珠海紅樹林海洋真菌代謝物抗腫瘤活篩選課件

1、珠海紅樹林海洋真菌代謝物抗腫瘤活性篩選答 辯 人：吳水平指導(dǎo)老師：蔡小玲 講師中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院第八屆創(chuàng)新化學(xué)實驗與研究基金項目結(jié)題答辯化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院海洋天然有機(jī)物研究室研究背景和意義海洋微生物天然產(chǎn)物是近年來尋找新藥的國際研究熱點，從海洋微生物的天然產(chǎn)物中篩選具有活性的化合物成為先導(dǎo)化合物，具有重大的理論意義和應(yīng)用價值。紅樹林作為海洋與陸地植物圈的接合部，其伴生的微生物類群屬海洋微生物，又具有植物內(nèi)生微生物的特點，這也造就了紅樹林內(nèi)生真菌具有獨特的代謝途徑和遺傳背景，因此對它們的代謝產(chǎn)物進(jìn)行活性物質(zhì)的篩選研究可能會有可喜的發(fā)現(xiàn) 。研究出發(fā)點及創(chuàng)新之處一般抗腫瘤藥物長期使用后腫瘤細(xì)

2、胞會出現(xiàn)對它們的耐藥性，而人拓?fù)洚悩?gòu)酶（hTopo）靶位藥物在臨床上不易出現(xiàn)耐物性。由于細(xì)胞代謝的特異性，分子水平上以hTopo為靶位的體外篩選模型篩選得到的有效樣品進(jìn)入細(xì)胞后可能會被代謝轉(zhuǎn)化成無活性的產(chǎn)物。同時在分子水平和細(xì)胞水平上進(jìn)行抗腫瘤藥物活性篩選，綜合兩者的篩選結(jié)果，會得出更為有效可靠的結(jié)果。實驗思路從珠海紅樹林植物組織及根部泥樣中分離出新的海洋真菌菌株 。通過以人DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶位點的抗腫瘤藥物篩選模型進(jìn)行真菌代謝物抗腫瘤活性初篩 。用 MTT法測試真菌代謝物對受試腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性 。從真菌培養(yǎng)液中獲取中等極性的真菌代謝粗提物確定以人DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶位點的抗腫瘤活性菌株一

3、共分離出紅樹林海洋真菌209株，具體情況見下表。海桑闊苞菊鹵蕨木欖秋茄桐花樹無瓣海桑銀葉樹合計根部泥718420根729119莖163355112348皮257367351葉852833938花1113果85184430合計71920271637623209表1 按樹種、部位分離菌株數(shù)目統(tǒng)計 代謝物對hTopo抑制活性篩選 獲取海洋真菌代謝粗提物終止反應(yīng)，用1瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，genegenius全自動凝膠成像分析系統(tǒng)分析測試結(jié)果 制備超螺旋質(zhì)粒DNA、hTopo在共20L hTopo樣品反應(yīng)體系中，加有4L反應(yīng)緩沖液，0.5g負(fù)超螺旋pBR322、1U的hTopo及0.5L測試樣品

4、。同時做空白對照，陰性對照、陽性對照以及DMSO溶劑對照。37反應(yīng)30分鐘木欖從左到右依次為：ZH45、ZH15、ZH50、ZH51、ZH68、ZH164、ZH58、陰性對照、ZH44、陽性對照、DMSO對照、空白對照鹵蕨從左到右依次為：ZH71、ZH55、ZH30、ZH218、ZH154、ZH11、陰性對照、陽性對照、DMSO對照、空白對照桐花樹從左到右依次為：ZH63、ZH64、ZH93、ZH2、ZH65、ZH97、ZH81、ZH135、ZH208、ZH209、ZH10、ZH14、陰性對照、陽性對照、DMSO對照、空白對照海桑從左到右依次為：陰性對照、陽性對照、DMSO對照、空白對照、ZH

5、116、ZH117、ZH173、ZH61、ZH87、ZH88、ZH91、ZH178、ZH57、ZH4、ZH62、ZH111、ZH222、ZH75闊苞菊從左到右依次為：陰性對照、陽性對照、DMSO對照、空白對照、ZH79、ZH177無瓣海桑從左到右依次為：陰性對照、陽性對照、DMSO對照、空白對照、ZH80、ZH131秋茄從左到右依次為：陰性對照、陽性對照、DMSO對照、空白對照、ZH9、ZH82、ZH83、ZH151銀葉樹從左到右依次為：陰性對照、陽性對照、DMSO對照、空白對照、ZH73、ZH74、ZH228、ZH34、ZH72、ZH182統(tǒng)計結(jié)果篩選出ZH116、ZH178、ZH71、ZH

6、11、ZH154、ZH55、ZH30、ZH15、ZH50、ZH45、ZH44、ZH58、ZH151、ZH93、ZH34、ZH228、ZH74、ZH182和ZH72共19株海洋真菌的代謝物有較強(qiáng)的hTopo抑制作用；另外有ZH61、ZH88、ZH79、ZH218、ZH68、ZH82、ZH83、ZH64、ZH10、ZH135、ZH209、ZH81和ZH164共13株菌的代謝物也對hTopo有一定的抑制活性；剩余22株菌的代謝物要么沒有抑制活性，要么抑制作用太弱。 收集對數(shù)生長期的受試靶細(xì)胞，接種于96 孔板，每孔190L（約1104個細(xì)胞/孔），24小時 后加入不同梯度濃度藥物10L，每一濃度3個

7、重復(fù)孔。同時設(shè)置調(diào)零孔、對照孔。培養(yǎng)68小時后加入MTT 10L（濃度為5mg/mL）。繼續(xù)培養(yǎng) 4小時后棄上清，每孔加入DMSO 100L后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定492nm處吸光度 OD 值， 以藥物濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制抑制曲線。對照組吸光值減少一半時所需的藥物濃度為IC50 濃度。體外腫瘤細(xì)胞毒性實驗（MTT法） 細(xì)胞毒實驗結(jié)果表2 篩選樣品對KBv200的IC50菌株編號IC50（g/mL）菌株編號IC50（g/mL）ZH1127 ZH6812 ZH111205 ZH7111ZH11611ZH7231 ZH11724ZH73456 ZH13115 ZH7422 ZH16425

8、ZH7511ZH3427 ZH79100ZH5161 ZH8022 ZH5538 ZH8142 ZH5723 ZH8211ZH6118 ZH83133 ZH6224 ZH8732 ZH6334 ZH9119 ZH6411ZH9331 ZH6523 表3 篩選樣品對MDA-MB435的IC50（g/mL）菌株編號IC50（g/mL）菌株編號IC50（g/mL）ZH251ZH13511ZH436ZH15111ZH938ZH15411ZH1065ZH17315ZH1427ZH17711ZH1511ZH17849ZH3011ZH18266ZH4411ZH208205ZH4598ZH209201ZH50

9、52ZH21848ZH5811ZH22256ZH8811ZH22811ZH9711一共篩選得16株有強(qiáng)烈腫瘤細(xì)胞毒作用的海洋真菌。19株代謝物對hTopo有較強(qiáng)抑制作用的海洋真菌中，有ZH228、ZH116、ZH151、ZH58、ZH30、ZH44、ZH71、ZH15、ZH154共9株真菌的代謝物能強(qiáng)烈抑制腫瘤細(xì)胞的生長。據(jù)此可以確定這9株真菌的代謝物中含有以hTopo為靶位點的強(qiáng)效抗腫瘤化合物，其中以ZH228、ZH116、ZH151、ZH58四株真菌的作用效果最好，應(yīng)該作為優(yōu)先研究的對象。另外的10株對hTopo有較強(qiáng)抑制作用的海洋真菌盡管在腫瘤細(xì)胞毒試驗也有一定的抑制效果，但不是太強(qiáng)，可

10、能跟其活性化合物的穩(wěn)定性差有關(guān)，進(jìn)入細(xì)胞后被代謝成低活性的化合物，抑制效果也相應(yīng)下降，研究價值不大。 結(jié)論116株具有較強(qiáng)細(xì)胞毒作用的真菌中，除了9株對hTopo有強(qiáng)烈抑制作用外，剩下的7株真菌中，ZH64、ZH82、ZH88、ZH135對hTopo只有一般的抑制作用，但卻能強(qiáng)烈抑制腫瘤細(xì)胞，可能是體外以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶位點的抗腫瘤藥物篩選模型與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有一定差別，此四株菌也有一定的研究前景。最后剩下ZH75、ZH97、ZH177三株菌，沒有hTopo抑制活性，但卻能強(qiáng)烈抑制腫瘤細(xì)胞生長，估計其靶位點另有所在，也可對進(jìn)一步研究，以期發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物的靶點。結(jié)論2hTopo細(xì)胞外篩選方法適于高通量篩選，且篩到的化合物靶位明確，利于