固定化酶的制備(共5頁)

1、固定化酶制備及酶活力(hul)測定實(shí)驗(yàn)者：張玲玲(ln ln) 綠藥1班 201330360126 同組者：金雨馨、管青青實(shí)驗(yàn)(shyn)日期：2015/3/13 報告完成日期：2015/3/20實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：易喻摘要：酶的固定化技術(shù)是用固定材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，酶仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。酶活力的測定實(shí)質(zhì)是測定被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。本文通過包埋法對酶進(jìn)行固定化，并利用福林酚反應(yīng)測定堿性蛋白酶的酶活力。結(jié)果表明：固定酶能夠增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，多次使用，但會造成酶活力的降低。關(guān)鍵詞：固定化酶 酶活力 包埋法Abstract：Enzyme immobilizat

2、ion is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embeddin

3、g and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity.前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時，還呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性

4、高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點(diǎn)。依據(jù)酶的性質(zhì)及用途，可通過包埋法、交聯(lián)法、吸附法及共價結(jié)合法來實(shí)現(xiàn)酶的固定化。其中包埋法是將酶包裹于凝膠網(wǎng)格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝膠有瓊脂、海藻酸鹽以及聚丙烯酰胺凝膠等；用于制備微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分為網(wǎng)格型和微囊型兩類，其制備工藝簡便且條件較為溫和、可獲得較高的酶活力回收。測定酶活力實(shí)際就是測定被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)的速度可以用單位時間內(nèi)反應(yīng)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示，為了靈敏起見，通常是測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。由于酶促反應(yīng)速度可隨時間的推移而逐漸降低其增加值，所

5、以，為了正確測得酶活力，就必須測定酶促反應(yīng)的初速度。福林酚試劑是磷鉑酸鹽與磷鎢酸鹽的混合物。它在堿性條件下不穩(wěn)定，能被酪氨酸中的酚基還原，生成鉑藍(lán)、鎢藍(lán)的混合物。酪蛋白在 HYPERLINK /yp/product-list-470.html t _blank 蛋白酶作用后產(chǎn)生的酪氨酸可與福林酚試劑反應(yīng)，所生成的藍(lán)色化合物可用比色法測定。正文：1.實(shí)驗(yàn)過程1.1試劑(shj)與儀器1.1.1試劑(shj)海藻(hi zo)酸鈉、3.0%氯化鈣堿性蛋白酶（1.0mg/mL）福林試劑1%酪蛋白溶液PH10緩沖液標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液0.4mol/L碳酸鈉溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液1.1.2儀器磁力

6、攪拌器恒溫水浴鍋?zhàn)⑸淦鳠?00mL,500mL）布氏漏斗分析天平容量瓶移液管721分光光度計1.2操作步驟1.2.1酶的固定化稱取1.00g海藻酸鈉于盛有30mL蒸餾水的燒杯中，加熱至沸騰完全溶解后，放置室溫漸冷卻至38左右，加入預(yù)先制備好的堿性蛋白酶溶液20mL。用注射器抽取海藻酸鈉酶混合物，將混合物緩慢滴入盛有200mL3.0氯化鈣溶液的燒杯中，同時燒杯置于磁力攪拌器上勻速攪拌，滴完后靜置硬化30min，傾去氯化鈣溶液，用適量蒸餾水洗滌2-3次，除去漂浮的空化珠狀顆粒后，即制備得到固定化的堿性蛋白酶。1.2.1酶活力的測定制備酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(1) 取7支試管，編號，按下表配制不同含量的

7、酪氨酸溶液。（見下表）(2) 在上述7支試管中，分別加入1%酪蛋白溶液1mL，于40水浴中保溫15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分搖勻，各管分別用濾紙過濾。(3)分別吸取濾液1mL放入另7支試管中，加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5 mL，福林試劑1mL，充分搖勻，于40水浴中保溫15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸餾水，充分搖勻。(4) 用721型分光光度計，以0號管作對照，在680 nm處測定光密度。(5) 以光密度為縱坐標(biāo)，酪氨酸含量（微克數(shù)）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管編號酪氨酸含量（g ）1/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL）蒸餾水( mL )012345

8、6010020030040050060000.10.20.30.40.50.62.01.91.81.71.61.51.41.2.2固定化酶活力(hul)測定上述固定化的蛋白酶或相當(dāng)量的游離(yul)蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10緩沖液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40水浴保溫15min后，取3 mL置于試管中，加3 mL三氯醋酸溶液。對照管為1 mL緩沖液1 mL蛋白酶液3 mL三氯醋酸溶液1 mL 1%酪蛋白溶液（順序(shnx)不可顛倒），于40水浴保溫15min。搖勻后，各管分別過濾，吸取濾液1mL，加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5mL，福林試劑1 m

9、L，充分搖勻，于40水浴保溫15min，然后每管各加入3 mL蒸餾水，搖勻。用721型分光光度計在波長680 nm處，以對照管為對照，測定吸光值。2.結(jié)果與討論2.1結(jié)果2.1.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表2-1酪氨酸含量與吸光度關(guān)系表酪氨酸含量（微克）0100200300400500600吸光度00.1180.2020.2680.3930.5630.600舍去與擬合直線差距較大的點(diǎn)（500,0.563），再次(zi c)擬合，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好。y=0.001x+0.00512.1.2酶活力(hul)的測定本實(shí)驗(yàn)(shyn)中堿性蛋白酶活力單位的定義：1克堿性蛋白酶粉在pH 10，40的條件

10、下，每分鐘水解酪蛋白能產(chǎn)生1微克酪氨酸，定為一個酶活力單位（U）。本實(shí)驗(yàn)中堿性蛋白酶活力單位的計算：每克堿性蛋白酶的活力單位 = m / t fm： 樣品所測定的光密度值，經(jīng)查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酪氨酸量（g）；t： 酶促反應(yīng)的時間（15 min）；f： 酶的稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中f = 1000表2-4固定酶與游離酶活力的測定比較表酶量（毫克）OD值酪氨酸量（微克）堿性蛋白酶活力單位(U)酶結(jié)合效率（%）空白1.00.0000.00.0058.06%固定酶1.00.269263.917593.33 17626.671.00.270264.917660.00 游離酶1.00.455449.929993.

11、33 30360.001.00.466460.930726.67 2.2討論2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析圖2-2為將實(shí)驗(yàn)測得的六組數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到的R20.99，線性關(guān)系不是很理想，因此舍去了偏離直線較遠(yuǎn)的點(diǎn)（500，0.563）,得到圖2-3，線性關(guān)系良好。部分?jǐn)?shù)據(jù)與直線偏離較遠(yuǎn)，可能是由于比色皿沒有洗干凈,水浴保溫時每管的水浴時間不一樣等其它原因。標(biāo)準(zhǔn)曲線是為了計算酪氨酸含量的，標(biāo)準(zhǔn)曲線越標(biāo)準(zhǔn)，計算出來的數(shù)據(jù)才有意義，如果線性不好的話，會對結(jié)果造成影響。2.2.2酶活力(hul)的分析表2-4為酶活力的測定以及比較。由表中數(shù)據(jù)分析得：固定酶的酶活力要低于游離酶的酶活力，說明在酶固定

12、的過程中有部分酶的損失。并且從表中可發(fā)現(xiàn)相同酶的兩組OD值還是有差距的，尤其是游離酶的兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差距比較大，可能是在實(shí)驗(yàn)的過程中保溫時間控制的不好(b ho)，沒有及時加入三氯醋酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：固定酶能夠增強(qiáng)(zngqing)酶的穩(wěn)定性，多次使用，但會造成酶活力的降低。3.注意事項(xiàng)與心得總結(jié)3.1注意事項(xiàng)酶液與加熱溶解的海藻酸鈉混合時，海藻酸鈉溶液一定要冷卻至40以下后再加入酶液，以免高溫導(dǎo)致堿性蛋白酶酶失活。固定化酶顆粒制備中，海藻酸鈉酶混合物向CaCl2溶液滴加的速度不要過快，混合物要呈顆粒進(jìn)入CaCl2溶液，以免形成念珠狀顆粒。在制備酶活力測定的空白對照時要先加入三氯醋酸使酶失活，

13、再加入酪蛋白溶液，順序不可以顛倒。在酶活力測定是要嚴(yán)格控制水浴保溫的時間一致，控制變量，減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.2心得總結(jié)本實(shí)驗(yàn)通過包埋法進(jìn)行了固定化酶的制備及固定酶與游離酶的酶活力比較，發(fā)現(xiàn)固定酶雖然能夠增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，便于酶和底物的分離，但是會造成酶量的損失，使酶活力降低。所以需要尋求一種能提高酶結(jié)合率的固定方法。本實(shí)驗(yàn)僅單純的對游離酶和固定酶的酶活進(jìn)行了比較，還可以設(shè)計系列實(shí)驗(yàn)對固定酶的其它性質(zhì)如最適溫度，最適PH等進(jìn)行研究。致謝：感謝隊(duì)友們的合作以及易喻老師的耐心指導(dǎo)！參考文獻(xiàn)：1固定化酶的制備及應(yīng)用期刊論文 李彥鋒, 李軍榮, 伏蓮娣, LI Yan-feng, Li Jun-rong, FU Lian-di - 高分子通報2001年2期2黑曲霉果膠酯酶固定化前后酶學(xué)性質(zhì)比較研究期刊論文 張慶坤, LEI Ji, 付亞敏, FAN Yang, 劉剛, ZHANG Qing-