感染性疾病分子診斷

1、分子(fnz)診斷學(xué) 陳昌杰 共一百零二頁(yè)病因 內(nèi)因和外因兩大類(lèi) 內(nèi)因主要指遺傳因素，如基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)狀況的改變，其中基因結(jié)構(gòu)的改變包括點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性變異、前病毒插入等；而基因表達(dá)狀況改變則包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(chnw)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)量的異常。 外因是指外在的環(huán)境因素，如生活方式、工作環(huán)境、精神狀況和各種感染性病原體的侵入等。共一百零二頁(yè)第十章 感染性疾病的分子診斷 分子診斷（molecular diagnosis）是指通過(guò)檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)異?；蚱浔磉_(dá)異常，對(duì)人體(rnt)的健康狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。 評(píng)估基因的存在和缺陷通常以DNA為材料，而評(píng)估基因的表達(dá)量則以

2、基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的產(chǎn)物RNA/蛋白質(zhì)分析來(lái)評(píng)估個(gè)體的生理/病理狀態(tài)。共一百零二頁(yè)分子診斷(zhndun)技術(shù)主要包括核酸雜交聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基因芯片技術(shù)共一百零二頁(yè) 感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的統(tǒng)稱(chēng) 。 外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體(rnt)后導(dǎo)致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。 內(nèi)源性感染：指由人體(rnt)自身的正常菌群，在人體(rnt)免疫功能下降時(shí)引起的感染，因?yàn)檫@些細(xì)菌必須在一定條件下才能致病，所以又稱(chēng)為條件致病菌或機(jī)會(huì)致病菌，如腸道菌群中的大腸埃希菌、腸球菌等引起的感染多為內(nèi)源性感染。 共一百零二頁(yè)分子診斷對(duì)感染性疾病可用于以下(yxi)幾個(gè)方面

3、： 適用不易培養(yǎng)的； 種屬鑒定； 早期診斷； 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)； 流行病學(xué)調(diào)查； 基因分型； 耐藥檢測(cè)。共一百零二頁(yè)感染性病原體進(jìn)行分子診斷，取決于兩個(gè)條件：一是在該病原體核酸中有特異的核酸序列（感染性病原體本身含有一些保守序列，即使在不同的基因型這些保守序列的變異也很小，因此可以根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)(shj)探針或引物）；二是能夠根據(jù)特異的核酸序列設(shè)計(jì)和制備具有特定信號(hào)的探針或設(shè)計(jì)合成相應(yīng)PCR引物，多數(shù)感染性疾病的病原體都具備上述兩個(gè)條件。 共一百零二頁(yè)診斷策略可以(ky)分為以下兩種：一般性檢出策略完整檢出策略共一百零二頁(yè)一般性檢出策略所提供的感染性病原體的信息量較少，幾乎不提供型別（包括變異株）和

4、耐藥性方面的信息 ，因此，對(duì)于感染感染性疾病分子診斷(zhndun)一般性策略只是快速診斷(zhndun)是何種病原體的感染。共一百零二頁(yè) 為了得到更多的疾病病原體信息，建議應(yīng)該采取完整策略按照診斷(zhndun)分型亞型耐藥性檢測(cè)的思路，利用多種分子診斷(zhndun)手段對(duì)感染性病原體進(jìn)行分析。共一百零二頁(yè)第一節(jié) 病毒的基因檢測(cè) 人類(lèi)許多感染性疾病由病毒引起，如肝炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎、流行性感冒、狂犬病、艾滋病等。根據(jù)病毒的核酸成分，可將其分為(fn wi)脫氧核糖核酸（DNA）病毒和核糖核酸（RNA）病毒兩大類(lèi)。 共一百零二頁(yè)一、乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒（hepatitis B vir

5、us, HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原體之一，屬嗜肝DNA病毒科的原型病毒，病毒毒粒中含內(nèi)源性DNA聚合酶活性。嗜肝病毒科有獨(dú)特的復(fù)制方式，病毒合成以RNA中間體為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄(zhun l)合成DNA鏈，在某些方面，HBV與逆轉(zhuǎn)錄(zhun l)病毒有許多相似性。共一百零二頁(yè) 乙型肝炎病毒( HBV) 感染是一個(gè)嚴(yán)重的全球問(wèn)題, 據(jù)估計(jì)全球大約(dyu)有20 億人曾經(jīng)感染乙肝病毒, 慢性HBV感染者約315 億 4 億人, 每年有50 萬(wàn) 120 萬(wàn)人死于HBV 感染。我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū), 每年約有10% 20%的急性乙肝將轉(zhuǎn)成慢性肝炎, 肝硬化甚至發(fā)展成肝癌,嚴(yán)重威脅著人們的健

6、康, 急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌變的發(fā)生機(jī)制是多年來(lái)肝病研究的重點(diǎn)。共一百零二頁(yè)HBV 感染的病原學(xué)診斷免疫血清學(xué)檢測(cè)HBV 的血清學(xué)標(biāo)志物分子生物學(xué)方法檢測(cè) 免疫學(xué)方法測(cè)定病毒抗體是一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段, 常用的方法是間接ELISA, 目前我國(guó)HBV 檢測(cè)采用的第三代ELISA 試劑由多種病毒抗原組合匹配, 具有較好的靈敏性和特異性, 但其在病毒感染的窗口期不能檢測(cè)到抗體, 這在很大程度上限制了ELISA 檢測(cè)的準(zhǔn)確性, 不能有效的控制(kngzh)病毒的傳播, 因而, 發(fā)展新的診斷HBV 感染主要依賴(lài)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒DNA 的檢測(cè)。共一百零二頁(yè)共一百零二頁(yè)（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)HBV

7、是一種可感染人體、且具有獨(dú)立復(fù)制能力(nngl)的雙鏈DNA病毒，具有以下幾個(gè)特點(diǎn)： 不完全雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)； 利用重疊的開(kāi)放讀碼框架(ORF)可編碼多個(gè)蛋白質(zhì)； 所有調(diào)控序列均位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)； 基因序列具有多變性。HBV基因組是已知可感染人類(lèi)又能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的雙鏈DNA病毒中最小和最高效的。共一百零二頁(yè)HBV基因組具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，是一個(gè)長(zhǎng)約3.2 kb的不完全雙鏈環(huán)狀DNA。雙鏈的長(zhǎng)度不對(duì)稱(chēng)，長(zhǎng)鏈(L)因與病毒mRNA互補(bǔ)，定為負(fù)鏈；短鏈(S)為正鏈，5末端固定，3末端位置(wi zhi)不固定，S正鏈的長(zhǎng)度可為L(zhǎng)負(fù)鏈的50100%，因而在病毒群體中出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的正鏈與全長(zhǎng)的負(fù)鏈匹配，故僅有部

8、分基因組長(zhǎng)度為雙鏈。HBV基因組L鏈上至少有4個(gè)ORF，分別稱(chēng)為S、C、P和X，編碼外膜蛋白、核殼蛋白、聚合酶和X蛋白。多個(gè)ORF重疊的結(jié)果使HBV本身3.2 kb基因組序列的利用率高達(dá)150200%。共一百零二頁(yè)共一百零二頁(yè)（二）分子診斷方法1PCR 2. 支鏈DNA技術(shù) 3. 核酸雜交(zjio) 4. 基因芯片技術(shù) 共一百零二頁(yè)逆向斑點(diǎn)雜交法 原理就是將各種探針固定在基質(zhì)上, 用以檢測(cè)受檢的各種標(biāo)記樣品中與探針互補(bǔ)的核酸(h sun)物質(zhì)的變化。共一百零二頁(yè)FeO/ Au 納米顆粒探針(tn zhn)法 近年來(lái), 通過(guò)納米表面結(jié)合寡核苷酸構(gòu)成納米顆?；蛱结? 用于檢測(cè)靶脫氧核糖核酸。其

9、原理是利用DNA 堿基嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)的特性設(shè)計(jì)的, 主要應(yīng)用于分子的組裝。共一百零二頁(yè) 聚合酶鏈反應(yīng)- 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法 該法利用錯(cuò)配PCR 的原理擴(kuò)增HBV 前C 區(qū)長(zhǎng)194 bp,C 啟動(dòng)子區(qū)長(zhǎng)184 bp 的基因片段, 擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Bsu 361, Bc1I 酶切, 瓊脂糖凝膠電泳, 根據(jù)酶切圖譜多態(tài)性, 建立檢測(cè)HBV 前CA1896, BCPT1762/ A1764雙變異(biny)的方法, 共一百零二頁(yè)乙型肝炎病毒DNA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)HBV 的病毒載量與感染狀態(tài)密切相關(guān), 尋求(xnqi)快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異的定量手段是對(duì)HBV 早期診斷、病程監(jiān)控及流行病學(xué)調(diào)查

10、的需求。共一百零二頁(yè)（三）臨床意義1HBV感染的早期診斷 2. 監(jiān)測(cè)治療效果 3. 判斷病情(bngqng)，指導(dǎo)制訂合理的治療方案 HBV DNA定量檢測(cè)是判斷病毒復(fù)制情況的指標(biāo)。HBV DNA拷貝數(shù)越高，病毒復(fù)制越厲害，傳染性越強(qiáng)，肝臟病理?yè)p害程度越高，肝組織炎癥反應(yīng)越重。 4. 在乙型肝炎病毒耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用 共一百零二頁(yè)HBV DNA 檢測(cè)是乙肝病毒抗病毒治療的有效監(jiān)測(cè)指標(biāo)。乙肝病毒藥物治療后, HBVDNA 含量持續(xù)下降, 然后持續(xù)在低水平, 或低至方法學(xué)能檢出的含量( 測(cè)定下限)以下, 則說(shuō)明治療有效。觀測(cè)抗病毒藥物治療效果不能憑兩三次檢測(cè)結(jié)果來(lái)判斷, 必須多次動(dòng)態(tài)觀察(gunch

11、), 每次檢測(cè)的間隔天數(shù)不宜太短, 一般為兩周以上?？刹捎靡詸z測(cè)次數(shù)為橫坐標(biāo), HBV DNA 量為縱坐標(biāo)作圖的方法來(lái)判斷血清HBV DNA 量的變化趨勢(shì), 進(jìn)而判斷抗病毒治療是否有效。血循環(huán)中HBV DNA 濃度與HBsAg 和HBeAg 有一定的相關(guān), 但其濃度間并不呈正線(xiàn)性相關(guān)。共一百零二頁(yè)拉米夫定作為新一代核苷類(lèi)高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV-DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻止纖維化的進(jìn)程，終止肝硬化的發(fā)展(fzhn)，尤其是拉米夫定不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響。該藥與干擾素合用有協(xié)同作用。共一百零二頁(yè)長(zhǎng)期服用拉米夫定會(huì)引起HBV基因突變而造

12、成耐藥，其中95%是由于HBV基因組P區(qū)中高度保守的YMDD功能區(qū)（Y酪氨酸M甲硫氨酸D天冬氨酸- D天冬氨酸）發(fā)生(fshng)突變：第552位甲硫氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）代替，突變后的HBV稱(chēng)為YVDD變異株和YIDD變異株。由于變異造成基因組核苷酸與DNA多聚酶的結(jié)合能力有降低，通常變異株的復(fù)制能力低于野生株。當(dāng)停止應(yīng)用拉米夫定治療后，野生株通常會(huì)替代變異株。 共一百零二頁(yè)HBeAg 陽(yáng)性的標(biāo)本,HBV DNA 通常有較高的濃度, HBeAg 陰性、抗HBe 陽(yáng)性的標(biāo)本, HBV DNA 濃度通常較低。當(dāng)HBV 基因組前C 區(qū)發(fā)生突變時(shí), 則可出現(xiàn)(chxin)HBeAg

13、 陰性而HBV DNA 仍保持在較高的濃度。單獨(dú)抗HBc 陽(yáng)性的血液HBVDNA 濃度通常很低。共一百零二頁(yè) 關(guān)于血液中HBV DNA 濃度與患者傳染性之間的關(guān)系(gun x), 如血清中HBV DNA 濃度大于109 拷貝/ ml, 則在日常生活密切接觸中即具有較強(qiáng)的傳染性。105 106 拷貝/ ml,則在日常生活密切接觸中的傳染性較小。小于105 拷貝/ml, 則日常生活密切接觸中幾乎沒(méi)有傳染危險(xiǎn)性。但不管HBV DNA 的濃度為多少, 哪怕是低于相應(yīng)PCR 方法的下限, 也均會(huì)引起輸血后的感染。共一百零二頁(yè) 基因分型方法, 一種在臨床上準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地對(duì)乙型肝炎病毒進(jìn)行基本分型( B

14、CD) 的方法, 該方法通過(guò)大量分析已分型的HBV 基因組序列, 尋找出HBV 各基因型的型特異性鹼基的分布規(guī)律, 設(shè)計(jì)型特異性的引物和探針, 利用已知全序列HBV 建立熒光PCR 是目前最靈敏(ln mn)的檢測(cè)方法之一, 檢測(cè)極限可達(dá)到100 copise/ ml的DNA 濃度。共一百零二頁(yè)二、丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)屬黃病毒科。目前發(fā)現(xiàn)約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和7080%的無(wú)輸血史的散發(fā)型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致。部分HCV感染者不出現(xiàn)臨床癥狀，但有50%會(huì)發(fā)展成為慢性，且易致肝硬化和肝癌。HCV主要通過(guò)(tnggu)輸血感染

15、(是輸血后肝炎的主要致病因子)，也可由靜脈注射或母嬰和家庭內(nèi)接觸而獲得。共一百零二頁(yè)（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)丙型肝炎病毒呈球形顆粒，直徑約50nm，有一脂質(zhì)包膜。核心(hxn)含單股正鏈RNA，長(zhǎng)9.4 kb。整個(gè)基因組只有一個(gè)可讀框，位于基因組中央，編碼一條含有 共一百零二頁(yè)RNA病毒中的RNA能自我復(fù)制，大部分RNA病毒是單鏈的，復(fù)制一般是先以自己為模板合成一條互補(bǔ)的單鏈，病毒原有的、起模板作用(zuyng)的鏈稱(chēng)為正鏈，新復(fù)制的RNA鏈稱(chēng)為負(fù)鏈。 共一百零二頁(yè)共一百零二頁(yè)（二）分子診斷方法1PCR 2. 核酸(h sun)雜交 3. bDNA技術(shù) 4. 基因芯片技術(shù) 共一百零二頁(yè)1. 定性檢

16、測(cè) 雖然抗HCV并不是保護(hù)性抗體，臨床上可以根據(jù)抗HCV來(lái)判斷是否感染，但由于患者免疫功能的差異，僅有部分患者出現(xiàn)抗HCV，且抗HCV尚會(huì)出現(xiàn)時(shí)陰時(shí)陽(yáng)的表現(xiàn)。采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)到HCV RNA的存在是HCV感染的確證標(biāo)志。檢測(cè)HCV-RNA可對(duì)丙型肝炎作早期(zoq)診斷，解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問(wèn)題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。在HCV的感染中，第一周內(nèi)就可以檢測(cè)出HCV RNA，共一百零二頁(yè)2. 定量檢測(cè) 可判斷HCV的傳染性及病毒復(fù)制情況，進(jìn)行病情評(píng)估、判斷病人預(yù)后。還可通過(guò)對(duì)HCV RNA拷貝數(shù)的監(jiān)測(cè)，評(píng)價(jià)干擾素和其他抗病毒藥物的療效。另外，人們注意到臨床(ln chu

17、n)分型與療效的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)如III型HCV患者對(duì)干擾素的療效更佳，此時(shí)也需要采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)HCV進(jìn)行病毒分型。共一百零二頁(yè)三、人類(lèi)免疫缺陷病毒 人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV)，顧名思義它會(huì)造成人類(lèi)免疫系統(tǒng)的缺陷。1981年，人類(lèi)免疫缺陷病毒在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類(lèi)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。至今無(wú)有效療法的致命性傳染病。該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的失去抵抗力，而導(dǎo)致各種疾病(jbng)及癌癥得以在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)。共一百零二頁(yè)人類(lèi)免疫(miny)缺陷病毒是艾滋病的病原體，自1983年首次分離出第一株HIV以來(lái)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)

18、引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3等3種。 共一百零二頁(yè) 在感染后會(huì)整合入宿主細(xì)胞的基因組中，而目前的抗病毒治療并不能將病毒根除。 病毒基因變化多樣;廣泛存在(cnzi)于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經(jīng)癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較弱，對(duì)乙肝病毒有效的消毒方法對(duì)艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長(zhǎng)、死亡率高; 病毒基因都復(fù)雜。 共一百零二頁(yè)體外生存人類(lèi)免疫缺陷病毒在人體外生存能力極差，不耐高溫，抵抗力較低，離開(kāi)(l ki)人體不易生存，常溫下只可生存數(shù)小時(shí)至數(shù)天。 HIV對(duì)熱敏感。在56條件下30

19、分鐘即失去活性，但在室溫保存7天，仍保持活性。 滅活方法共一百零二頁(yè)不加穩(wěn)定劑病毒在-70冰凍下失去活性，而35%山梨醇或50%胎牛血清在-70時(shí)冰凍3個(gè)月仍保持活性。對(duì)消毒劑和去污劑亦敏感，0.2%次氯酸鈉、0.1%漂白粉、70%乙醇、35%異丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%來(lái)蘇爾處理5分鐘能滅活病毒，1%NP-40和0.5%triton-X-100能滅活病毒而保留(boli)抗原性。對(duì)紫外線(xiàn)、射線(xiàn)有較強(qiáng)抵抗力。 共一百零二頁(yè)國(guó)際衛(wèi)生組織推薦對(duì)艾滋病病毒滅活加熱100持續(xù)20分鐘，效果較理想。艾滋病病毒的消毒主要是針對(duì)被艾滋病病毒感染者和艾滋病病人的血液、體液污染的醫(yī)療(ylio)

20、用品、生活場(chǎng)所等。例如，輔料、紗布、衣物等。對(duì)艾滋病病毒的消毒可以根據(jù)消毒物品選擇適當(dāng)?shù)奈锢矸椒ɑ蚧瘜W(xué)方法。需要重復(fù)使用的物品可用煮沸或高壓蒸汽消毒。不宜煮沸的物品可用2%戊二醛、75%酒精等進(jìn)行消毒。 共一百零二頁(yè)體液生存在室溫下，液體環(huán)境中的HIV可以(ky)存活15天，被HIV污染的物品至少在3天內(nèi)有傳染性。 近年來(lái)，一些研究機(jī)構(gòu)證明 ，離體血液中HIV病毒的存活時(shí)間決定于離體血液中病毒的含量，病毒含量高的血液，在未干的情況下，即使在室溫中放置96小時(shí)，仍然具有活力。即使是針尖大小一滴血，如果遇到新鮮的淋巴細(xì)胞，艾滋病毒仍可在其中不斷復(fù)制，仍可以傳播。 共一百零二頁(yè)病毒含量低的血液，經(jīng)過(guò)

21、自然干涸2小時(shí)后，活力才喪失;而病毒含量高的血液，即使干涸2-4小時(shí)，一旦放入培養(yǎng)液中，遇到淋巴細(xì)胞，仍然可以(ky)進(jìn)入其中，繼續(xù)復(fù)制。 所以，含有HIV的離體血液可以造成感染。盡管艾滋病毒見(jiàn)縫就鉆，這些病毒也有弱點(diǎn)，它們只能在血液和體液中活的細(xì)胞中生存，不能在空氣中、水中和食物中存活，離開(kāi)了這些血液和體液，這些病毒會(huì)很快死亡。 共一百零二頁(yè)形態(tài)結(jié)構(gòu)人類(lèi)免疫缺陷病毒直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類(lèi)脂包膜，來(lái)自宿主細(xì)胞，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41;gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過(guò)非共價(jià)(n ji)作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)，以及蛋白p

22、24形成的半錐形衣殼，衣殼在電鏡下呈高電子密度。衣殼內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來(lái)自宿主細(xì)胞的成分(如tRNAlys3，作為逆轉(zhuǎn)錄的引物)。 共一百零二頁(yè)共一百零二頁(yè)（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)HIV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科，該科病毒帶有以RNA為模板合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶。HIV顆粒的核心有兩個(gè)拷貝(kobi)的單股正鏈RNA，兩個(gè)單體通過(guò)5末端的氫鏈結(jié)合形成二聚體。每個(gè)RNA的長(zhǎng)度約為9.7kb。 共一百零二頁(yè)兩端是長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeats, LTR)，含順式調(diào)控序列，控制前病毒的表達(dá)。已證明在LTR有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子并含負(fù)調(diào)控區(qū)。LTR之間

23、的序列編碼了至少9個(gè)蛋白，可分為叁類(lèi):結(jié)構(gòu)(jigu)蛋白、調(diào)控蛋白、輔助蛋白。 1.gag基因能編碼約500個(gè)氨基酸組成的聚合前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。 2.Pol基因編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。 共一百零二頁(yè)3.env基因編碼約863個(gè)氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原決定簇，已證明(zhngmng)HIV中和抗原表位，在gp120 V3環(huán)上，V3環(huán)區(qū)是囊膜蛋白的重要功能區(qū)，在病毒與細(xì)胞融合中起重要作用。gp120與跨膜蛋白gp41

24、以非共價(jià)鍵相連。gp41與靶細(xì)胞融合，促使病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明gp41亦有較強(qiáng)抗原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。 共一百零二頁(yè)4.TaT 基因編碼蛋白可與LTR結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄(zhun l)率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)病毒mRN A的翻譯。 5.Rev基因產(chǎn)物是一種順式激活因子，能對(duì)env和gag中順式作用抑制序(Cis-Acting repression sequance,Crs) 去抑制作用，增強(qiáng)gag和env基因的表達(dá)，以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白。 共一百零二頁(yè).Nef基因編碼蛋白P27對(duì)HIV基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，以推遲病毒復(fù)制。該蛋白作用于HIv cDNA的LTR，抑制整合的病毒

25、轉(zhuǎn)錄?？赡苁荋IV在體內(nèi)維持持續(xù)感集體所必需。 7.Vif基因?qū)IV并非必不可少，但可能影響(yngxing)游離HIV感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播。 8.VPU基因?yàn)镠IV-1所特有，對(duì)HIV的有效復(fù)制及病毒體的裝配與成熟不可少。 共一百零二頁(yè)9.Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物，在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。 HIV-2基因結(jié)構(gòu)與HIV-1有差別(chbi):它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列，僅40%相同。env基因表達(dá)產(chǎn)物激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的抗體無(wú)交叉反應(yīng)。 共一百零二頁(yè)自1985 年, 美國(guó)食品(shpn)藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)

26、使用第一代酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA) 檢測(cè)試劑以來(lái), HIV 的診斷得到了快速發(fā)展, 現(xiàn)已從以前的單純H IV 抗體檢測(cè), 發(fā)展到現(xiàn)在的抗原、核酸、CD4+ 、CD8+ 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、基因芯片技術(shù)等方法, 大大縮短了檢出窗口期, 提高了檢出率。共一百零二頁(yè)近年來(lái), 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展, 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)H IV 的核酸已經(jīng)成為H IV 實(shí)驗(yàn)室診斷的重要(zhngyo)發(fā)展方向。核酸檢測(cè)技術(shù)主要用于被高度懷疑有原發(fā)感染, 且經(jīng)抗體檢測(cè)之后抗體檢測(cè)陰性或不確定時(shí); 有高危行為或暴露史, 特別是伴有相應(yīng)臨床表現(xiàn)時(shí), 早期診斷主要用于個(gè)體檢測(cè)、 血液篩查、H IV 陽(yáng)性產(chǎn)婦的嬰兒

27、診斷 。共一百零二頁(yè)原位雜交(zjio)技術(shù) 應(yīng)用特定的標(biāo)記探針以分子雜交(zjio)法直接檢測(cè)樣品中的H IV 病毒靶核酸, 初期為放射性標(biāo)記, 現(xiàn)在多以酶標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記。共一百零二頁(yè)HIV 核酸(h sun)定性檢測(cè) 最常用的技術(shù)是聚合酶鏈反應(yīng)( PCR) 和逆轉(zhuǎn)錄PCR( RT- PCR) 能在HIV 感染1 14 d 的患者血漿中檢測(cè)到H IV RNA, 可用于急性感染患者、抗體檢測(cè)不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查, 使HIV 感染窗口期縮短至2 周以?xún)?nèi)。共一百零二頁(yè)尤其在H IV 陽(yáng)性母親產(chǎn)下的嬰兒是否感染H IV 的診斷中有著非常重要的意義(yy), 前病毒DNA PC

28、R 檢測(cè)法對(duì)出生48 h 內(nèi)的嬰兒檢測(cè)敏感性為38%,出生2 周的嬰兒檢測(cè)敏感性達(dá)93%。共一百零二頁(yè)H IV 核酸定量(dngling)檢測(cè)目前HIV 核酸定量檢測(cè)技術(shù)主要有RT- PCR、分支DNA 信號(hào)擴(kuò)大系統(tǒng)( bDNA) 、核酸序列依賴(lài)的擴(kuò)增系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)( TMA) 。共一百零二頁(yè)基因芯片檢測(cè)技術(shù)該技術(shù)起始于20 世紀(jì)90 年代, 通過(guò)對(duì)H IV基因組分析, 將病毒的高度保守序列作為鑒定指標(biāo)(zhbio), 將這些特定的寡核苷酸片段作為探針, 有規(guī)律地排列于固相支持物上,然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因進(jìn)行雜交, 經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行分析得出結(jié)果, 后來(lái)應(yīng)用到H IV 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

29、。 共一百零二頁(yè) HIV 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)正朝著早期(zoq)、快速、敏感、準(zhǔn)確、自動(dòng)化方向發(fā)展, 相信不久的將來(lái), 一些新的技術(shù)會(huì)逐步應(yīng)用到這一領(lǐng)域, 使H IV 的診斷和治療技術(shù)又上一個(gè)新的臺(tái)階。共一百零二頁(yè)臨床意義：早期診斷嬰兒診斷療效評(píng)價(jià)(pngji)了解疫情共一百零二頁(yè)第二節(jié) 病原菌的基因檢測(cè)細(xì)菌廣泛分布于自然界。在人的體表和與外界相通的口腔、鼻咽腔、腸道、泌尿生殖道等存在著不同種類(lèi)和數(shù)量的細(xì)菌。人體免疫功能正常時(shí)，某些寄居在正常人體的細(xì)菌對(duì)人無(wú)害，屬于正常菌群。正常菌群與人體之間的平衡受某些條件的破壞可導(dǎo)致疾病，此時(shí)這些細(xì)菌為條件致病菌。另一些細(xì)菌因其本身(bnshn)所具有的毒性及侵

30、襲力，一旦進(jìn)入人體將會(huì)造成人體的感染，統(tǒng)稱(chēng)為病原菌。共一百零二頁(yè)病原菌的診斷方法有直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)等，但由于細(xì)菌培養(yǎng)周期較長(zhǎng)等種種原因，尚不能令人滿(mǎn)意(ln rn mn y)。分子診斷技術(shù)的應(yīng)用將使細(xì)菌感染的診斷出現(xiàn)一個(gè)質(zhì)的飛躍，同時(shí)可將分子診斷技術(shù)用于細(xì)菌分型、耐藥性的檢測(cè)中。 共一百零二頁(yè)一、淋球菌 淋球菌(gonococcus)又名淋病(ln bng)耐瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae, NG)，是淋病(ln bng)的病原菌。 共一百零二頁(yè)（一）細(xì)菌基因組結(jié)構(gòu)淋球菌染色體可編碼約5000個(gè)基因，僅為大腸埃希菌基因組的1/3，其G+

31、C含量為52%。（二）分子診斷(zhndun)方法1. PCR2. LCR 可采用連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligase chain reaction, LCR)檢測(cè)淋球菌DNA。共一百零二頁(yè)（三）臨床意義1. 對(duì)分離培養(yǎng)的菌株進(jìn)行鑒定和進(jìn)一步分析。2. 用于抗生素治療的療效觀察及監(jiān)控。3. 提高臨床標(biāo)本檢測(cè)的陽(yáng)性率和準(zhǔn)確性。4. 對(duì)淋球菌菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)分析。5. 對(duì)疑為淋球菌引起的疾病(jbng)的診斷和鑒別診斷具有決定性作用。 共一百零二頁(yè)結(jié)核(jih)分枝桿菌 結(jié)核分枝桿菌1882年由Robert Koch發(fā)現(xiàn)，對(duì)人致病的主要是人型結(jié)核分枝桿菌，引起結(jié)核病。伴隨艾滋病的流行、免疫抑制劑的應(yīng)用

32、等，結(jié)核病發(fā)病率逐年上升，免疫低下個(gè)體特別是HIV感染者更易于感染結(jié)核分枝桿菌。盡管存在有效短程化學(xué)(huxu)療法和卡介苗接種等方法防治，TB仍然是威脅人類(lèi)生命最嚴(yán)重的感染性病原。1993年，WHO宣布結(jié)核病是一個(gè)全球性危機(jī)。 共一百零二頁(yè) 目前臨床上常用的結(jié)核病診斷方法有細(xì)菌學(xué)涂片抗酸染色、活檢病理診斷和體液或組織培養(yǎng)。 細(xì)菌學(xué)涂片和活檢病理抗酸染色找到抗酸桿菌可以確診結(jié)核，但是陽(yáng)性率很低，而且不能區(qū)別結(jié)核桿菌和不典型結(jié)核桿菌。另外(ln wi)麻風(fēng)桿菌也可以表現(xiàn)為抗酸染色陽(yáng)性。體液或活檢組織的分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性可明確診斷結(jié)核及菌型，但是培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，且陽(yáng)性率非常低。雖然新的培養(yǎng)法BACTEC

33、 法顯著縮短了培養(yǎng)、菌型鑒定結(jié)果的報(bào)告時(shí)間，但由于該法使用放射性底物而使它的應(yīng)用受到了限制。并且有些類(lèi)型分枝桿菌不能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。共一百零二頁(yè)結(jié)核病的歷史(lsh)共一百零二頁(yè)態(tài)生兩靨之愁 嬌襲一身(yshn)之病共一百零二頁(yè)結(jié)核病2006年全世界流行(lixng)分布情況共一百零二頁(yè)1882年3月24日，羅伯特.科赫（ Robert Koch ）宣布(xunb)發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌-世界防治結(jié)核病日結(jié)核桿菌(ji h n jn)共一百零二頁(yè)結(jié)核桿菌(ji h n jn)結(jié)核(jih)分枝桿菌(M.tuberculosis)生物學(xué)主要特點(diǎn)：1.結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性，

34、并伴肉芽腫3.抗酸染色陽(yáng)性共一百零二頁(yè)抵抗力 四 怕 乙醇 濕熱 紫外線(xiàn) 抗結(jié)核藥物 四不怕 干燥(gnzo) 酸堿 堿性染料 青霉素等抗生素致 ?。?致病物質(zhì) 脂質(zhì)索狀因子 磷脂 硫酸(li sun)腦苷脂(sulfatide) 蠟質(zhì)D 蛋白質(zhì) 多糖共一百零二頁(yè) 感染方式 呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機(jī)體 所致(su zh)疾病 疾病種類(lèi)多樣化 以肺結(jié)核為主共一百零二頁(yè)1、直接(zhji)涂片鏡檢傳統(tǒng)(chuntng)的微生物檢查共一百零二頁(yè)2、濃縮(nn su)集菌傳統(tǒng)(chuntng)的微生物檢查共一百零二頁(yè)3、分離(fnl)培養(yǎng)傳統(tǒng)(chuntng)的微生物檢查共一百零二頁(yè)分子生物學(xué)快

35、速(kui s)診斷基因結(jié)構(gòu)分子診斷臨床意義共一百零二頁(yè)TB H37Rv株的基因組為環(huán)形DNA。0點(diǎn)表示復(fù)制起始點(diǎn)。最外層代表穩(wěn)定的RNA基因和直接重復(fù)區(qū)第二層示線(xiàn)性編碼序列第三層描述了重復(fù)DNA第四環(huán)標(biāo)出了PPE家族的位置第五個(gè)環(huán)標(biāo)出了PE家族的位置第六個(gè)環(huán)標(biāo)出了PGRSs序列的位置最中心的直方圖表示了G+C含量基因(jyn)結(jié)構(gòu)共一百零二頁(yè) 可采用PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR等方法檢測(cè)標(biāo)本中的TB DNA。PCR擴(kuò)增所選靶序列主要有65000抗原基因、MPB蛋白基因、tRNA基因、TBIS110插入序列、染色體DNA的重復(fù)序列等。擴(kuò)增產(chǎn)物可用核酸(h sun)雜交法進(jìn)

36、一步鑒定產(chǎn)物的特異性。PCR分子(fnz)診斷共一百零二頁(yè) 應(yīng)用PCR方法檢測(cè)結(jié)核桿菌的首要條件是設(shè)計(jì)(shj)一對(duì)特異性DNA引物. 另外幾個(gè)關(guān)鍵因素是:DNA提取TaqDNA聚合酶的活性PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法具體步驟分子(fnz)診斷共一百零二頁(yè)技術(shù)步驟123TBDNA的提取引物的設(shè)計(jì)產(chǎn)物的檢測(cè)共一百零二頁(yè)現(xiàn)在主要的細(xì)菌裂解方法是:蛋白酶K加表面(biomin)活性劑法;蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;反復(fù)凍融法;超聲波法;溶菌酶加表面活性劑法.DNA的提取方法主要有酚提取法和玻璃棒纏繞法一、結(jié)核桿菌(ji h n jn)DNA的提取技術(shù)步驟共一百零二頁(yè)根據(jù)不同型結(jié)核桿菌(ji h n jn)

37、的序列，目前常在下列幾種序列內(nèi)進(jìn)行引物設(shè)計(jì).常用的引物有：1、IS6110插入序列：僅見(jiàn)于MTBC.這種插入序列在基因組中的拷貝數(shù)為1-20個(gè)，選擇插入序列作為擴(kuò)增的靶序列，可以得到較高的敏感性和特異性.尤其是IS6110，是目前進(jìn)行臨床PCR檢測(cè)的首選區(qū)段.2、16SrRNA序列3、DNA重復(fù)序列二、引物的設(shè)計(jì)(shj)技術(shù)步驟共一百零二頁(yè)三、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)(jin c)方法通常PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法是經(jīng)瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色，然后(rnhu)在紫外燈下觀察或進(jìn)一步采用標(biāo)記的DNA探針雜交.為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，現(xiàn)多在引物和探針的標(biāo)記上進(jìn)行改進(jìn).由于放射性標(biāo)記物的危害性，現(xiàn)多采用

38、非放射性標(biāo)記，如生物素、熒光素、酶及化學(xué)發(fā)光劑.Wilson等在巢式PCR的內(nèi)側(cè)引物上分別摻入生物素和地高辛配基，這樣PCR產(chǎn)物兩端就分別帶有生物素和地高辛配基.技術(shù)步驟共一百零二頁(yè)多重耐藥性結(jié)核病的產(chǎn)生原因。什么是耐多藥結(jié)核病？抗結(jié)核藥物(yow)分為一線(xiàn)藥物(yow)（如：異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等）和二線(xiàn)藥物(yow)（如：注射用類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、口服抑菌類(lèi)等）。 共一百零二頁(yè)結(jié)核桿菌的分子耐藥機(jī)理異煙肼(INH) 異煙肼通過(guò)抑制結(jié)核桿菌分枝菌酸的合成，造成細(xì)胞壁破損(p sn)而殺菌。 INH的耐藥性與一個(gè)或多個(gè)基因的多種突變有關(guān)。這些基因包括編碼觸酶-過(guò)氧化物酶的KatG基因，編碼en

39、oyl-ACP還原酶的inhA基因和編碼烷基-氫過(guò)氧化物還原酶的ahpC基因。 共一百零二頁(yè) 利福平(rifampin，RFP) 利福平為一種廣譜抗菌藥物，它可與DNA依賴(lài)的RNA聚合酶的亞單位結(jié)合，從而抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄。在RFP耐藥結(jié)核桿菌rpoB基因中央附近69bp的高變區(qū)域內(nèi)，存在35種以上不同(b tn)的錯(cuò)義突變，其中絲氨酸531亮氨酸(ser531Leu)和組氨酸526酷氨酸(His526Tyr)的兩種突變最常見(jiàn)，約占總突變65%以上。13%rpoB基因突變的RFP高度耐藥株仍對(duì)利福布丁(rifabutin)敏感，提示可采用利福布丁治療某些RFP耐藥的結(jié)核病。共一百零二頁(yè)鏈霉素(srreptomycin，SM) 鏈霉素是抗結(jié)核治療(zhlio)中常用氨基糖甙類(lèi)抗生素。SM耐藥性與編碼核糖體的二部分基因突變有關(guān)，它們是編碼16S rRNA的rrs基因和編碼S12蛋白的rpsL基因。rpsL基因是主要突變位點(diǎn)，其中密碼子43最常見(jiàn)，密碼子88較罕見(jiàn)。16S rRNA分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)為次要突變點(diǎn)，即491，513，516，903核苷酸位點(diǎn)上。共一百零二頁(yè)乙胺丁醇(ethambutol，EMB) 乙胺丁醇的抗菌活性?xún)H局限于分枝桿菌，提示藥物靶位是一 種分枝桿菌特有的結(jié)構(gòu)，