細菌學檢驗的基本技術

1、細菌學檢驗的基本技術第一節(jié) 樣本的采集與送檢 在公共衛(wèi)生及預防醫(yī)學領域所涉及的細菌學檢驗樣本種類繁多，包括來自食品、化妝品、涉水產(chǎn)品、消毒及衛(wèi)生用品、環(huán)境及物品（水、土壤、空氣，各種物品）、正常人體及臨床等的樣本。2一、臨床樣本的采集與送檢（一）血及骨髓樣本的采集1. 采樣時間：發(fā)熱期、用藥之前、 病情發(fā)展2. 采樣部位及頻率：多部位、高頻率3. 樣本采集的量：成人血量10ml，嬰兒1ml2ml，兒童3ml5ml；當懷疑為真菌感染時，應采集雙份量，分別作雙相培養(yǎng)(37/28)。骨髓1 ml2 ml。 4. 樣本的送檢：盡快，室溫5. 注意事項：同時需氧和厭氧培養(yǎng)3一、臨床樣本的采集與送檢（二）

2、尿液樣本的采集1. 采樣時間：晨尿、用藥前2. 采樣方法：10ml，中段尿、腎盂尿、導尿3. 注意事項：無菌操作，用藥前（三）糞便樣本的采集1. 采樣時間：急性期、新鮮糞便2. 采樣方法：自然排便、直腸拭子、Cary-Blair運送培養(yǎng)基或pH7.0的甘油PBS3. 注意事項：無菌操作、可能厭氧培養(yǎng)4一、臨床樣本的采集與送檢（四）痰及上呼吸道樣本的采集1. 采樣時間：晨痰、鼻咽拭子 2. 采樣方法：自然咳痰法、支氣管鏡采集法、胃內采痰法、氣管穿刺法等 ；咽拭子3. 注意事項：先漱口、結核分枝桿菌和真菌可4保存 5一、臨床樣本的采集與送檢（五）其它臨床樣本化膿和創(chuàng)傷樣本：棉拭子 腦脊液、膽汁、胸

3、水、腹水、心包液、關節(jié)液和鞘膜液等：穿刺生殖道：棉拭子 組織樣本：內鏡炎癥或組織壞死部位：手術 6二、食品衛(wèi)生細菌學檢驗樣本（一）樣品采集原則注意代表性，防止樣品受污染、變質和細菌生長 大樣(一整批 )、中樣(混合200g )和小樣(檢樣25g)（二）樣品采集方法無菌用具、包裝完好、混合、震搖、冷凍、冷藏 （三）采樣的數(shù)量根據(jù)食品種類的不同，采樣的數(shù)量也應不同（四）注意事項3h內送實驗室，無菌操作7三、化妝品細菌學檢驗樣本（一）采樣數(shù)量每批兩個大包裝抽取4個包裝，10g或10ml （二）樣本的處理1. 液體樣品：10倍稀釋，油性物用液體石蠟、土溫-80 2. 膏霜乳劑樣品：親水性-玻璃珠，疏水

4、性-先行乳化3. 固體樣品的處理：均質后取上清液 （三）樣品送檢原則及注意事項1. 維持樣品污染原狀（出廠污染狀態(tài)）2. 去除殘留防腐劑及抑菌劑（吐溫-80和卵磷脂 ）3. 注意事項（室溫存放，多項目時先做微生物）8四、生活飲用水細菌學檢驗樣本（一）水樣采集許多水體隨時間和空間會發(fā)生很大變化，要采集具有代表性的樣品，必須定出合理的采樣規(guī)劃。 （二）采樣點的選擇注意樣品的代表性，河水、湖水、地下水、自來水（三）采樣器具采樣瓶、自動采樣器、容器可加硫代硫酸鈉（四）樣品送檢及注意事項4h內檢驗、可冷藏9五、消毒及衛(wèi)生用品（一）醫(yī)療衛(wèi)生機構消毒及衛(wèi)生用品物表 ：5cm5cm滅菌規(guī)格板，100cm2 區(qū)

5、域空氣：高度150cm、距墻100cm；面積30m2，設一條對角線上內、中、外3點；面積 30m2，設4角及中央5點，暴皿5min；或用采樣器 手/皮膚粘膜：含中和劑棉拭子，5cm5cm規(guī)格板 醫(yī)療用品：破壞、棉拭子消毒劑：1ml加至9ml中和劑中 10五、消毒及衛(wèi)生用品（二）一次性使用的衛(wèi)生用品同一批號3個運輸包裝中至少隨機抽取12個最小包裝量；1/4用于檢測、1/4用于留樣、2/4就地封存準備復測。11六、空氣樣本平板沉降法和采樣器采集法 （一）空氣微生物采樣器分類按照采樣方式的不同可分為兩類(和類)，類是將微生物直接采到固體培養(yǎng)基上(如Andersen采樣器)，類是把微生物先采到液體或其

6、它介質上，再轉種到培養(yǎng)基或細胞上顯示(如Porton采樣器)。12六、空氣樣本按照流量的有效數(shù)字分，3位數(shù)以上為大流量(500 L/min)，23位數(shù)為中流量(499L/min11 L/min)，1位數(shù)為小流量(10L/min)。按照采樣器所用介質性質又可分為固體及液體采樣器。按采樣器的工作原理可分為六種：撞擊式、沉降式、過濾式、靜電吸附式、旋風式和離心撞擊式采樣器。13六、空氣樣本（二）空氣中細菌等微生物采樣的介質采樣介質(包括培養(yǎng)基)對細菌等微生物具有支撐、黏附、保護和生長作用。常用有凡士林、聚硅酮，氧化烯二十二烷酮(OED)和SGB(糖、甘油、牛血清白蛋白)（三）空氣中細菌等微生物采樣方

7、法及送檢1. 平板沉降法：參見醫(yī)院空氣采樣規(guī)定。 2. 空氣采樣器采樣：常用Andersen采樣器14第二節(jié) 細菌的形態(tài)結構檢查法了解標本中有無細菌及其大致的數(shù)量。驗證培養(yǎng)物是否為純種。形態(tài)檢查結果可做初步診斷。不染色檢查法和染色檢查法。借助顯微鏡對形態(tài)、大小、排列、結構的直接觀察。15一、顯微鏡檢查1、普通光學顯微鏡(light microscope)：分辨率0.2m，用于細菌染色標本的觀察。 2、暗視野顯微鏡(dark-field microscope)：具有暗視野聚光器，用于觀察不染色標本活菌的形態(tài)、運動方式。3、相差顯微鏡(phase contrast microscope)：具有環(huán)狀

8、光柵聚光器和相差物鏡，既可觀察活體細胞的外形和運動方式，又能觀察其內部細微結構及這些結構的數(shù)量。16二、不染色檢查細菌的活體觀察，主要用于觀察動力懸滴法凹玻片壓滴法平玻片17三、染色檢查常用堿性染料（美藍、孔雀綠、堿性復紅、結晶紫、沙黃等）單染色法，復染色法，特殊結構染色法（鞭毛、芽孢、莢膜等），負染色法、熒光染色法，革蘭染色法（結晶紫、碘液、95%酒精、堿性復紅），抗酸染色法（分枝桿菌、石炭酸復紅、美藍）18大腸桿菌革蘭染色陰性 19金黃色葡萄球菌革蘭染色陽性 20變形桿菌周身鞭毛21綠膿桿菌單鞭毛22肺炎鏈球菌莢膜23鉤端螺旋體24霍亂弧菌25破傷風芽胞桿菌26第三節(jié) 細菌的分離培養(yǎng)方法所

9、謂細菌的分離培養(yǎng)就是提供某細菌生長所需的各種條件（營養(yǎng)、溫度、濕度、酸堿度和氣體），將其從微生物混合物中培養(yǎng)出來的方法。 在細菌的分離培養(yǎng)過程中，必須采用無菌技術或稱無菌操作。 2728一、培養(yǎng)基的制備（一）培養(yǎng)基的種類：1. 按用途分類基礎培養(yǎng)基：僅最基本的營養(yǎng)成分。營養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基上加入葡萄糖、血液、血清等。增菌培養(yǎng)基：多為液體培養(yǎng)基，一般含有抑制劑，且是具有選擇性抑制作用的抑制劑。選擇性培養(yǎng)基：多為固體培養(yǎng)基，加有抑制物質，抑制其它非目的菌的生長或使其生長不佳。鑒別培養(yǎng)基：主要供細菌生化反應試驗用。專用培養(yǎng)基：適用于特定細菌的專門的培養(yǎng)基。29一、培養(yǎng)基的制備2. 按物理性狀分類

10、液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基（瓊脂含量0.30.8%）固體培養(yǎng)基（瓊脂含量1.22.0%）3. 按成分分類：合成培養(yǎng)基：由化學物質和成分已知的各種物質所組成，可以是無機鹽類，或無機鹽類加有機物質。天然培養(yǎng)基：化學成分不完全清楚，各批物質的成分很難一致，如蛋白胨、牛肉膏、血液、雞蛋。30一、培養(yǎng)基的制備（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用1. 營養(yǎng)物質：碳源、氮源及其它營養(yǎng)物質（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖類、血液、雞蛋、動物血清、酵母粉、生長因子、無機鹽類）。2. 水分：常用蒸餾水。3. 凝固物質：瓊脂4. 抑制劑和指示劑：如膽鹽、抗生素、染料等。31一、培養(yǎng)基的制備3、制備培養(yǎng)基的一般程序調配、矯正pH

11、、過濾澄清、分裝、滅菌、檢定、保存七個步驟。高壓蒸汽滅菌（121、115 ）、流動蒸汽滅菌（100） 、血清凝固器滅菌（80） 、水浴低溫滅菌（56） 32二、細菌接種方法（二）細菌的接種方法1. 平板劃線接種法（分離、鑒別 ）2. 斜面接種法（純培養(yǎng)、轉種 ）3. 半固體培養(yǎng)基接種法（觀察動力和保存菌種 ）4. 液體培養(yǎng)基接種法 （富集培養(yǎng)、生化反應等 ）5. 平板涂布、傾注接種法（藥敏、活菌計數(shù)等）33三、細菌的培養(yǎng)方法1. 需氧培養(yǎng)法（常規(guī)培養(yǎng)）2. CO2培養(yǎng)法CO2孵箱法（CO2鋼瓶 ）燭缸法（CO2含量約為510，氧氣約16% ）化學法（如碳酸氫鈉-鹽酸法）34三、細菌的培養(yǎng)方法3

12、. 厭氧培養(yǎng)法液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)（凡士林、皰肉、還原劑等）固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)（厭氧罐培養(yǎng)法，厭氧氣袋法，厭氧培養(yǎng)箱法 ，氣體噴射培養(yǎng)法（或稱轉管法）35四、細菌的生長現(xiàn)象（一） 細菌在固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象菌落形狀、大小、表面性狀、邊緣情況、顏色、透明度、質地、粘度、乳化性。血平板(溶血、溶血、雙環(huán))卵黃瓊脂(卵磷脂酶和脂酶：沉淀環(huán)和“珍珠包膜” )蛋白水解(清晰的環(huán))色素(水溶性，如綠膿色素、熒光色素等，脂溶性色素，如金黃色葡萄球菌的金黃色菌落)36四、細菌的生長現(xiàn)象氣味（假單胞菌屬：葡萄汁氣味；變形桿菌：巧克力燒焦的臭味；鏈球菌：霉臭；梭菌：糞臭、腐敗味；產(chǎn)黑色素類桿菌屬細菌：辛辣味）（二）

13、細菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象18h24h，包括：發(fā)育程度、渾濁度、沉淀、液體表面性狀、其它（色素、氣味、產(chǎn)酸、氣體）（三） 細菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象動力觀察37第四節(jié) 細菌的生化反應檢查法一、糖類代謝試驗1. 糖(醇)發(fā)酵試驗糖類是作為碳源和能量來源提供細菌合成菌體成分必需的原料，由于細菌各自具有不同的酶系統(tǒng)，故對糖(醇)類的分解能力不盡相同。酚紅、溴麝香草酚藍、溴甲酚紫和酸性復紅等指示劑液體、半固體、固體培養(yǎng)基 雙糖(或三糖)高層斜面38一、糖類代謝試驗2. 甲基紅（MR）試驗分解葡萄糖丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸 pH4.5以下加入甲基紅指示劑紅色。3. 伏普(Voges-Proskaue

14、r)試驗(V-P試驗)葡萄糖代謝中性最終產(chǎn)物乙酰甲基甲醇。葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇堿性溶液空氣氧化二乙酰（丁二酮） 加入胍基（如肌酸或肌酐、-萘酚等） 紅色化合物。39一、糖類代謝試驗4. -半乳糖苷酶試驗結構酶和適應酶（誘導酶）迅速，延遲，不發(fā)酵乳糖發(fā)酵乳糖的大腸菌能產(chǎn)生乳糖滲透酶和-半乳糖苷酶鄰-硝基苯-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)證明有無-半乳糖苷酶活性，可預測細菌發(fā)酵乳糖的能力。菌懸液+ ONPG，無色的ONPG被水解，釋放出黃色化合物鄰-硝基苯酚(ONP)40二、氨基酸和蛋白質代謝試驗1. 靛基質(吲哚)試驗細菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可與試劑中的二甲氨基苯甲醛作用，生成

15、玫瑰吲哚，為紅色化合物。2. 硫化氫試驗某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可與加入培養(yǎng)基中的鉛或鐵離子生成黑色硫化物。41二、氨基酸和蛋白質代謝試驗3. 尿素酶試驗有些細菌(如某些變形桿菌)具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨，使培養(yǎng)基pH上升，而變成堿性，使含有酚紅指示劑的培養(yǎng)基變成紅色。 4. 明膠液化試驗某些細菌產(chǎn)生明膠酶可使明膠分解，失去凝固力，使其由半固體轉化為液體狀態(tài)。42三、有機酸鹽和銨鹽利用試驗1. 檸檬酸鹽利用試驗有些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源，能在除檸檬酸鹽外不含其它碳源的培養(yǎng)基上生長，分解檸檬酸鹽，生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變成堿性。2. 馬尿酸鈉水解

16、試驗B群鏈球菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸。苯甲酸與三氯化鐵結合而沉淀或甘氨酸與茚三酮作用生成紫色化合物。43三、有機酸鹽和銨鹽利用試驗3. 丙二酸鹽利用試驗某些細菌利用丙二酸鹽作為唯一碳源時，丙二酸鈉可被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。44四、酶類試驗1. 氧化酶試驗（Kovacs試驗）氧化酶（又稱細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，能使還原型的細胞色素C氧化成氧化型的細胞色素C，氧化型細胞色素C又使對苯二胺氧化，生成紅色的醌類化合物。2. 過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）過氧化氫酶又稱觸酶，可使細菌代謝過程中的過氧化氫分解為水和氧。45四、酶類試驗3. 硝酸鹽還

17、原試驗某些革蘭氏陰性桿菌在代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽亞硝酸鹽+醋酸亞硝酸+對氨基苯磺酸重氮苯磺酸+-萘胺紅色的N-萘胺偶氮苯磺酸。4. 過氧化物酶試驗過氧化物酶的作用是將過氧化氫中氧轉移給可被氧化的物質。以聯(lián)苯胺作為被氧化的物質，如為過氧化物酶陽性細菌，加入過氧化氫可使聯(lián)苯胺氧化成為藍色。46第五節(jié) 細菌的血清學檢驗血清學鑒定（serological identity）已知診斷血清鑒定分離的細菌 血清學診斷（Serological diagnosis） 已知標準菌株測抗體，4倍上升（一）凝集試驗（Agglutination test）玻片法和試管法 （二）沉淀試驗（precipitati

18、on test）環(huán)狀沉淀試驗，絮狀沉淀試驗，凝膠中沉淀試驗47第六節(jié) 細菌毒素的檢測一、外毒素主要來自G+菌，蛋白質，不耐熱，抗原性強，選擇毒性抗體與濾液反應；已知細菌外毒素與患者血清反應；動物試驗(如破傷風痙攣毒素) 1. 白喉外毒素(diphtheria exotoxin) ：Elek平板、動物實驗2. 肉毒毒素(botulinic toxin)：動物實驗、中和試驗48二、內毒素主要來自G-菌，LPS，耐熱，抗原性弱，普遍毒性1. 家兔熱原試驗（rabbit pyrogen test，RT）2. 鱟試驗（limulus test，LT）3. 其它試驗（免疫學、生物學、化學發(fā)光、流式細胞術、高效液相等）49第七節(jié) 細菌數(shù)量的測定一、物理計數(shù)法1. Bree