微生物的實驗室培養(yǎng)課件

1、(最新整理)微生物的實驗室培養(yǎng)ppt2021/7/261課題1 微生物的實驗室培養(yǎng)專題2 :微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用2021/7/262微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進行光合作用. 原核生物界 原生生物界真菌界病毒界微生物基礎(chǔ)知識2021/7/263細菌的外形與大小細菌：單細胞不分枝的原核微生物。細菌細胞微小而透明，通常用適當染料染色后顯微鏡觀察圖1-1 常見的三種細菌典型形態(tài)A.球菌 B.桿菌 C.弧菌2021/7/264細菌細胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖

2、）毛、莢膜、細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)，細胞質(zhì)中又有液泡、儲存性顆粒、核質(zhì)等。細菌的構(gòu)造圖1-3 細菌的結(jié)構(gòu)2021/7/265*細胞壁結(jié)構(gòu)特點：堅韌且有彈性細胞壁有哪些功能？ 固定細胞外形； 保護細胞免受外力的損傷； 阻攔大分子物質(zhì)進人細胞； 使細胞具有致病性及對噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細胞壁中含毒素2021/7/266芽孢 有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌.2021

3、/7/267菌落：單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。2021/7/268菌落細菌的菌落特征因種而異 2021/7/269放線菌1、結(jié)構(gòu)：單細胞原核分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）2021/7/2610鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素 微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生的 應(yīng)用:2021/7/2611病毒的結(jié)構(gòu)2021/7/2612病毒 2021/7/2613SARS病毒、 禽流感病毒2021/7/2614朊病毒（蛋白質(zhì)病毒）2021/7/26152、病毒的增殖：2

4、021/7/2616真菌2021/7/2617如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)酵母菌和霉菌青霉2021/7/2618生殖直立菌絲 營養(yǎng)菌絲腐生生活孢子生殖2021/7/2619細菌的營養(yǎng)類型 根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同，將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌（autotroph）異養(yǎng)菌（heterotroph）腐生菌寄生菌 大部分病原菌2021/7/26202021/7/2621 了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進行無菌技術(shù)的操作，進行微生物的培養(yǎng)。 一、課題目標： 掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點和難

5、點：三、技能目標：2021/7/2622一、基礎(chǔ)知識：（一）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等。（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途2021/7/2623 2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方 (參考教材附錄內(nèi)容) 3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、 無機鹽、等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細菌生長必需，

6、而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。 2021/7/2624選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細胞2021/7/2625 根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含

7、量相對固定;成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。 合成培養(yǎng)基:2021/7/2626 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限;成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;天然培養(yǎng)基：2021/7/2627血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子； 激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分 人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。2021/7/2628液體培養(yǎng)基：表面生長均

8、勻混濁生長沉淀生長2021/7/2629固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔2021/7/2630半固體培養(yǎng)基：無動力 有動力(彌散)(是否運動) 2021/7/26314.培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基：純化，增菌半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種2021/7/2632（二）無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念 無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。 2021/7/2633（）消毒定義：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的

9、過程。區(qū)分為高程度消毒（High-level Disinfection）、中程度消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Low-level Disinfection）三種方式。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別 2021/7/2634（2）滅菌的定義：以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達到完全無菌之過程。 滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。2021/7/26351、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75

10、%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法2021/7/26361、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 下維持15-30min.(2)滅菌的方法：2021/7/2637 最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空

11、氣中的其他微生物不能通過。 而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計的。 2021/7/2638分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學(xué)法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復(fù)配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外的致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無菌技術(shù)2021/7/26393.微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存2021/7/26401.無菌技術(shù)

12、除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實驗操作者的雙手 答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考2021/7/2641三、實驗操作 1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）2021/7/26421計算、稱量2溶化3調(diào)pH：pH764過濾：這一步可以省去。5分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積

13、的一半為宜。6加塞7包扎操作步驟2021/7/2643 8滅菌: 將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160170 下滅菌2h。 9倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種. 10無菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。2021/7/2644倒平板技術(shù)2021/7/2645 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平板。你

14、用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論 答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。2021/7/26463.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因

15、此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。2021/7/26472、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法 平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)2021/7/26482021/7/26492021/7/2650問題討論 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束

16、后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。2021/7/2651 2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。2021/7/26522

17、021/7/26532021/7/2654問題討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？ 應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。2021/7/2655微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)2021/7/2656微生物的恒溫培養(yǎng)2021/7/2657菌種的保存 1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法2021/7/2658四、課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中

18、保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 （三）是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。2021/7/2659本課題知識小結(jié):2021/7/2660【典例解析】 例1關(guān)微生物營養(yǎng)物

19、質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽 D.無機氮源也能提供能量 解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源