抗原致敏樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CIK對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷作用的研究

1、抗原致敏樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CIK對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷作用的研究胡廷輝應(yīng)敏剛鄭秋紅龔福生謝云青樹突狀細(xì)胞dendritiell，D是成效最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，是機(jī)體T淋巴細(xì)胞特異免疫應(yīng)答的直接啟動(dòng)和調(diào)控者，在機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著緊張作用。在體外造就D并用腫瘤抗原致敏后，攜帶腫瘤抗原信息的D，在體表里激活針對(duì)該腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷細(xì)胞。本試驗(yàn)在體外用人胃癌細(xì)胞SG提取腫瘤抗原致敏D后誘導(dǎo)IK，通過其對(duì)SG的殺傷作用的研究為D治療胃癌的研究提供理論及試驗(yàn)根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1重要試劑SG由福建省腫瘤病院分子生物學(xué)研究室提供；rhIL?鄄2、rhIL?鄄4、D3Ab購(gòu)自Peprteh公司；rhG?鄄SF

2、、Fill淋巴細(xì)胞分散液購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；胎牛血清(超等)購(gòu)自杭州四序青生物成品公司；人AB血清由福建省血液中央提供；1640造就基購(gòu)自Gib公司；FIT標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的小鼠抗人D83、HLA?鄄DR、D14、D86及同亞型比擬抗體購(gòu)于晶美生物工程。1.2要領(lǐng)SG在52、37條件下，用含有10胎牛血清RPI1640造就液通例造就。將造就貼壁腫瘤細(xì)胞用胰酶消化懸浮，離心棄上清，用無血清RPI1640造就液重懸，超聲破膜，30000r/in超速離心90in，取上清。濃縮透析，調(diào)解卵白濃度為25g/l，經(jīng)0.22濾膜濾過除菌，80保存。無菌條件下網(wǎng)羅的正凡人抗凝外全面血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分散液梯度離心，獵

3、取單個(gè)核細(xì)胞，用含10%AB血清的RPI1640懸浮細(xì)胞，調(diào)解細(xì)胞濃度至5107/l，加1l至6孔板內(nèi)造就箱中造就2h，吸掉上清，用造就液洗去非黏附細(xì)胞，得到貼壁細(xì)胞，每孔再參加3l含有rhIL?鄄4500U/l及rhG?鄄SF500g/l的10%AB血清的RPI1640造就液，23d半量換液1次。將上述造就5d的D用含有rhIL?鄄4500U/l及rhG?鄄SF500g/l的10%AB血清的RPI1640造就液調(diào)解細(xì)胞濃度為1106/l，向6孔板內(nèi)參加2l的細(xì)胞，每孔參加腫瘤細(xì)胞總卵白1l25g，于第8d網(wǎng)絡(luò)懸浮細(xì)胞為抗原致敏的D。比擬組參加無血清RPI1640造就液1l，于第8d網(wǎng)絡(luò)懸浮細(xì)

4、胞為空缺的D。別離網(wǎng)絡(luò)第1d、第5d及第8d抗原致敏的D，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)D外貌分子HLA?鄄DR、D83、D86、D14表達(dá)。同前法從外周血中獵取單個(gè)核細(xì)胞，用含10%AB血清的RPI1640懸浮細(xì)胞，37、5%2造就箱中造就2h，取懸浮細(xì)胞，調(diào)解細(xì)胞數(shù)為1106/l，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液造就，23d半量換液1次至第8d。試驗(yàn)組用將其別離與空缺的D及抗原致敏的D按10：1比例相混，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液在6孔板內(nèi)造就。比擬組僅用含有IL?鄄2(25

5、0U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液在6孔板內(nèi)造就。5d后別離獵取抗原致敏D誘導(dǎo)IK，空缺的D誘導(dǎo)IK及IK為效應(yīng)細(xì)胞。試驗(yàn)組網(wǎng)絡(luò)成熟經(jīng)抗原致敏及空缺的D，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)10%AB血清的RPI1640調(diào)解細(xì)胞數(shù)為1106/l。網(wǎng)絡(luò)同時(shí)期造就的TK用同樣的造就液調(diào)解細(xì)胞數(shù)為1107/l。將100lIK別離與100l經(jīng)抗原致敏及空缺的D在96孔造就板中混淆造就。比擬組100lIK參加100l含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab50g/L10%AB血清的RPI1640繼承造就。72h后參加四甲基偶氮唑藍(lán)TT10g，繼承

6、造就4h，離心棄去孔內(nèi)上清，每孔參加150l二甲基亞砜DS震蕩10in，待結(jié)晶物充實(shí)溶解，用酶標(biāo)儀在570n處測(cè)D值A(chǔ)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值按下式盤算：刺激指數(shù)SI=A實(shí)行孔/A比擬孔100用TT比色法測(cè)定抗原致敏D誘導(dǎo)IK，空缺的D誘導(dǎo)IK及IK對(duì)SG細(xì)胞的殺傷活性，效靶比為5：1、10：1、20：1。調(diào)解細(xì)胞至所需濃度，各取100l的效靶細(xì)胞懸液參加96孔板中，于37、5%2造就箱中造就24h后，參加四甲基偶氮唑藍(lán)TT10g，繼承造就4h，離心棄上清，每孔參加150l二甲基亞砜DS震蕩10in，待結(jié)晶物充實(shí)溶解，用酶標(biāo)儀在570n處測(cè)D值，同時(shí)設(shè)空缺比擬、靶細(xì)胞比擬、效應(yīng)細(xì)胞比擬。每孔設(shè)

7、3個(gè)復(fù)孔，取其均值按下式盤算：IK細(xì)胞毒性1A效+靶A效/A靶100%1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)要領(lǐng)接納SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)舉行析因闡發(fā)及t查驗(yàn)。2效果2.1D形態(tài)學(xué)的不雅察從外周血得到單個(gè)核細(xì)胞，造就2h，得到貼壁細(xì)胞，多為體積孝圓形的單個(gè)核細(xì)胞。5d時(shí)可見細(xì)胞舒展體積變大，外形不規(guī)矩，部門細(xì)胞懸福經(jīng)抗原致敏后第8d時(shí)可見大部門細(xì)胞懸浮，變大并伸出偽足，細(xì)胞內(nèi)可見大量的顆粒，倒置相差顯微鏡下可見毛刺狀突起，為典范D形態(tài)。2.2抗原負(fù)載前后D表型的變革用流式細(xì)胞儀檢測(cè)D外貌分子HLA?鄄DR的表達(dá)第1d為5.01、第5d為28.21、第8d為62.01。D83別離為1.03、4.50、15.57。D8

8、6別離為4.47、25.75、41.03。D14別離為13.02、3.26、0.55。2.3混淆淋巴細(xì)胞反響2.4細(xì)胞殺傷試驗(yàn)用TT比色法測(cè)定抗原致敏D誘導(dǎo)IK抗原?鄄D?鄄IK，空缺的D誘導(dǎo)IK空缺?鄄D?鄄IK及IK對(duì)SG細(xì)胞的殺傷活性表1。析因闡發(fā)效果表現(xiàn)：差異因素誘導(dǎo)IK對(duì)胃癌細(xì)胞SG殺傷作用差異，抗原致敏D誘導(dǎo)IK對(duì)該腫瘤細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)P0.01，提示抗原致敏D誘導(dǎo)IK對(duì)該腫瘤細(xì)胞有特異性的殺傷作用。差異效靶比之間殺傷作用差異P0.01，效果比力表現(xiàn)效靶比越高，殺傷作用越強(qiáng)。IK與效靶比之間有交互作用，此中抗原致敏D誘導(dǎo)IK在效靶比為20：1時(shí)殺傷作用較別的各組強(qiáng)。但空缺的D誘導(dǎo)I

9、K與IK兩組之間闡發(fā)效果表現(xiàn)兩組殺傷作用差異有無明顯性意義P0.05，提示空缺的D誘導(dǎo)IK對(duì)SG無特異性殺傷作用。結(jié)合混淆淋巴細(xì)胞反響效果提示，抗原致敏D誘導(dǎo)IK可通過激活對(duì)該腫瘤有特異性殺傷作用的淋巴細(xì)胞及促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖兩方面可明顯性進(jìn)步IK對(duì)腫瘤的細(xì)胞殺傷作用。3討論D在體外的致敏與其在體內(nèi)發(fā)育歷程相似，履歷未成熟與成熟兩個(gè)階段。未成熟D泉源于外周血或骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)IL?鄄4及G?鄄SF誘導(dǎo)形成3。本研究亦用此要領(lǐng)得到D。體外誘導(dǎo)D成熟有抗原負(fù)載、細(xì)胞因子和佐劑刺激等要領(lǐng)。本研究從人胃癌細(xì)胞系SG經(jīng)超聲破膜獵取含有多種腫瘤抗原的腫瘤總卵白，用其致敏D，顯微鏡下可不雅察到致敏的D細(xì)

10、胞呈典范成熟D的形態(tài)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)D外貌分子效果表現(xiàn),接納SG抗原負(fù)載的D，代表D成熟的外貌分子HLA?鄄DR、D83、D86升高，代表單個(gè)核細(xì)胞外貌分子D14落落，說明經(jīng)SG腫瘤細(xì)胞抗原負(fù)載可誘導(dǎo)D成熟。腫瘤細(xì)胞總卵白中包羅有富厚的膜抗原、H類和類抗原表位、多種熱休克卵白分子等身分，顛末D的攝娶加工和呈遞后，可引發(fā)針對(duì)多種腫瘤抗原簇的克隆4；可誘導(dǎo)針對(duì)該抗原的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮有用的抗腫瘤免疫效應(yīng)5。IK細(xì)胞除了具有NK細(xì)胞非H限定的殺瘤作用，還具有T細(xì)胞的抗瘤作用。因此用抗原致敏的D誘導(dǎo)IK細(xì)胞，與未經(jīng)抗原致敏的D誘導(dǎo)IK細(xì)胞及IK細(xì)胞比擬，對(duì)雷同抗原靶細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作

11、用。本研究中TT試驗(yàn)的效果證明經(jīng)抗原致敏的D誘導(dǎo)IK細(xì)胞的殺瘤作用較未經(jīng)抗原致敏的D誘導(dǎo)IK細(xì)胞及IK細(xì)胞殺瘤作用強(qiáng)。虞積仁等6也證明，抗原致敏的D誘導(dǎo)細(xì)胞僅對(duì)帶有雷同抗原的靶細(xì)胞有特異性殺傷。而空缺D誘導(dǎo)IK細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)IK缺乏特異性，兩者之間殺傷試驗(yàn)無顯著差異。張宏文等7研究亦創(chuàng)造同樣效果?；煜馨图?xì)胞反響效果表現(xiàn)D與IK混淆造就72h后，視野中D細(xì)胞消散與成熟D在完成抗原呈遞后凋亡有關(guān)8。空缺的D與抗原致敏的D，兩者均能顯著促進(jìn)IK增殖，但兩者之間差異無明顯性意義，張嵩等9亦有雷同的報(bào)道。說明成熟D促進(jìn)IK增殖與有無抗原負(fù)載無關(guān)，大概與成熟D高表達(dá)種種黏附分子與IK外貌的受體結(jié)合促

12、進(jìn)IK細(xì)胞的增殖有關(guān)。本研究通過對(duì)人腫瘤細(xì)胞系SG提取腫瘤抗原致敏D誘導(dǎo)IK殺傷成效的試驗(yàn)研究，證明抗原致敏D誘導(dǎo)IK可通過誘導(dǎo)特異性IK細(xì)胞及促進(jìn)IK細(xì)胞增殖兩方面明顯進(jìn)步IK細(xì)胞的殺瘤效應(yīng)，為進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)研究提供試驗(yàn)根據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1鄭秋紅,鄭天榮,盧林,等.人外周血樹突細(xì)胞的分散與提純J.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,34(2):115118.2鄭秋紅,鄭天榮,謝云青,等.樹突狀細(xì)胞對(duì)自體IK細(xì)胞體外殺傷肺腺癌細(xì)胞影響的研究J.腫瘤防治雜志,2022,12(16):384-387.3rseE,ZhuLJ,TedderTF,etal.Generatinfdendritellsinvit

13、rfrperipheralbldnnulearellsithgranulyte?鄄arphage?鄄lny?鄄stiulatinfatr,interlekin?鄄4,andturnersisfatr?鄄alphafruseinaneriuntherapyJ.AnnSurg,1997,266(1):6-16.4古濤,朱一蓓,李敏,等.腫瘤細(xì)胞凍融裂解物上清對(duì)凋亡細(xì)胞負(fù)載的樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性的作用研究J.中國(guó)病理生理雜志,2022,19(3):301-305.5VuillierF,aluK,ThasEK,etal.Iditype?鄄pulseddendritiellsareabletindueantigen?鄄speifiTL?鄄ediatedprtetiveturiunityJ.BrJHaeatl,2022,120(2):243-250.6虞積仁,石永進(jìn),岑溪南,等.細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞與抗原特異性細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞殺傷腫瘤效應(yīng)比力的實(shí)行研究J.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2022,35(2):141-142.7張宏文,彭曉,張曉燕.