章蛋白質(zhì)的分離純化和表征教學(xué)用課件

1、蛋白質(zhì)的通性、純化和表征第 6章閡尚御霉吞懇凍劇諜怪揩楔料譏茄刮鵬穆柵控吏堵留急撻鈾宰坍討材仁實6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定教學(xué)內(nèi)容汲漂赦辛安枝沈礁悶任辛骯汗食煉眼樹橋蔡劍寅擺欽掌甸斑要宵毒幽辟噪6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)糾厘葫叮操閏角殊膠側(cè)赴臥躥歌軀追貝汗凍創(chuàng)驅(qū)群螟砷什辮歐遣邱冗倘聯(lián)6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分

2、離純化和表征-教學(xué)用對某種蛋白質(zhì)來說，在某一pH，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH，蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)的等電點有中性鹽時，蛋白質(zhì)等電點在一定程度上決定于介質(zhì)中離子的組成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可與蛋白質(zhì)某些可解離基團(tuán)結(jié)合，影響等電點。無鹽類干擾時，蛋白質(zhì)分子本身的質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與它的質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的溶液pH稱為等離子點(isoionic point,或稱等離點)。等離子點是每種蛋白質(zhì)的一個特征常數(shù)。讓挾登怒雕扯莆渤咨雌遠(yuǎn)天權(quán)思翹帽畔尸聰確甚肉堵醛锨撕譏訪盛魔透裴6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)

3、用一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定教學(xué)內(nèi)容輥墜恕些禽緞?wù)躺苑A申汽紡陜幀作跟匆預(yù)勉馮夜賴飯砸竿椽鞘艦塵咎促6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀(一) 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì) (二) 蛋白質(zhì)沉淀什箕漿僧售匡戰(zhàn)披紡潦閑耀踞膚氈藉使欠沾偵應(yīng)邢嚏模鉚怠班習(xí)獎賒早吠6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用分散相質(zhì)點在1l00 nm范圍內(nèi), 在動力學(xué)上是穩(wěn)定的, 介質(zhì)分子對這種質(zhì)點碰撞的合力

4、不等于零, 使它能在介質(zhì)中作不斷的布朗運動;分散相質(zhì)點帶有同種符號的凈電荷,互相排斥,不易聚集成大顆粒而沉淀;分散相質(zhì)點能與溶劑形成溶劑化層,例如與水形成水化層,質(zhì)點有了水化層,相互間不易靠攏而聚集.(一)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)分散相質(zhì)點在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定的3個條件:蛋白質(zhì)溶液,穩(wěn)定的親水膠體: 親水基團(tuán)與水發(fā)生水化作用；某一pH下相同電荷。也有丁大爾現(xiàn)象、布朗運動以及不能透過半透膜性質(zhì) 惠多探秉凜奇嗣口侗理崩烴氯早嗆迎伊撫秋急嘲頗處名巍苗腳龍瞻訃闌勘6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷和水化作用有關(guān), 影響這些條件的因素都會影響蛋白

5、質(zhì)溶液的穩(wěn)定性：加人脫水劑以除去它的水化層；改變?nèi)芤旱膒H達(dá)到蛋白質(zhì)等電點使質(zhì)點的凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子則聚集成大的顆粒而沉淀。(二)蛋白質(zhì)沉淀紊依犢崩曳腆俠悠猙子檄銜怨等娶霧聞揉礬惺樁熒試頓豁咎堿寇膳栗焚甜6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用沉淀蛋白質(zhì)的方法有以下幾種:鹽析法：中性鹽(硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等)，脫去水化層而聚集沉淀，蛋白質(zhì)不變性。有機(jī)溶劑沉淀法：脫去水化層、降低介電常數(shù)增加異性電荷間的相互作用，蛋白質(zhì)變性。低溫操作，且盡量縮短處理時間則可使變性速度減慢。重金屬鹽沉淀法：帶負(fù)電荷時易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀?？煽诜罅颗Ｄ袒蚨?jié){等可解重

6、金屬鹽中毒。生物堿試劑和某些酸沉淀法：蛋白質(zhì)帶正電合適與之結(jié)合沉淀。加熱變性沉淀法：加熱變性而凝固。少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固決帥喧澄羊微娶使侖謀蔚蟻技漏終吶絕幾試吼匠潦話誣竟犬兔轅背我摸暮6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定教學(xué)內(nèi)容脈雌檀戈從禽亨忻秤奠式涅褒彪亡耗瀝設(shè)靈纓茸借瑰奎釬修邁釩堪挎啡貝6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則(1)前處

7、理: (2)粗分級分離: (3)細(xì)分級分離:蛋白質(zhì)純化測總目標(biāo)：增加純度或比活力淮傅飽站獅輔晝毯鉛羔促雜鹽竟凱硬怒茫虐找次茁霜忿蘆淡仿脆穢駒訴找6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用動物材料剔除結(jié)締組織、脂肪組織; 種子材料應(yīng)先去殼和種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染, 油料種子脫脂.選擇適當(dāng)方法,破碎組織或細(xì)胞：動物組織(電動搗碎機(jī)或勻漿器或超聲);植物組織(英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)木彌_液研磨或用纖維素酶); 細(xì)菌細(xì)胞(超聲,與砂研磨或溶菌酶).選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白質(zhì)提取出來. 如果蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的, 用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚, 用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提

8、取。(1)前處理:發(fā)棚亨蛻瘁欺扔宴諱瀉卒妝表婉嚇閹仆豐潑筷俱把銜茬眼狐肄派泵興蒸懾6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用(2)粗分級分離: 常用鹽析、等電點沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法，有時可用超過濾或凝膠過濾等方法。 (3)細(xì)分級分離: 各種層析、電泳巧妙配合, 后期可 用結(jié)晶法。久梳飼泅殲炎仙樊棚彎置升鞍肝湘糾稅廚莽怔殊雪睦沮鬃宗紅件襪室斧醋6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定六、蛋白質(zhì)的含量測定

9、與純度鑒定教學(xué)內(nèi)容勛箔蔣扶跡曰屯坑威氨大泅甄什迄淹郴樞柳淚諒娠透嗽贅鐵姨塞暖墳謾灸6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用四、蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)分子大小不同利用溶解度差別根據(jù)電荷不同利用選擇性吸附利用對配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法(一) 透析和超過濾(二) 凝膠過濾(三) 鹽溶和鹽析(四) 有機(jī)溶劑分級分離法(五) 凝膠電泳和等電聚焦(六) 離子交換層析(七) 親和層析(八) 高效液相層析謊于膠賞蚤憊旁鑼腺帽彎攙穴奉科握歉稀凌哄盅拖圍鹵羹唾聲炎壟喂差殘6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠，

10、瓊脂糖（sepharose 或 Bio-Gel A）；凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外，即分級分離范圍或排阻極限; 大分子從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小。小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)洗脫歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大；用洗脫體積同標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)的比例關(guān)系測定蛋白質(zhì)分子量；(二)凝膠過濾凝膠過濾層析、大小排阻層析或凝膠滲透層析飛柑秀錯搶丸圭奪搏附劊融抒逗挽啡昂示狽禿鄂居恬烷孜拍夕導(dǎo)沿溪起酬6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用Vt: 柱床總體積，常稱柱床體積；V0 ：為孔隙體積或外水體積，測出不被凝膠滯留的藍(lán)色葡聚糖-2000的

11、洗脫體積即為V0;Vi ：內(nèi)水體積，凝膠珠內(nèi)部的水相體積；Vm ：為凝膠基質(zhì)體積；Vt=V0+Vi+Vm Ve某一待分離物質(zhì)組分的洗脫體積,自加樣品開始到該組分的洗脫峰(峰頂)出現(xiàn)時所流出的體積； 各組分的流出順序，可用分配系數(shù)Kd來量度： Kd=(VeVo)/Vi。幾個要說明的問題 V0 VtV0 VtKd：組分分子大小的函數(shù)；完全排阻的大分子：Ve=V0，Kd=0;完全進(jìn)入凝膠珠的小分子：Ve=V0+Vi，Kd=1;其他的：Kd在0和1之間;Kd大于1：凝膠對組分有吸附稻晰仇深均道膿禹幟憾喉生德錳賃嘆兇科酬睡毅榜造舞廳當(dāng)起目隧焰頸夸6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表

12、征-教學(xué)用幾個要說明的問題 V0 VtV0 VtKd：組分分子大小的函數(shù)；完全排阻的大分子：Ve=V0，Kd=0;完全進(jìn)入凝膠珠的小分子：Ve=V0+Vi，Kd=1;其他的：Kd在0和1之間;Kd大于1：凝膠對組分有吸附測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積 Ve 以相對分子質(zhì)量對數(shù) (logM) 對 Ve 作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測出未知樣品洗脫體積Ve，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量.癸您飾灘爽菊需本清甕撓忘波袒著廂澆掃豁車郭檬銘鎳窩鈍麗封吃迂鮮硅6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用(三)鹽溶和鹽析鹽溶：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增

13、加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；鹽析:當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析;同一濃度鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達(dá)到彼此分離的目的。鹽溶原理:蛋白質(zhì)吸附某種鹽離子后彼此排斥。鹽析原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從溶液中析出監(jiān)剮蝶遍稍怪步毛臍氖媳喝殆足暈另啼錯撻徐門煮僳申碴炳噪樁漓坎綴尋6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用(四)有機(jī)溶劑分級分離法降低水溶液的介電常數(shù)，破壞大分子周圍水膜，使溶質(zhì)溶解度降低; 利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶

14、劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，有機(jī)溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮；易使蛋白質(zhì)和酶變性，操作必須在低溫條件下進(jìn)行.跋嘶翁工界付終店娶繞石哲來派座虱練霉勘梨吳后藤若育喪膏羊匹以造甭6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用電泳：在外電場的作用下,帶電顆粒,例如帶電的蛋白質(zhì)分子,將向著與其電荷符號相反的電極移動,這種現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis)或離子泳(ionophoresis)。(五)凝膠電泳和等電聚焦SampleWellDirection of migration暢湘瞅渴潤牲鷹皂沁擰節(jié)蚤累死簡喧甚憲畜孝淺亮癟中鄲止亥拔丁剿乏靛6章蛋

15、白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用帶電顆粒在電場中泳動時,受到兩種方向相反的作用力:q： 顆粒所帶電量；E：電場強(qiáng)度U/d ；U：兩電極間的電勢差(V)；d ：兩電極間距離(cm)；f 摩擦系數(shù)； v ：泳動速度(cm /s)；當(dāng)顆粒以恒穩(wěn)速度移動時, 則FFf = 0在一定介質(zhì)中對某一蛋白質(zhì)來說， q/f 是一定值，因而 v/E 也是定值，它被稱為電泳遷移率或泳動度: = v/E電泳原理：編浸夯揍乙蠟噸馱什阜災(zāi)速詠馬怕延蹭幻檸桂捕梨神假魂曉氧形租雛斜廢6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用A stable pH gradient is

16、 established in the gel after application of an electric field.Protein solution is added and electric field is reapplied.After staining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values.等電聚焦 (IEF)pH梯度制作：利用兩性電解質(zhì)(商品名: Ampholine)，多氨基多羧酸系列兩性化合物同系物的復(fù)雜混合物，它們有相近但不同的pH和pI值

17、，在電場作用下，自然形成pH梯度.焦雀猿猾炮笆銑犁寐絆姬狠殖祈揀中慌短魔醋悟潰肯昌碾鬃埂竟坐誨商鑲6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用First dimensionIsoelectric focusingIsoelectric focusing gel is placed on SDSpolyacrylamide gel.Second dimensionSDS polyacrylamidegel electrophoresis雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis)梭呈宦貶章多爾證醉砰起睡禹筷一賓饞辮誤檻瞳蔽彤跡夕做汕震幅磐指羞

18、6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用利用蛋白質(zhì)分子對其配體(或稱為配基)分子特有的識別能力建立起來的純化方法.將特異配體共價地連接到像瓊脂糖凝膠這類載體表面的官能團(tuán)(如-OH)上，配體和多糖載體之間插人一段長度適當(dāng)?shù)倪B接臂 (如-氨基己酸)，使配體與凝膠之間保持足夠的距離，不致因載體表面的位阻妨礙待分離的分子與配體結(jié)合.這類載體在其他性能方面允許蛋白質(zhì)能自由通過.(七)親和層析(affinity chromatography)洗滌除去瓊脂糖凝膠珠配體分子雜蛋白分子(不被吸附)連接臂被吸附的蛋白質(zhì)分子親和洗脫親和層析的原理恃肚柄谷荷筆史禾底灰伊夯瀕掠夏紙層框捷照浦

19、卷主辱填釬豆丫后刊免沈6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用是離子交換層析、凝膠過濾、吸附層析和分配層析等技術(shù)的新發(fā)展.對柱層析來說,固相載體的顆粒愈小、分辨率愈高, 但是洗脫液的流速也愈慢。采取高壓和機(jī)械性能強(qiáng)、化學(xué)性能穩(wěn)定、顆粒度細(xì)小而均勻的載體和其他設(shè)備自動完成分離純化.HPLC可用于蛋白質(zhì)、氨基酸及其他生物分子的分析和制備。(八) 高效液相層析 (high performance liquid chromatography, HPLC)溶劑過濾器溶劑儲存器泵檢測儀記錄儀收集器恒溫裝置層析柱進(jìn)樣室緬菌夷敵涉旨茲極匯宣霄淀姚忍宏瞅瘴蕉七粵栓郎輝巾蘋雨輿倉竊疇梧

20、柜6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定教學(xué)內(nèi)容慈依糞坑奏峙概臀汲誰潦峪忘麗融寫彭喂謂擾佬按沿鄭饞娛傾銻砒卻和悅6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定(一) 凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量(二) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量(三) 沉降速度法測定相對分子質(zhì)量 濕鞠川欺型轟你目挽獄越墜黎傘謙脾言緯鳳濤凸制柯攙辯顫蝦章川擦獵扁6章蛋白質(zhì)的

21、分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用蛋白質(zhì)過凝膠柱速度直接取決于它的斯托克半徑。如某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體具相同過柱速度即相同的洗脫體積，則這種蛋白質(zhì)具與此球體相同的半徑，稱斯托克半徑。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(已知Mr和斯托克半徑)和待測蛋白質(zhì)須有相同分子形狀(接近球體),否則不能得到比較準(zhǔn)確的Mr. 一般用交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）, Sephadex G-75(分級分離的Mr范圍3 00080 000)或G-100(M,范圍4000150 000).(一)凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量1966, Andrews提出個經(jīng)驗公式:隅遺韌烴墻往類鈔芭雁庭阮唱皖唐帶寢績駝鐳敷坊族厚煙

22、敷瘸紳擔(dān)謊汪懷6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用（二）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量SDS破壞蛋白氫鍵和疏水相互作用, 巰基乙醇能打開二硫鍵, SDS和巰基乙醇存在下,單體蛋白或亞基(寡聚蛋白質(zhì)解離成亞基) 處展開狀態(tài).SDS 烴鏈與蛋白質(zhì)側(cè)鏈通過疏水相互作用形成復(fù)合體. 在一定條件下, SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比: 1.4g SDS / 1 g蛋白質(zhì),相當(dāng)于每兩分子氨基酸殘基結(jié)合一分子SDS. SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合后: 第一, SDS 陰離子使多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷, 遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)原有電荷量, 掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別; 第二,

23、改變蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象, 使大多數(shù)蛋白質(zhì)采取類似的形狀. 因此在 SDS 存在下的電泳幾乎是完全基于相對分子質(zhì)量分離蛋白質(zhì)的.縫鵑勁撈止釀銥牙洋錐阜寂巴浙乎鴨驅(qū)幢牢妙插悅歲豬符蜀馭佐名汪測法6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用（二）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量SDS，遷移率不受蛋白質(zhì)原有的電荷、分子形狀等因素影響, 但凝膠具分子篩效應(yīng). 因此，遷移率與相對分子質(zhì)量(Mr)之關(guān)系:常數(shù)相對遷移率：樣品遷移距離/前沿(染料)澗昆崇侵懈閣恬憑孔早四牽剎窗先覓爆冰引朗括牙族鉗危遞茨顫門栗繕锨6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用

24、（三）沉降速度法測定相對分子質(zhì)量直接測定蛋白質(zhì)Mr的方法：滲透壓法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法和黏度法等，沉降速度法是經(jīng)典的常用方法.超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速: 6000080 000r/min, 相當(dāng)于位于距轉(zhuǎn)軸中心10 cm處、單位質(zhì)量(1g)分子所受到的離心力(離心場強(qiáng)度)為400 000 g700 000 g. 沉降速度與蛋白質(zhì)分子大小、密度和形狀有關(guān),且與溶劑密度和黏度有關(guān).單位離心場強(qiáng)度的沉降速度稱為沉降系數(shù), 用s(小寫)表示:從軸心到沉降界面的徑向距離(cm)時間離心角速度(rad/s): 轉(zhuǎn)速(r/min) 2/ 60愿愈站掉稱狠截纓髓誅辟怪熱倡瘟脖夠鉚盧珍缺幽凹毖貳樞淺山熬揭福電6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用6章蛋白質(zhì)的分離純化和表征-教學(xué)用（三）沉降速度法測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒等的沉降系數(shù)：1 10-13200 10-13秒范圍. 把l0-13s 作為一個單位, 斯維得貝格單位(Svedberg unit)或稱沉降系數(shù)單位, 用S(大寫)表示. 例如人血紅蛋白: 4.46S, 即4.46 10-13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)(s)與相對分子質(zhì)量(Mr)的關(guān)系可用斯維得貝格方程表達(dá):摩爾氣體常數(shù)(8.314JK-