分光光度法測(cè)葉綠素 文檔

1、分光光度法測(cè)定葉綠素含量作者：未知 來(lái)源：鄭州輕工業(yè)學(xué)院 時(shí)間：2006-9-22一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵参锝M織中葉綠素的分布及性質(zhì)。掌握測(cè)定葉綠素含量的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理葉綠素廣泛存在于果蔬等綠色植物組織中，并在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠體。當(dāng)植物 細(xì)胞死亡后，葉綠素即游離出來(lái)，游離葉綠素很不穩(wěn)定，對(duì)光、熱較敏感；在酸性條件下葉 綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀堿液中可水解成鮮綠色的葉綠酸鹽以及葉綠醇和甲醇。 高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a和b，兩者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。葉綠素的含量測(cè)定方法有多種，其中主要有：原子吸收光譜法：通過(guò)測(cè)定鎂元素的含量，進(jìn)而間接計(jì)算葉綠素的含量。分光

2、光度法：利用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素提取液在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值，即可用朗伯 一比爾定律計(jì)算出提取液中各色素的含量。葉綠素a和葉綠素b在645nm和663nm處有最大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm處。因此測(cè)定提取液在645nm、663nm、652nm波長(zhǎng)下的吸光值，并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式可分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。三、儀器、原料和試劑儀器分光光度計(jì)、電子頂載天平（感量0. 01g）、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦境紙、滴管。原料新鮮（或烘干）的植物葉片試劑1.96%乙醇（或80%丙酮）石英砂碳酸鈣粉四、操作步驟取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面

3、污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎 的新鮮樣品2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95%乙醇，研成均漿，再加 乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置35min。取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100mL棕色容 量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分?。用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。 最后用乙醇定容至100mL，搖勻。取葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)665nm、645nm和652nm下測(cè)定吸光度，以95%乙醇為空白 對(duì)照。五、計(jì)算按照實(shí)驗(yàn)原理中提供的經(jīng)驗(yàn)公式，分別計(jì)算植物材料中葉綠素

4、a、b和總?cè)~綠素的含量葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)及含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理植物葉綠體色素是吸收太陽(yáng)光能，進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)。它一般由葉綠素a、葉綠素b、 胡蘿卜素和葉黃素組成。這些色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑 提取。色素分離的方法有多種，紙層析是最簡(jiǎn)便的一種。當(dāng)溶劑（有機(jī)推動(dòng)劑）不斷從紙上流過(guò)時(shí)， 由于混合物（葉綠素提取液）中各種成分在固定相（濾紙纖維素所吸附的水分）和流動(dòng)相（有機(jī) 推動(dòng)劑）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動(dòng)速度不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，可將各種色素分開(kāi)。葉綠素是一種二羧酸葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇 （甲醇和葉綠醇）和葉

5、綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素分開(kāi)。葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光光度計(jì)精確測(cè)定。葉 綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時(shí)可發(fā)射出紅 光量子，因而產(chǎn)生熒光。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋 白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類(lèi)胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被氫離子所取代而成褐色 的去鎂葉綠素。去鎂葉綠素遇銅則成為銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常 用此法制作綠色多汁植物的浸漬標(biāo)本。根據(jù)朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度D與其中溶液濃度C和液層厚度L成正比

6、，即：D = KCLD :吸光度，即吸收光的量，C :溶液濃度，K :為比吸收系數(shù)（吸光系數(shù)），L :液層厚度，通常為1cm.如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸 光度的總和，這就是吸光度的加和性。今欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類(lèi)胡 蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度D，并根據(jù)葉綠素a、b及類(lèi) 胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。葉綠素a、b的丙酮溶液在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的最大吸收峰分別位于紅光區(qū)和藍(lán)紫光區(qū)，為了排 除類(lèi)胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a、b的80 %丙酮

7、提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm， 又知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的吸光系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長(zhǎng) 645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：D 663 = 82.04Ca + 9.27Cb（1）D 645 =16.75Ca + 45.60Cb ( 2 )式（1 ）、（ 2 ）中的D 663和D 645為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm和645nm時(shí)的吸光度， Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg / L為單位。解方程組（1 ）、（ 2 ），得：Ca=12.7D 663 - 2.69 D 645 （ 3 ）Cb=

8、22.9 D 645 - 4.68D 663 （ 4 ）將Ca與Cb相加即得葉綠素總量Ct :Ct=Ca+Cb=20.2 D 645 +8.02 D 663 （ 5 ）由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5 ），也 可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次吸光度（D 652 ）而求出葉綠素a、b總量：Ct= Ca+b=D 652 x 1000/34.5 （ 6 ）丙酮提取液中類(lèi)胡蘿卜素的含量：Ck=4.7D 440 - 0.27Ca+b由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公 式也有所不同。實(shí)驗(yàn)材料新鮮植物葉片。儀器設(shè)備研缽，漏斗

9、，滴管，大試管（帶膠塞），大頭針，濾紙，天平，量筒，毛細(xì)管。試管，試管架，燒杯，酒精燈，玻棒，鐵三角架，刻度吸量管，火柴，分光光度計(jì)，容量瓶，定量濾紙。藥品試劑95 %乙醇、80 %丙酮、石英砂、碳酸鈣粉、醋酸銅粉末推動(dòng)劑：按石油醚：乙醚（4 : 1 ） （ V / V ）。KOH-甲醇溶液：30gKOH溶入100mL甲醇中，過(guò)濾后盛于塞有橡皮塞的試劑瓶中。實(shí)驗(yàn)步驟葉綠體色素的提取 (1 )取植物新鮮葉片1克，洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放人研缽中。(2)研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加23mL100%丙酮，研磨至糊狀，再加 5mL100 %丙酮，過(guò)濾，即得色素提取液。(3 )如無(wú)新鮮葉片，也

10、可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片，先用105 C殺青，再在80 C 下烘于，研成粉末，密閉貯存。用時(shí)稱葉干粉1.5克放人小燒杯中，加3mL100%丙酮浸提， 并隨時(shí)攪動(dòng)。待乙醇呈深綠色時(shí)，濾出浸提液備用。葉綠體色素的分離點(diǎn)樣：取前端剪成三角形的濾紙條，用毛細(xì)管取葉綠素提取液，如圖點(diǎn)樣于色點(diǎn)”處，注意每 次所點(diǎn)溶液不可過(guò)多，點(diǎn)樣后晾干，再重復(fù)操作數(shù)次。分離：在大試管中加入推動(dòng)劑，然后將濾紙固定于膠塞的小鉤上，插入試管中，使尖端浸入 溶劑內(nèi)(色點(diǎn)要高于葉面，濾紙條邊緣不可碰到試管壁)，蓋緊膠塞，直立于陰暗處層析。當(dāng)推動(dòng)劑前沿接近濾紙邊緣時(shí)，取出濾紙，風(fēng)干，觀察色帶的分布。葉綠素a為藍(lán)綠色，葉

11、綠素b為黃綠色，葉黃素為黃色，胡蘿卜素為橙黃色。用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱。將上一個(gè)實(shí)驗(yàn)中提取的葉綠體色素溶液適當(dāng)稀釋后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：(1 )熒光現(xiàn)象的觀察。取l支試管加入濃的葉綠體色素提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同， 可觀察到反射出暗紅色的熒光。(2 )氫和銅對(duì)葉綠素分子中鎂的取代作用方法一；取兩支試管。第一支試管加葉綠體色素提取液2mL，作為對(duì)照。第二支試管加葉綠體 色素提取液2 mL，再加入50 %醋酸數(shù)滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。當(dāng)溶液變竭后，再加 入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記錄溶液顏色變化情況，并與對(duì)照試管相比較。解釋其顏色 變化原因。方法二；另取

12、醋酸一醋酸銅溶液20mL，置于燒杯中。取新鮮植物葉兩片，放入燒杯中，用酒 精燈慢慢加熱，隨時(shí)觀察并記錄葉片顏色的變化。當(dāng)葉片變褐時(shí)，取出一片葉，余下一片繼續(xù)加 熱，直至顏色不再變化為止。解釋原因。(3 )皂化作用(綠色素與黃色素的分離)取葉綠體色素提取液2 mL于大試管中，加入4mL乙醚，搖勻，再沿試管壁慢慢加人3 6mL蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻，溶液即分為兩層，色素已全部轉(zhuǎn)入上層乙醚中。用滴管吸 取上層綠色層溶液，放入另一試管中，再用蒸餾水沖洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30 %KOH 一甲醇溶液，充分搖勻，靜置?？梢钥吹饺芤褐饾u分為兩層，下層是水溶液，其中溶有皂 化的葉綠素a和b，上層

13、是乙醚溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。將上下層放入兩試 管中，可供觀察吸收光譜用。（4）葉綠體色素吸收光譜曲線將上述葉綠體色素提取液注入1cm比色杯中，另取95%乙醇作空白，于400-700nm之間， 每間隔10nm讀取光密度值。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)繪制曲線，此即葉綠體色素的吸 收光譜曲線。用同樣的方法測(cè)定皂化作用中分離出綠色素與黃色素的吸收光譜曲線，并對(duì)結(jié)果進(jìn) 行分析。（四）葉綠體色素的含量測(cè)定（1 ）取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，剪碎，混勻。（2 ）稱取剪碎的新鮮樣品0.5g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23mL80 % 丙酮，研成勻漿，再加80 %丙酮5mL，繼

14、續(xù)研磨至組織變白。（3 ）轉(zhuǎn)移到25mL棕色容量瓶中，用少量80 %丙酮沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘 渣一起倒入容量瓶中。最后用80 %丙酮定容至25mL，搖勻。離心或過(guò)濾。（4 ）將上述色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以80 %丙酮為空白，在波長(zhǎng)663nm、 645nm、652nm 和440nm 下測(cè)定光密度。（五）結(jié)果計(jì)算將測(cè)得的光密度值代入公式，分別計(jì)算葉綠素a、b、a+b和類(lèi)胡蘿卜素的濃度（mg / L ）。并按下式計(jì)算組織中單位鮮重或干重的各色素的含量：色素含量（mg/g （ fw ）=色素濃度（mg/L ） x提取液總體積（mL ） /樣品重量（g ） X 1000注意事項(xiàng)-為了避免葉綠素光分解，操作時(shí)應(yīng)在弱光下進(jìn)行，研磨時(shí)間應(yīng)盡量短些（2 ）葉綠體色素提取液不能混濁提取葉綠素提取的準(zhǔn)備工作是在一個(gè)半暗的房間里，室溫保持在25C。提取步驟如下：取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。將粉碎的1000克綠葉放進(jìn)加有少量的 碳酸鈣的丙酮中(溫度20C) 進(jìn)行萃取，直到過(guò)濾、清洗后的葉子碎片為無(wú)色。將過(guò)濾后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中， 然后輕輕地旋轉(zhuǎn)，同時(shí)加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水 溶雜質(zhì)被丟棄，只剩石油醚溶液。將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上