宏基因組學(xué)在基因發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

1、宏基因(jyn)組學(xué)在基因(jyn)發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用 何佳2015.1共二十二頁Contents宏基因組學(xué)簡(jiǎn)介1研究方法及應(yīng)用2在基因發(fā)現(xiàn)過程中的應(yīng)用3展望4共二十二頁一、宏基因組學(xué)簡(jiǎn)介(jin ji)宏基因組學(xué)（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)其主要含義是：對(duì)特定環(huán)境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進(jìn)行克隆，并通過構(gòu)建宏基因組文庫和篩選等手段獲得新的生理活性物質(zhì)；或者根據(jù)(gnj)rDNA數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物，通過系統(tǒng)學(xué)分析獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學(xué)信息共二十二頁為什么要研究(ynji)宏基因組學(xué)？在自然條件下,微生物廣泛參與、

2、和等重要元素的循環(huán)轉(zhuǎn)化(zhunhu),并在人體的食物消化、毒素降解及機(jī)體免疫反應(yīng)、環(huán)境污染物降解等方面發(fā)揮著重要作用微生物通過其群落而非單一個(gè)體來執(zhí)行這些重要功能,而目前人們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)主要基于實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的單一微生物物種,對(duì)微生物群落作為整體的功能的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對(duì)其個(gè)體的認(rèn)識(shí)共二十二頁二、研究方法(fngf)及應(yīng)用研究方法以基因組測(cè)序技術(shù)為依托主要程序：1、從環(huán)境樣品 (例如土壤 )中直接提取 DNA; 2、將 DNA克隆到合適的載體中;3、將載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌建立(jinl)環(huán)境基因組文庫;4、對(duì)得到的環(huán)境基因組文庫進(jìn)行分析和篩選 共二十二頁環(huán)境(hunjng)樣品富集培養(yǎng)(piyn

3、g)DNA提取小片段插入質(zhì)粒載體大片段插入柯斯BAC等載體宏基新組文庫構(gòu)建序列分析法功能分析法底物誘導(dǎo)法直接裂解法細(xì)胞分離提取法插入寄主（大腸桿菌、鏈霉菌、假單胞菌）文庫篩選宏基因組文庫構(gòu)建與篩選流程示意圖：共二十二頁宏基因組學(xué)的應(yīng)用(yngyng)：16SrDNA文庫(wnk)微生物多樣性分析宏基因組水平基因轉(zhuǎn)移的分析未培養(yǎng)生物單細(xì)胞基因組的基因構(gòu)成傳感微生物細(xì)胞之間的相互作用基因組文庫構(gòu)建及新型生物技術(shù)的應(yīng)用新型代謝途徑中原位擴(kuò)增識(shí)別宏基因組學(xué)共二十二頁三、在基因(jyn)發(fā)現(xiàn)過程中的應(yīng)用宏基因組文庫的篩選方法是新基因發(fā)現(xiàn)的一種新策略基因組文庫的構(gòu)建是揭示新基因的前提，如何有效地利用文庫中

4、豐富的資源,挖掘新的生物(shngw)分子是關(guān)鍵由于環(huán)境基因組的高度復(fù)雜性,需要通過高通量和高靈敏度的方法來篩選和鑒定文庫中的有用基因共二十二頁第1類基基于克隆子的特殊代謝活性(功能驅(qū)動(dòng))第2類于核酸序列差異分析(序列驅(qū)動(dòng))第3類基于底物誘導(dǎo)基因的表達(dá)第4類基于包括(boku)穩(wěn)定性同位素和熒光原位雜交在內(nèi)的其它技術(shù).篩選技術(shù)大致(dzh)可分為4類:共二十二頁1、功能(gngnng)分析法以活性測(cè)定為基礎(chǔ) ,通過建立和優(yōu)化合適的方法從基因組文庫中獲得具有特殊功能的克隆依賴于功能基因或編碼功能蛋白在外源宿主中的表達(dá) 能夠在各種( zhn)選擇性平板上通過可見性狀篩選的到產(chǎn)生脂酶、淀粉酶、七葉苷

5、水解酶、甘油脫水酶及抗菌活性的克隆子共二十二頁方法一：對(duì)具有特殊功能的克隆子進(jìn)行直接檢測(cè) ；方法二：基于異源基因的宿主(szh)菌株與其突變體在 選擇性條件下功能互補(bǔ)生長(zhǎng)的特性進(jìn)行 共二十二頁2、序列(xli)分析法根據(jù)已知的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，通過雜交(zjio)或PCR擴(kuò)增鑒定出已知基因的同源物,進(jìn)而篩選陽性克隆子對(duì)鑒定新的基因成員有一定的局限性 ,但它已被有效地用于鑒定系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中的標(biāo)志基因(如 16S rRNA基因 )和帶有高度保守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、葡萄糖酸還原酶和腈水合酶等 ) 共二十二頁2.1 隨機(jī)(su j)鳥槍法（Shotgun seque

6、ncing） 將一條完整的目標(biāo)序列(xli)隨機(jī)打斷成小的片段 ,分別測(cè)序 ,然后利用計(jì)算機(jī)根據(jù)序列(xli)間的重疊關(guān)系進(jìn)行排序和重新組裝, 并確定它們?cè)诨蚪M中的正確位置 。共二十二頁優(yōu)點(diǎn)：為篩選新的天然產(chǎn)物提供了一種可選擇的途徑, 從中挖掘上百萬個(gè)新基因,揭示不可培養(yǎng)(piyng)微生物的代謝途徑.缺點(diǎn)：耗費(fèi)大,需大量人力和物力；與個(gè)體微生物基因相比,對(duì)序列片段進(jìn)行分析則極為困難。共二十二頁2.2 焦磷酸測(cè)序( Pyrosequencing) 焦磷酸測(cè)序技術(shù)是在焦磷酸鹽測(cè)序法的基礎(chǔ)上結(jié)合一種乳膠材料和皮升級(jí)反應(yīng)孔 ,將基因組 DNA進(jìn)行隨機(jī)切割 ,批量地進(jìn)行整個(gè)測(cè)序反應(yīng)，能夠在相同的時(shí)間

7、內(nèi)破譯 6 106組以上的基因組序列(xli) ,比 Sanger法要快100倍 ,提高了測(cè)序的效率。共二十二頁由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。原理：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的(md)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測(cè)單鏈、測(cè)序引物和4種酶構(gòu)成。反應(yīng)底物為5-磷酰硫酸、熒光素。焦磷酸測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)(tdin)及原理：共二十二頁測(cè)序過程(guchng): 脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)

8、 DNA聚合酶（能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)） 添加到測(cè)序引物的3末端 （釋放） 焦磷酸(PPi) ATP硫酸化酶加入 APS 特異的檢測(cè)峰 （微弱光檢測(cè)） ATP氧化熒光(ynggung)素（產(chǎn)生可見） 加入熒光素共二十二頁3、底物(d w)誘導(dǎo)基因表達(dá)法第一步：以 p18GFP為載體構(gòu)建宏基因組文庫；第二步：在無底物情況下以異丙基 2D硫代半乳糖苷 基因 ( gfp)表達(dá)的克隆子； 第三步：在培養(yǎng)基中添加底物誘導(dǎo)代謝關(guān)基因的表達(dá)；第四步：根據(jù) gfp基因的表達(dá)從宏基因克隆庫中篩選出表 達(dá)代謝基因的克隆子 ,利用熒光激活細(xì)胞分離(fnl)儀 ( FACS)從瓊脂培養(yǎng)平板上將GFP表達(dá)的克隆

9、子分 離出來。共二十二頁4、穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù) 通過 SIP實(shí)驗(yàn)使參與特定代謝過程 (例如甲烷氧化 )的生物基因組富集 ,克隆從 SIP實(shí)驗(yàn)中獲得的13C標(biāo)記的核酸 ,從而構(gòu)建一個(gè)因吸收了特定的基質(zhì)而在環(huán)境中執(zhí)行特定代謝功能的微生物宏基因組文庫 .這極大地減少(jinsho)了需要篩選的克隆數(shù)量.通過實(shí)驗(yàn)直接克隆13-并在一個(gè)較小的克隆文庫中獲取目的基因也是可行的共二十二頁四、展望(zhnwng)從宏基因組文庫中獲得新編碼基因是該技術(shù)的主要功能所在,已發(fā)現(xiàn)(fxin)的新基因主要有生物催化劑基因、抗素抗性基因以及編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因方法上仍存在著多方面有待解決的問題,比如在基因組提取和純化方面,

10、針對(duì)不同的樣品并沒有統(tǒng)一的方法，載體和宿主的選擇也是文庫能否構(gòu)建成功的關(guān)鍵分子生物芯片技術(shù)是頗受歡迎的一種高通量篩選方法,而且其效率很高,準(zhǔn)確率也能令人信服,但是其成本也是我們不能不考慮的問題。針對(duì)在宏基因組文庫構(gòu)建過程中出現(xiàn)的瓶頸,仍需要不斷的更深入的研究共二十二頁thank you ！請(qǐng)老師(losh)及同學(xué)批評(píng)指正共二十二頁內(nèi)容摘要宏基因組學(xué)在基因發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。宏基因組學(xué)（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)。其主要含義是：對(duì)特定環(huán)境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進(jìn)行克隆，并通過構(gòu)建宏基因組文庫和篩選等手段獲得(hud)新的生理活性物質(zhì)。宏基因組文庫的篩選方法