新藥研究中的動物實驗方法課件

1、新藥研究中的動物實驗方法2022/7/272新藥研究從發(fā)現(xiàn)到批準投產(chǎn)上市，從藥學、藥理學、毒理學和臨床醫(yī)學等各方面的系統(tǒng)研究過程安全性、有效性評價藥物臨床前研究應當執(zhí)行有關管理規(guī)定，其中安全性評價研究必須執(zhí)行國家非臨床研究質量管理規(guī)范（GLP）認證從事藥物臨床試驗的醫(yī)療機構須通過國家藥物臨床試驗機構資格認證，必須執(zhí)行藥物臨床試驗質量管理規(guī)范（GCP）2022/7/273新藥研究主要藥效學試驗中的動物實驗方法急性毒性試驗中的動物實驗方法長期毒性試驗中的動物實驗方法安全藥理學試驗中的動物實驗方法生殖毒性試驗中的動物實驗方法致突變試驗中的動物實驗方法致癌試驗中的動物實驗方法刺激性、過敏性和溶血性試驗

2、中的動物實驗方法依賴性試驗中的動物實驗方法2022/7/274第一節(jié) 主要藥效學試驗中的動物實驗方法一、主要藥效學研究方法新藥的主要藥效學作用：應用體內外2種以上實驗方法獲得證明，其中一種須是整體的正常動物或模型動物實驗模型：必須能反映藥理作用本質指標：應能反映主要藥效學作用的藥理本質，客觀可靠，能定量或半定量主要藥效學指標：心肌梗死面積次要藥效學指標：血清酶學指標說明新藥作用特點的指標：凝血、血小板功能提示藥物作用機制的指標2022/7/275第一節(jié) 主要藥效學試驗中的動物實驗方法一、主要藥效學研究方法劑量：應作出量效關系，盡量求出ED50或有效劑量范圍給藥方法：采用擬推薦臨床用的給藥方法，

3、預防性給藥/治療性給藥對照：空白對照組：正常動物對照觀察，與給藥組進行相同處理，檢測試驗方法可靠性，防止假陽性；評價造模是否成功。模型對照組陽性藥物對照組藥物至少3個劑量組，高中低劑量差為2-3的等比級數(shù)。2022/7/276第一節(jié) 主要藥效學試驗中的動物實驗方法一、主要藥效學研究方法陽性對照藥物選擇：已批準上市、公認最有效及作用機制相同或相似的藥品。同一受試藥物在幾個藥效學實驗模型中可采用不同的陽性對照藥物比較新藥的作用特點，作用強度、起效快慢陽性藥必須出陽性結果：驗證所用方法和指標的可靠性、準確性、防止假陰性2022/7/277二、動物選擇及模型建立（一）動物選擇健康、符合實驗動物管理要求

4、的動物；根據(jù)實驗要求選擇不同等級的實驗動物動物的年齡多采用成年動物研究藥物對生長、發(fā)育、內分泌系統(tǒng)作用：幼年動物抗衰老：老年動物或衰老過程較快的專用模型動物動物性別雌雄各半致畸實驗或雌性生殖系統(tǒng)藥物、熱板法實驗：雌性動物男性抗生育藥：雄性動物2022/7/278二、動物選擇及模型建立（一）動物選擇注意種屬異同性盡可能選用與人在生物學上接近，在解剖、生理功能相類似的動物，應選用靶器官高效應實驗動物每組大鼠、豚鼠、家兔等動物一般不得少于8只；犬和猴等大動物可設2個劑量組，每組不得少于6只；以避免個體差異和實驗誤差，以便進行統(tǒng)計學處理2022/7/279藥效學試驗中的動物選擇動物藥效學試驗小鼠腫瘤、

5、室顫、慢支、肝炎、肝硬化、尿崩癥、免疫、計劃生育、鎮(zhèn)痛、抗炎、學習記憶、前列腺增生、性激素、抗瘧藥大鼠腫瘤、高血壓、心梗、慢支、潰瘍、肝炎、肝硬化、放射病、腎上腺、白內障、致畸試驗、營養(yǎng)試驗、抗炎、免疫、糖尿病、燒傷、燙傷、依賴性兔肝癌、心血管病、消化道炎癥、氣管炎、甲狀腺、癲癇、角膜炎、致熱原、動脈硬化豚鼠過敏試驗、肝癌、心梗、肺水腫、肝炎、平喘、抗結核、真菌、組胺試驗、感染犬胰腺炎、高血壓、肝癌、糖尿病、條件反射、消化系統(tǒng)、冠心病、心衰、腦血管病、尿崩癥猴依賴性試驗、疫苗試驗、神經(jīng)生理、行為科學、動脈硬化、致癌、抗瘧藥、繁殖試驗貓肝癌、心律失常、中毒性肝炎、針麻、腦生理、血壓生理、動脈硬化

6、2022/7/2710二、動物選擇及模型建立（二）模型建立動物模型的治療效果與人體使用結果基本相同：抗感染動物模型、小鼠鎮(zhèn)痛模型、豚鼠過敏性哮喘模型無合適的模型：銀屑病、禿發(fā)、紅斑狼瘡、視網(wǎng)膜炎等，可采用間接指標，如改善皮膚微循環(huán)、測量毛發(fā)生長速度、數(shù)量與彈性，測定皮膚膠原蛋白含量及觀察眼結膜的微循環(huán)等不大好建立的模型：癲癇、慢性萎縮性胃炎等。需要多種方法驗證某些疾病模型至今無法建立：神經(jīng)官能癥、精神病、眩暈癥、四肢麻木、幻覺等2022/7/2711二、動物選擇及模型建立（二）模型建立藥效學實驗，至少有一種整體模型；采用多種方法制備動物模型，以評價藥物療效老年癡呆動物模型：膽堿能損傷模型；b淀

7、粉樣蛋白致癡呆模型注意模型損傷程度，嚴重損傷模型難以顯示藥物療效特異性好、能反映藥理作用本質的離體實驗模型亦可蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標本：肌松藥研究果蠅：抗衰老藥物注意整體動物模型與體外模型的藥理反應之間的差別2022/7/2712第二節(jié) 藥物臨床前安全性評價的意義和局限性一、臨床前安全性評價的意義：提供新藥對人類健康危害程度的科學依據(jù)，預測上市新藥對人體健康的有害程度通過藥物毒理學的研究方法和手段來進行觀察和測定化學物質對機體引起的損害，發(fā)病機制以及對機體全身的影響2022/7/2713二、動物毒性試驗評價的局限性實驗動物和人對藥物反應種屬性差異：動物和人共同反應約占一個藥總反應的25%。實驗動物

8、的數(shù)量有限：發(fā)生率低的毒性反應，在少量的動物中的難以發(fā)現(xiàn)實驗動物的反應單一；臨床病人廣泛，對藥物的敏感性各不相同實驗動物與人的生理狀態(tài)差異：某些疾病的存在是發(fā)生某些毒性反應的重要前提試驗劑量與臨床劑量的差異2022/7/2714三、安全性評價的基本要求找出毒性劑量：LD50；長期給藥產(chǎn)生毒性的劑量確保安全劑量范圍：單次或多次給藥的有效范圍發(fā)現(xiàn)毒性反應毒性靶器官的尋找毒性的可逆與否：不可逆損傷，一般不批準上臨床解救措施2022/7/2715第三節(jié) 急性毒性試驗中的動物實驗方法急性毒性試驗（單次給藥毒性試驗）研究動物一次或24h內多次給予受試物后，一定時間內所產(chǎn)生的毒性反應藥物毒理研究的早期階段2

9、022/7/2716急性毒性試驗 作用闡明藥物的毒性作用及其毒性靶器官為長期毒性試驗劑量和藥物期臨床實驗起始劑量的提供劑量依據(jù)提供一些人類藥物過量急性中毒相關的信息2022/7/2717一、主要內容和要求受試物：制備工藝穩(wěn)定、符合臨床試驗用質量標準規(guī)定的樣品；標明名稱、來源、批號、含量、保存條件、配制方法等，自檢報告。所用輔料、溶媒動物：至少采用2種哺乳動物，嚙齒類：大鼠、小鼠非嚙齒類：犬（Beagle犬、雜種犬）、猴根據(jù)實驗特點，確定動物性別、年齡初始體重差異在平均體重20%以內，小鼠（18-22g），犬（9-11kg），猴（3-6kg）實驗動物質量合格證2022/7/2718一、主要內容和

10、要求劑量和分組：應從未見毒性劑量到出現(xiàn)嚴重毒性（危及生命）的劑量設空白和/或溶媒對照組小動物4-6個劑量組，組距0.65-0.85；大動物一般6只犬，采用50%等量遞升法，求出ALD（近似致死劑量）和MTD（最大耐受量）給藥容積：等容積不等濃度給藥，給藥途徑：臨床擬用途徑和一般能使原形藥物較完全進入循環(huán)的途徑；經(jīng)口給藥前動物一般應進行一段時間的禁食不禁水2022/7/2719一、主要內容和要求觀察時間及指標：給藥后，一般連續(xù)觀察至少14天，給藥當天，尤其是4h內嚴密觀察。后每天上下午各一次毒性反應出現(xiàn)時間及其恢復時間一般指標：動物外觀、行為、對刺激的反應、分泌物、排泄物等死亡情況（死亡時間、瀕

11、死前反應）體重變化病理學檢查：大體解剖：體積、顏色、質地組織病理學檢查2022/7/2720二、急性毒性實驗常用方法（一）近似致死劑量法非嚙齒類動物的急性毒性試驗6只健康比格犬（4-6月齡）或猴（2-3歲）估計可能引起毒性和死亡的劑量范圍按50%遞增法，一般設計出含10個左右劑量的劑量序列表；根據(jù)估計，由劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍2022/7/2721（一）近似致死劑量法2022/7/2722（二）最大給藥量法適用于低毒的受試物在藥劑上允許的最大給藥濃度及生理上允許的最大給藥劑量的條件下，以允許的最大劑量單次給藥或24h內多次給藥（劑量24h。觀察期7天2022/7/2724（三）固定

12、劑量法正式試驗：每個劑量至少10只動物，雌雄各半根據(jù)預試結果，在4個劑量中選擇一個可能產(chǎn)生明顯毒性但又不引起死亡的劑量，如預試結果表明，5mg/kg引起死亡，則降低一個劑量檔次進行觀察時間 2周，根據(jù)毒性反應具體特點可適當延長2022/7/2725（三）固定劑量法試驗結果評價劑量（mg/kg）試驗結果存活數(shù)100%100%存活毒性表現(xiàn)明顯100%存活無明顯中毒表現(xiàn)5高毒（LD5025mg/kg）有毒（LD5025-200mg/kg）用50mg/kg試驗50有毒或高毒，用5mg/kg進行試驗有害（LD502000mg.kg用2000mg/kg試驗2000用500mg/kg試驗無嚴重急性中毒的危險

13、性2022/7/2726（四）上下法（階梯法、序貫法）特點：節(jié)省動物；同時進行毒性癥狀的觀察、估算LD50及其可信限，適合能引起動物快速死亡的藥物限度試驗：用于有資料提示受試物毒性可能較小的情況主試驗：用于相關毒性資料很少或沒有時，或預期受試物有毒性時2022/7/2727受試物1只動物受試物給予另外4只動物進行主試驗停止對其他動物給藥對所有動物進行觀察死亡數(shù)3只存活數(shù)3只LD502000mg/kgLD505000mg/kg1只或2只死亡2只存活停止對其他動物給藥，對所有動物進行觀察1只死亡（四）上下法（階梯法、序貫法）限度試驗：5000mg/kg劑量水平的限度試驗3只死亡，LD503只存活，

14、LD505000mg/kg死亡2022/7/2729（四）上下法（階梯法、序貫法）主試驗：特定給藥程序每次給藥1只動物，間隔約48h（取決于毒性出現(xiàn)時間，持續(xù)時間和毒性的嚴重程度）第一只動物劑量低于LD50的最接近的估計值該動物存活，第2只給予高一級劑量該動物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，給予低一級劑量劑量級數(shù)因子：（1/劑量反應曲線斜率估計值） 的反對數(shù)無受試物斜率相關資料時，使用3.2為劑量級數(shù)因子；1.75mg/kg、5.5、17.5、55、175、550、2000（或5000）無受試物致死估計值時，從175開始2022/7/2730（四）上下法（階梯法、序貫法）主試驗決定是否和如何對下一只動物給

15、藥前，每只動物均應認真觀察達48h當滿足停止試驗標準之一后，停止給藥，根據(jù)終止時所有動物的狀態(tài)計算LD50估計值和可信區(qū)停止試驗條件：連續(xù)3只動物存活任意連續(xù)6只動物中有5只連續(xù)發(fā)生存活或死亡轉換第1只動物發(fā)生轉換之后至少有4只動物進行實驗，并且通過計算LD50估算值的范圍超出臨界值（2.5倍）2022/7/2731（五）累積劑量設計法（金字塔法）非嚙齒類動物急性毒性實驗8只動物，對照組+給藥組，雌雄各半劑量設計（mg/kg）1、3、10、30、100、300、1000、300010、20、40、80、160、320、640、1280隔日給予下一個高劑量，劑量逐漸增加，直至出現(xiàn)動物死亡或達到劑

16、量上限位置2022/7/2732（五）累積劑量設計法（金字塔法）無動物死亡時，MLD（最小致死劑量）和LD50大于最高劑量或限制劑量以最高劑量給予動物5-7d某一劑量所有動物死亡，MLD和LD50應在最后兩個劑量之間某一劑量部分動物死亡，并有部分死亡出現(xiàn)在后繼的下一個高劑量，MLD位于首次出現(xiàn)死亡的劑量和前一個低劑量之間，LD50應在首次出現(xiàn)動物死亡的劑量和所有動物均死亡的劑量之間2022/7/2733（六）半數(shù)致死量法預備實驗：先找出100%及0%死亡的劑量，即Dm，Dn取小鼠9-12只，每組3只，按估計量給藥3只小鼠全死，降低劑量全不死，增加劑量確定組數(shù)n，計算各組劑量（按等比級數(shù)排列）r

17、=(dm/dn)1/(n-1)dn=d(n-1)r2022/7/2734（六）半數(shù)致死量法正式實驗：分組：每組10只，雌雄各半，隨機分配給藥：每只動物給藥容量相同觀察記錄：給藥后中毒表現(xiàn)，記錄各組小鼠死亡數(shù)，死亡率。計算LD50及LD50 95%可信限2022/7/2735第四節(jié) 長期毒性試驗中的動物實驗方法長期毒性試驗（重復給藥毒性試驗）反復多次給予動物藥物，觀察藥物對動物的毒性反應，一般指連續(xù)給藥14d以上。目的、意義預測受試物可能引起的臨床不良反應，包括不良反應的性質、程度、劑量-反應關系和時間-反應關系、可逆性等判斷受試物反復給藥的毒性靶器官或靶組織推測臨床試驗的起始劑量和重復用藥的安

18、全劑量范圍提示臨床試驗中需重點監(jiān)測的指標為臨床試驗中的解毒或解救措施提供參考2022/7/2736長期毒性試驗受試藥物：同急毒動物：2種動物，嚙齒類：大鼠（wistar和SD），以6周齡為宜，不宜超過8周齡，試驗周期3個月以上可選5-6周齡大鼠，體重80-120g非嚙齒類：Beagle犬（6-10月齡，體重6-8kg）、猴（生物技術藥物）（3-4歲，3-6kg）、小型豬（皮膚科用藥）盡量選用年幼動物（敏感；觀察對生長發(fā)育的影響）2022/7/2737長期毒性試驗給藥途徑：與臨床用藥途徑一致?？诜汗辔?；混入飼料或飲水靜脈注射（大鼠2個月以上）可用腹腔注射代替臨床上部分給藥途徑在動物上很難或根本

19、無法做到，允許用相關的替代給藥途徑，結合藥動學比較資料。舌下給藥霧化吸入腸溶衣膠囊.2022/7/2738長期毒性試驗分組：低劑量組：尋找動物安全劑量范圍，為臨床劑量設計作參考，一般應高于整體同種動物有效劑量，此劑量下應不出現(xiàn)毒性反應中劑量組：應使動物產(chǎn)生輕微的或中度的毒性反應高劑量組：尋找毒性靶器官、毒性癥狀及搶救措施提供依據(jù)；應使動物產(chǎn)生明顯或嚴重的毒性反應，或個別動物死亡空白對照組：溶劑或其他賦形劑；有毒性時應增加正常對照組大鼠雌雄各10-30只；犬、猴雌雄各3-6只2022/7/2739長期毒性試驗劑量設計方法：根據(jù)急性毒性LD50：大鼠高中低三個劑量分別用1/10、1/50、1/10

20、0 LD50。犬用更小的劑量，多為大鼠的一半劑量根據(jù)最大耐受量（MTD）：大鼠：高、中、低 1、1/3、1/10MTD犬、猴：大鼠劑量的一半，或測定犬單次口服后MTD，再設計劑量2022/7/2740長期毒性試驗劑量設計方法：擬用臨床劑量調整根據(jù)同類型藥物或國外資料的藥物臨床劑量，結合急毒，預測新藥可能用的臨床劑量大鼠犬低劑量3個月10-20倍2-56個月5-102-3中劑量3個月30-5015-306個月15-2515-20高劑量3個月50-10030-506個月30-5015-252022/7/2741長期毒性試驗劑量設計方法：用等效劑量推算：從一種已知動物的有效劑量或毒性劑量或可能用于人

21、的劑量反推到實驗動物的劑量2022/7/2742長期毒性試驗給藥周期：參考擬定臨床療程原則上應每天給藥，給藥期限長（3m）的藥物每周至少給藥6天藥物臨床療程周期長期毒性試驗給藥期限嚙齒類動物非嚙齒類動物2w-1m1-3m1-3m3m3-6m3-6m6m6m9m2022/7/2743長期毒性試驗檢查指標一般觀察：外觀體征、行為活動血液學指標：紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、紅細胞容積、白細胞計數(shù)及分類、血小板計數(shù)、凝血酶原時間等血液生化指標：轉氨酶（AST、ALT）、堿性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、尿素氮、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽紅素、總膽固醇、甘油三酯、谷氨酰轉移酶、K+、Na+、Cl-尿液檢查：pH

22、、尿糖、蛋白、膽紅素、酮體、紅細胞、白細胞心電導聯(lián)：大動物長期毒性2022/7/2744長期毒性試驗檢查指標：參考化學結構、急毒、藥效學、文獻病檢器官系統(tǒng)尸檢臟器系數(shù)：心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢、腦組織學檢查：心、肝、脾、氣管、主動脈、肺、腎、腦（大腦、小腦、腦干）、腎上腺、胰腺、食管、胃、十二指腸、回腸、結腸、膽囊、垂體、前列腺、脊髓、淋巴結、膀胱、甲狀腺、甲狀旁腺、唾液腺、乳腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢、眼和視神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、給藥局部。重要臟器、靶器官、給藥局部及有病理損傷的病理照片2022/7/2745長期毒性試驗檢查指標時間大鼠3個月以內，一般在最后1

23、次給藥后24h和恢復期結束后各進行1次。必要時中間可進行1次大鼠3個月以上，可在試驗中間殺少量動物（高劑量組和對照組）檢測指標犬的長毒應有正常值2次，給藥后1-1.5月測1次，停藥1次，恢復期結束1次。2022/7/2746長期毒性試驗恢復期觀察最后1次給受試物猴24h，每組殺1/2-2/3動物檢測各項指標其余1/3-1/2動物繼續(xù)觀察2-4周，以了解毒性反應的可逆程度和可能出現(xiàn)的延遲性毒性反應。此期間，不給受試物。觀察內容與給藥期間相同2022/7/2747第五節(jié) 安全藥理學試驗中的動物實驗方法安全藥理學（一般藥理學）研究藥物在治療范圍內或治療范圍以上的劑量時，潛在的、不期望出現(xiàn)對生理功能的

24、不良影響，主要觀察藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的影響。根據(jù)受試藥物藥理作用特點，在泌尿系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等方面進行追加和/或補充試驗2022/7/2748安全藥理學目的確定藥物可能關系到人群用藥安全性的非期望性藥理作用評價藥物在毒理學和/或臨床研究中所觀察到的藥物不良反應和/或病理生理作用研究所觀察到和/或推測的藥物不良反應機制2022/7/2749可免做安全藥理學研究的藥物在全身體內血藥濃度低，或其它組織器官分布很少的局部用藥，如皮膚、眼科用藥等。 只用于治療晚期癌癥病人的細胞毒類藥物，在首次用于臨床前可不做一般藥理學研究。但具有新的作用機制的此類藥物例外。2022/7

25、/2750一、動物實驗方法受試物：同藥效學、毒理學研究實驗動物：小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬。小動物每組不少于10只，大動物每組不少于6只。盡量采用清醒動物。如采用麻醉動物，應注意麻醉藥物的選擇和麻醉深度的控制。實驗分組：小鼠：空白對照組、受試藥低中高3個劑量組，溶劑對照組，每組10-20只大鼠：每組10只犬、猴：每組4-6只2022/7/2751一、動物實驗方法給藥劑量：應包括或超過主要藥效學的有效劑量或治療范圍。主要藥效學實驗研究的最大有效劑量的1、2、4倍如缺乏不良反應的結果，最高劑量應設定為相似給藥途徑和給藥時間的其他毒理試驗中產(chǎn)生中等強度不良反應的劑量。給藥途徑：采用單次給藥，與臨床擬用途徑一致。2022/7/2752二、核心組合試驗（一）中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究：定性和定量評價給藥后動物的運動功能、行為改變、協(xié)調功能、感覺/運動反射和體溫的變化，以確定藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響間歇觀察法（去甲麻黃堿）自主活動實驗洞板實驗轉輪疲勞實驗或抓力實驗對戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量的影響體溫測定2022/7/2753二、核心組合試驗（二）心血管系統(tǒng)研究：測量并記錄給藥前后血壓（收縮壓、舒張壓和平均壓）、ECG（QT間期、PR間期、