第13章RNA代謝藥學(xué)系

1、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別 A-U，T-A，G-CA-T，G-C配對mRNA，tRNA，rRNA子代雙鏈DNA（半保留復(fù)制）產(chǎn)物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對稱轉(zhuǎn)錄）兩股鏈均復(fù)制模板轉(zhuǎn)錄復(fù)制A-U，T-A，G-CA-T，G-C配對mRNA，tRNA，rRNA子代雙鏈DNA（半保留復(fù)制）產(chǎn)物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對稱轉(zhuǎn)錄）兩股鏈均復(fù)制模板轉(zhuǎn)錄復(fù)制引物RNA引物無第一節(jié) 依賴DNA的RNA合成一、RNA是由RNA聚合酶合成的依賴DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase）

2、催化的反應(yīng)： 1959年，四個實驗室從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)此酶. Mg2 (NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPi RNA Lengthened RNA 特點：1.以雙鏈DNA為模板時酶活性最強。2.以35方向指導(dǎo)RNA的合成。3.遵守堿基配對規(guī)律。4.不需要引物。5.RNA合成以GTP或ATP殘基開始。Transcription by RNA polymerase in E. coli. 轉(zhuǎn)錄引起的DNA超螺旋變化（Supercoiling of DNA brought about by transcription）. 二、模板鏈與非模板鏈模板鏈（template strand): 用作

3、RNA合成的模板的鏈稱為模板鏈，或負(fù)鏈（minus (-) strand）、無意義鏈（antisense strand）。非模板鏈(nontemplate strand ): 與模板鏈互補的DNA鏈稱為非模板鏈，或正鏈（plus (+) strand）、有意義鏈（sense strand）、編碼鏈（coding strand）。腺病毒基因組編碼的遺傳信息（The genetic information of the adenovirus is encoded by a double-stranded DNA molecule, both strands of which encode prot

4、eins）. E. coli RNA polymerase:1.全酶（holoenzyme): 2702.核心酶（core enzyme): 2 3.亞基的作用： 決定轉(zhuǎn)錄的特異性 與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān)（催化） 結(jié)合DNA模板（開鏈） 70辨認(rèn)起始點。4.無35外切酶活性。第二節(jié)足跡法與啟動子 啟動子(promoters)： 為DNA轉(zhuǎn)錄單位調(diào)控序列中RNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位。一、RNA 合成是從啟動子開始的研究方法：保守序列或一致性序列（consensus sequence)： 5個大腸桿菌啟動子的序列（The sequences of five E. coli promoters） 1

5、.10區(qū): TATAAT序列（ Pribnow盒， Pribnow box ） The -10 region is often called the Pribnow box, after David Pribnow, the investigator who first recognized it in 1975. 2.35區(qū)： TTGACA序列（ 辨認(rèn)位點，recognition site ）二、足跡法（footprinting）足跡法為一種應(yīng)用DNA序列分析原理建立的技術(shù), 用于證實由某一特殊蛋白結(jié)合的DNA順序（Footprint analysis of the binding site

6、 for RNA polymerase on a DNA fragment ）.足跡法探測蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合序列RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄起始（Steps in the initiation of transcription by E. coli RNA polymerase）. 第三節(jié) RNA合成的終止一、非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止()特征：自身互補序列的區(qū)域，能在RNA鏈末端之前1520個核苷酸為中心形成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hairpin)。2.由模板鏈上的多腺苷酸轉(zhuǎn)錄形成的RNA 3-端的寡聚鳥苷酸序列（ oligo U）。5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACU

7、UUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3 DNA UUUU. UUUU.5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)終止機制1.發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能改變RNA-pol的構(gòu)象改變酶-模板結(jié)合方式酶停止移動。2.發(fā)卡結(jié)構(gòu)打斷

8、了轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中DNA-RNA雜交部分。3.Oligo U的作用: rU:dA的配對最不穩(wěn)定促使RNA新鏈從模板上脫落。二、依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止（）特征：1.終止子在模板上缺少重復(fù)腺苷酸序列，但有一段 短序列可轉(zhuǎn)錄為發(fā)卡結(jié)構(gòu)。2. 因子的組成與性質(zhì)：（1）六聚體，46KD 。 （2）能結(jié)合RNA，尤以對poly C的結(jié)合力最強。（3）有ATPase和RNA-DNA解螺旋酶（helicase）的活性。終止轉(zhuǎn)錄的可能機制： 因子與RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合 因子和RNA-pol變構(gòu)RNA-pol停頓，helicase的活性使DNA:RNA雜化雙鏈拆離轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物釋放。第四節(jié) 真核生物的RNA聚合酶分類及特點

9、RNA聚合酶識別的啟動子的保守序列一、RNA聚合酶需要許多轉(zhuǎn)錄因子 （transcription factors,TF）二、RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子在啟動子上的組裝三、RNA的合成過程TF H的一個亞基具有激酶活性，磷酸化Pol C端的數(shù)個基團復(fù)合物變構(gòu)轉(zhuǎn)錄開始 TF E、 TF H先后釋放延長，TF F繼續(xù)與Pol 結(jié)合終止 Pol 脫磷酸化。四、RNA聚合酶可被選擇性抑制 放線菌素D和吖啶 的作用：作用于延 長階段。其雜環(huán)部 分可插入有兩個連 續(xù)GC的DNA雙 螺旋中DNA變形 阻止RNA聚合酶 移動。放射菌素D吖啶利福平的作用： 與細(xì)菌RNA聚合酶亞基特異結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄起始。-鵝膏蕈堿的作用

10、：Pol 。 可抑制Pol 。 3.對細(xì)菌RNA聚合酶無作用。第五節(jié) 新生RNA的剪接和修飾轉(zhuǎn)錄初始物（primary transcript): 指新合成的RNA分子。真核生物mRNA及細(xì)菌和真核生物tRNA的轉(zhuǎn)錄初始物必需進行加工。斷裂基因（split gene)、內(nèi)含子（introns)與外顯子（exons): 真核生物的結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)被非編碼區(qū)所間隔,稱為斷裂基因。內(nèi)含子和外顯子分別表示相應(yīng)的非編碼和編碼序列，外顯子還用來代表hnRNA上的編碼序列。真核生物primary transcript 的形成及加工一、除去內(nèi)含子的剪接過程內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)： 內(nèi)含子是通過DNA模板與其轉(zhuǎn)錄的mRNA

11、的雜交實驗發(fā)現(xiàn)的。各類內(nèi)含子的剪接： 內(nèi)含子有4種類型。其中第一、第二類內(nèi)含子的剪接相似：即均不需要高能輔助因子（如ATP），均包括兩個轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。1. 類內(nèi)含子的剪接：第一步親核劑為鳥苷、GMP、GDP或GTP。pG-OH(ppG-OH, pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)UpAGpU外顯子1內(nèi)含子外顯子2G-OHUpUpGpA剪接過程的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng) (twice transesterification) 2. 類內(nèi)含子的剪接：第一步的親核劑為內(nèi)含子的一個腺苷酸殘基的2-羥基。3.類內(nèi)含子的剪接：需要剪接體（spliceosome）的作用（1）剪接體含有小核RN

12、A（ small nuclear RNA，snRNA）： snRNA廣泛存在于真核生物的細(xì)胞核， 其中U1、U2、U4、U5和U6五種snRNA參與剪接反應(yīng)。 snRNA與蛋白質(zhì)形成小核核糖蛋白（small nuclear ribonucleoproteins， snRNPs or snurps ）。（2）內(nèi)含子的剪接點： 多數(shù)內(nèi)含子的5端含GU， 3端含AG，故把5GU.AG-OH-3稱為剪接點（splice site)。（3）U1 snRNA及U2 snRNA與剪接點的互補結(jié)合：（4）剪接機制4. 類內(nèi)含子的剪接： 類內(nèi)含子見于一些tRNA，其剪接需ATP和核酸內(nèi)切酶。二、真核生物 mRN

13、A進行裝飾性加工 在細(xì)胞核內(nèi)進行。戴帽(5-cap) :1.帽子結(jié)構(gòu)：2.戴帽過程：3.帽子的功能：（1）與翻譯的起始有關(guān)： 5-帽子與一種起始必需的因子特異結(jié)合促進mRNA與核糖體結(jié)合啟動翻譯。（2）與剪接反應(yīng)有關(guān)，保護mRNA 5-端不被磷酸酶及核酸酶降解。加尾（ 3-poly A tail) ：1.過程： 內(nèi)切核酸酶多聚腺苷酸聚合酶2. poly A tail 的作用： poly A tail的長度隨mRNA的壽命而縮短；隨著poly A tail的縮短，翻譯的活性下降，故 poly A tail的有無與長短，可能是維持mRNA作為翻譯模板的活性，以及增加mRNA自身穩(wěn)定性的因素。Ove

14、rview of the processing of a eukaryotic mRNA. 三、不同RNA剪接方式導(dǎo)致一個基因多種產(chǎn)物mRNA的簡單轉(zhuǎn)錄物（simple transcript）僅產(chǎn)生一種成熟的mRNA和一種多肽。復(fù)雜轉(zhuǎn)錄物（complex transcript ）可產(chǎn)生兩個或多個不同的mRNA和多肽。真核生物復(fù)雜轉(zhuǎn)錄物的兩種加工機制（Two mechanisms for the differential processing of complex transcripts in eukaryotes）大鼠降鈣素基因轉(zhuǎn)錄物的不同加工機制（Differential processin

15、g of the calcitonin gene transcript in rats）. 甲狀腺降鈣素 降鈣素基因相關(guān)蛋白四、rRNA和tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工 細(xì)菌rRNA前體的加工真核生物rRNA前體的加工細(xì)菌和真核生物中tRNA的加工（Processing of tRNAs in bacteria and eukaryotes）.tRNAs中修飾后的一些稀有堿基（Some of the modified bases found in tRNAs, produced in posttranscriptional reactions）. 第六節(jié) 核 酶核酶（ribozyme)： 具有酶活性

16、的RNA稱為核酶或RNA酶（RNA enzyme)。核酶的大部分活力基于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)。底物： RNA。有時底物為核酶自身的一部分。核酶的三維結(jié)構(gòu)對其功能至關(guān)重要。四膜蟲自我剪切rRNA的二級結(jié)構(gòu)及可能的三級結(jié)構(gòu)一、類內(nèi)含子的酶學(xué)特性輔助因子鳥苷與四膜蟲的結(jié)合是飽和的(Km 30 M) ，并可被3-脫氧尿苷抑制。內(nèi)含子的切除反應(yīng)非常精確：內(nèi)導(dǎo)序列可與5 剪接點的外顯子配對。四膜蟲rRNA內(nèi)含子（414nt）5端自我切除19個核苷酸L-19 IVS（intervening sequence lacking 19 nucleotides）高效的酶活力催化核苷酸的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。四膜蟲L-1

17、9IVS的體外催化活性（In vitro catalytic activity of L-19 IVS of Tetrahymena） GOH3G5OH53GOH414G 3995339553E1E2I四膜蟲RNA的自我剪接53L19RNA具有催化活性的片段第七節(jié) 以RNA為模板的DNA及RNA合成Extension of the central dogma to include RNA-dependent synthesis of RNA and DNA.一、反轉(zhuǎn)錄酶從病毒RNA產(chǎn)生DNA 1962年, Howard Temin 預(yù)言RNA 病毒中有反轉(zhuǎn)錄 病毒，1970年， Temin和D

18、avid Baltimore 分別 發(fā)現(xiàn)該酶。反轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)： 含Zn2 。1.RNA指導(dǎo)的DNA的合成。2.RNA-DNA雜交鏈中RNA的降解（RNase H活性）。3.DNA指導(dǎo)的DNA的合成：需tRNA（來自感染早期的病毒顆粒）作引物。4.無35外切酶（proofreading exonucleases）活性:出錯率為120 000 nt極高的進化率。反轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA 模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA 雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆病毒對哺乳動物細(xì)胞的感染及在宿主染色體上的整合逆轉(zhuǎn)錄病毒有三種基因， 其中 gag、 pol與env分別編碼兩種多聚蛋白（po

19、lyprotein）： 1.gag和pol多聚蛋白被切割為六種蛋白質(zhì) 2. env另一種多聚蛋白病毒被膜蛋白。長末端重復(fù)序列（long terminal repeat， LTR）：位于病毒線性RNA的每一端，長數(shù)百nt， LTR含有病毒基因組整合進宿主所必須的的序列及啟動子。二、一些逆轉(zhuǎn)錄病毒引起癌癥或艾滋病 勞氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus ，also called avian sarcoma virus）：為第一種被研究的RNA腫瘤病毒。 src為酪氨酸蛋白激酶基因人類獲得性免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus ，HIV）：逆轉(zhuǎn)錄病毒，為艾滋?。╝cquired immune deficiency syndrome ，AIDS）的致病因子。其env基因