時間分辨熒光免疫分析的原理

1、一、前言近百年來，“特效試劑一直是分析化學家追求的目標。所謂“特效試劑”，就是指 的是只與一種待測物質反應的試劑。事實上，目前使用的所謂的“銅試劑”、“鐵 試劑”、“硝酸試劑”等等，都是“盛名之下，其實難副”的。20世紀40-50年代追 求合成特效試劑的狂熱，早已降溫。正在分析化學家心灰意冷之際，人們從免疫 學與生物化學的成就看到了這一理想的曙光：免疫系統(tǒng)簡直就是天然存在的一部 特異性試劑的合成機器?？乖c抗體之間的免疫反應具有高度的特異性，這種識 別的專一性超過酶對底物的識別水平，抗原-抗體復合物的穩(wěn)定常數一般為109, 有些高達1010-1015，具有很高的穩(wěn)定性。免疫反應的特點使得免疫分

2、析已成為 一個跨學科的新型分析技術，廣泛應用于臨床體液分析、藥物分析、環(huán)境分析、 食品分析和生物化學研究，尤其在毒品的鑒定、吸毒人員的認定和疾病的診斷方 面，發(fā)揮了重要作用。時間分辨熒光免疫分析技術（TRFIA）是自80年代以來新發(fā)展起來的一種新型分 析技術，與其它免疫分析技術相比，有其獨特的優(yōu)點。它克服了放射性免疫分析 法（RIA）中放射性同位素帶來的污染問題；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不 穩(wěn)定的缺點；而且，由于TRFIA法能夠很好的消除背景熒光的干擾，使其靈敏度 比普通熒光法（FIA）高出幾個數量級。正是由于TRFIA的獨特優(yōu)點，使得它成 為免疫分析中最有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N分析方法。二、

3、時間分辨熒光免疫分析的原理時間分辨熒光免疫分析的原理就是使用三價稀土離子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、 Dy3+）作為示蹤物，通過這些稀土離子與具有雙功能結構的螯合劑以及抗原形成 稀土離子-螯合劑-抗原螯合物。當標記抗原、待測抗原共同競爭抗體，形成免疫 復合物，由于免疫復合物中抗原抗體結合部分就含有稀土離子，當采取一些辦法 將結合部分與游離部分分開后，利用時間分辨熒光分析儀，即可測定復合物中的 稀土離子發(fā)射的熒光強度，從而確定待測抗原的量。正常情況下，免疫復合物中的稀土離子自身熒光信號很微弱，若加入一種酸性增 強液，稀土離子從免疫復合物中解離出來，和增強液中的8-二酮體、三正辛基氧 化膦、

4、Triton X-100等成分形成一種微囊。后者被激發(fā)光激發(fā)后，則稀土離子可 以發(fā)出長壽命的極強的熒光信號，使原來微弱的熒光信號增強將近100萬倍。采用時間分辨技術測量熒光，采用了門控技術，它是使背景熒光信號降低到零以 后，再測定長壽命標記物的熒光。三、時間分辨熒光分析的測量方法（1）解離增強測量法 解離增強測量法是解離增強稀土離子熒光方法，簡稱DELFIA法。通過雙功能基 團把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗體或SA上，免疫反應后，部分標記物結合到 固相載體上，未結合的標記物被洗掉。最后用低pH值的增強液，把Eu3+或Sm3+ 從免疫復合物中解離下來，組成Eu3+-（NTA）3.（TOPO）

5、3或Sm3+-（NTA）3.（TOPO）3新 的螯合物，使熒光強度增強將近百萬倍。用Arcus型系列儀進行液相檢測。本法 重復性好，特別適用于大、小分子活性物質的檢測。采用DELFIA測量，靈敏度 可達10-1610-18mol的DNA量（即10pgDNA）。此法的不足之處是不能直接測 量固相樣品的熒光，需要外加增強液，容易受外源性Eu3+或Sm3+干擾，而影響 結果，有待改進。（2）固相熒光測量法固相熒光法又稱為DSLFIA法。它是通過具有特殊雙功能基團的螯合劑BCPDA， 把Eu3+或Sm3+與抗體或抗原螯合。當抗原與抗體發(fā)生免疫反應后，固相免疫復 合物中Eu3+-BCPDA熒光強度可直接

6、測量。整個過程不用外加增強液，可以直接 測量固相樣品的熒光，解決了液相測量帶來易于污染和操作復雜的問題。現(xiàn)已用 于核酸探針檢測，取得滿意進展，國外已制成藥盒供應。（3）直接熒光測量法直接熒光法是采用雙功能螯合劑二乙三胺五乙酸-對氨基水楊酸（DTPA-PAS）與 抗原或抗體偶聯(lián)，免疫反應后，再加入適量的Tb3+，直接測量液相熒光強度。 不需要預先制備Tb3+標記物，簡化了操作步驟，但靈敏度較低，僅為10-9mol/l。 為提高檢測靈敏度，可以引入酶放大系統(tǒng)，以SA-堿性磷酸酶水解5-氟水楊酸磷 酸酯，生成5-氟水楊酸，后者在高pH條件下，與Tb3+-EDTA-HCl形成高熒光強 度的復合物，可直

7、接測定。（4）均相熒光測量法均相熒光測量法是利用特殊的雙功能螯合劑W1174，將Eu3+標記小分子活性物 質，當與抗體結合后，免疫復合物對Eu3+熒光信號有顯著增強或淬滅作用，故 在測量前不必進行分離，就可直接測量液相中的熒光強度。該法省去了洗滌、分 離和加增強液等煩瑣的步驟，具有快速、方便等優(yōu)點，但不足之處是需要特殊螯 合劑。（5）協(xié)同熒光測量法協(xié)同熒光測量法是利用一些不發(fā)熒光的稀土離子，如Cd3+、Y3+、La3+、Lu3+等， 能使發(fā)熒光的稀土離子的熒光信號大大增強。在免疫分析體系中，pH值為6.0-8.0 時，它們的熒光強度最大，有利于提高檢測的靈敏度。此外，此法可以對一分樣 品中不同

8、組分含量進行同時測量。但需要特殊的增強液，同時Cd3+、Y3+、La3+、 Lu3等稀土離子的純度對測量結果有明顯影響。四、時間分辨熒光免疫分析的應用時間分辨熒光免疫分析可用來檢測生物活性物質，特別是在生物樣品免疫分析 中，顯示出它愈來愈多的獨特優(yōu)點。在內分泌激素的檢測，腫瘤標志物的檢測， 抗體檢測，病毒抗原分析，藥物代謝分析以及各種體內或外源性超微量物質的分 析中，應用TRFIA法越來越普遍。近年來，已將這項技術應用于核酸探針分析和 細胞活性分析、生物大分子分析，發(fā)展十分迅速。（1）TRFIA法在內分泌學中的應用內分泌激素是一些活性小分子，它們能與適當的抗體反應，具有免疫反應性，但 不能產生

9、抗體，不具有免疫原性，它們屬于半抗原。對這些半抗原的測定，一般 多用競爭性時間分辨熒光免疫法測定。這方面的測定主要有血清中孕酮3、雌 二醇4、睪酮5、甲狀腺激素6、前列腺素7的測定等等。（2）TRFIA在腫瘤學中的應用對一些完全抗原，它們大多是既有免疫反應性又有免疫原性的蛋白質類，主要包 括促甲狀腺激素8、血清胰島素9、血清癌胚抗原10-11、血清甲胎蛋白12、 乙型肝炎表面抗原13等，主要采用非競爭性TRFIA法進行測定。（3）TRFIA法在免疫學中的應用某些免疫細胞（如NK、LAK、T殺傷細胞等）的活性，可以用TRFIA法來檢測。如Blomberg14等用該方法測定了 NK細胞的活性；Gr

10、anberg15等用TRFIA法測 定殺傷性T淋巴細胞活性；Volgmann16等測定了 LAK細胞的活性；Maley17 用TRFIA法測定細胞介導的、補體介導以及抗體依賴的細胞活性；Lovgren和 Blomberg18用此法同時測定兩種靶細胞的活性；陳泮藻19等也用此法測定了 T 淋巴細胞的活性。這些測定均取得了良好的結果。（4）TRFIA法在微生物學中的應用由于TRFIA技術具有靈敏度高和特異性強的特點，TRFIA法在微生物檢測和分析 中的應用日益廣泛和深入。目前TRFIA已廣泛應用于乙型肝炎病毒、腦炎病毒、 流感病毒、呼吸道合胞體病毒（RSV）、副粘病毒、風疹病毒、馬鈴薯病毒、輪 狀病毒、人類免疫缺陷病毒（HIV）、出血熱病毒和梅毒螺旋體的抗原抗體以及 某些細菌和寄生蟲抗體的檢測2。最近,潘利華20等用TRFIA法進行了人血清中 丙型肝炎病毒抗體（Anti-HCV）的檢測，效果明顯高于酶聯(lián)免疫法。五、展望時間分辨熒光免疫分析具有靈敏度高、特異性強、所用試劑有良好的穩(wěn)定性、檢 測限較寬、