075.251696.375574.252624.2514973769.1256523.54876.37514500.12551002.37524377.37561042.531776.62571201.2537987.7581078.542740.2591244.545508101180.545813.6251113

15、04.62546162.75121169.37545582131120.87541686.25141130.62538337.375151019.87532367.516826.12527187.62517832.12521457.62518705.7516910.519573.62512237.87520583.6259090.7521458.55817.2522435.6254163.62523347.6252748.12524307197225226121426232918.527275.570828220.375514.12529167.7542130151366.550000kuIR

16、TSORCol-H20- Col-flg22treatment/min六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、光照最強(qiáng)大概在 11min左右。2、AOS& 11min左右時(shí)活性最強(qiáng)。3、說(shuō)明植物細(xì)胞對(duì)鞭毛蛋白有過(guò)敏反應(yīng)，會(huì)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，且在11分鐘左右產(chǎn)生的活性氧最多。4、可以看出不同的 3個(gè)點(diǎn)的光照隨時(shí)間的變化是不同的，取8個(gè)點(diǎn)做成的平均值明顯比4個(gè)點(diǎn)的平滑，同時(shí)采用不同的時(shí)間間隔作分析，做出的曲線平滑程度也不同，做8個(gè)點(diǎn)可以減小相對(duì)誤差。5、可以看到?jīng)]有加入東西的三四列也有發(fā)光反應(yīng)，是由于植物通過(guò)打孔器取下后，受傷的植物也 會(huì)產(chǎn)生AOS用第一列和第三或第四列對(duì)比，可以得出水和魯米諾對(duì)植物葉片發(fā)光的影響，用

17、第一列和 第二列對(duì)比，可以得出鞭毛蛋白對(duì)植物葉片發(fā)光的影響，即植物產(chǎn)生活性氧的影響。七、討論、心得1、單光子分析儀特點(diǎn)(1) 1280X 1024 CMOS0像傳感器，能夠獲得高清的圖像。(2)時(shí)間間隔為20ms,能夠很好的記錄光在一段時(shí)間內(nèi)細(xì)微的變化。(3)可編程，可以根據(jù)世界需要進(jìn)行編程。(4) USB3接口，具有較快的數(shù)據(jù)傳輸能力。(5) C-Mount接口，具有倍數(shù)。(6)無(wú)限時(shí)間(7)延時(shí)影像(8)有數(shù)據(jù)收集和分析系統(tǒng)。2、單光子分析儀應(yīng)用(1)生物發(fā)光影像(2)鈣信號(hào)(3)晝夜節(jié)律(4)閃爍計(jì)數(shù)，用閃爍法測(cè)量放射性強(qiáng)度(5)寬場(chǎng)熒光成像3、MC收口何增強(qiáng)電子？MC助一種單通道電子倍

18、增器，是一種靈敏，響應(yīng)快的檢測(cè)器系統(tǒng)，用于極微弱光強(qiáng)度的檢測(cè)。它 是由光束落在陰極上產(chǎn)生光電子通過(guò)級(jí)聯(lián)放大，在光學(xué)探測(cè)儀中，用于極微弱光強(qiáng)度的檢測(cè)， 一般可將光電子放大106倍。當(dāng)電子倍增器工作的時(shí)候， 先是一個(gè)帶電粒子或載能光子撞擊到倍增器的輸入表面，然后向真空激發(fā)出數(shù)個(gè)二次電子。摻雜了堿金屬的發(fā)射層有更小的表面逸出功，增加了激發(fā)出的二次電子的數(shù)量。在二次電子穿越通道管的過(guò)程中，它會(huì)多次碰撞到通道管的管壁上，這樣就能連續(xù)的產(chǎn)生大量的二次電子。在發(fā)射層的下方是電阻鉛玻璃層，它能在通道管內(nèi)部產(chǎn)生從輸入端到陽(yáng)極逐漸增高的電勢(shì)，在這個(gè)電勢(shì)差下電子被加速。上述過(guò)程不停的重復(fù)，直到產(chǎn)生的電子云全部離開(kāi)通道管，被陽(yáng)極接收。改變加在電子倍增器上的電壓會(huì)同時(shí)改變電子軌跡和每次碰撞產(chǎn)生的二次電子數(shù)目。這樣，倍增器的增益就是可調(diào)的。選擇合適的偏壓可使單一離子從撞到倍增器的輸入端開(kāi)始到陽(yáng)極接收，共產(chǎn)生一億個(gè)電