重組體在原核細胞中的表達與調(diào)控課件

1、重組體在原核細胞中表達與調(diào)控第1頁，共35頁?；虮磉_概述基因表達：指基因攜帶的遺傳信息，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾等復雜的生化反應，產(chǎn)生具有生物學功能的蛋白質(zhì)過程，即DNARNA蛋白質(zhì).基因表達調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工mRNA從核到細胞質(zhì)mRNA降解翻譯水平第2頁，共35頁。原核與真核生物基因組比較真核基因組比原核基因組大得多，大腸桿菌基因組約4106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級真核生物主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構成染色質(zhì)，被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分（如線粒體DNA等），這就增加了基因表達調(diào)控的層次和復雜性細菌多數(shù)基因按功能相關成串排列，組成操縱元的基因表達調(diào)控的單元，共同開啟

2、或關閉，轉(zhuǎn)錄出多順反子的mRNA；真核生物則是一個結構基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子，基本上沒有操縱元的結構，而真核細胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽鏈形成的亞基構成的，這就涉及到多個基因協(xié)調(diào)表達的問題，真核生物基因協(xié)調(diào)表達要比原核生物復雜得多第3頁，共35頁。原核基因組的大部分序列都為編碼基因，哺乳類基因組的中僅約10%的序列是編碼蛋白質(zhì)或rRNA、tRNA等的基因，其余約90%的序列功能至今還不清楚原核生物基因的蛋白質(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子和內(nèi)含子，在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪接去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)，這就增

3、加了基因表達調(diào)控的環(huán)節(jié)原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個拷貝外，重復序列不多。哺乳動物基因組中則存在大量重復序列。絕大多數(shù)真核生物的蛋白質(zhì)編碼的基因在單倍體基因組中都不重復，是單拷貝的基因 第4頁，共35頁。原核基因轉(zhuǎn)錄特點原核生物只有一種RNA聚合酶（真核細胞有3種），識別原核細胞的啟動子，催化所有RNA的合成原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是耦聯(lián)的；形成多核糖體，可在一條mRNA鏈上同時合成多條肽鏈，效率高mRNA可從兩條鏈中任一條有意鏈上轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄方向與DNA方向相反（3 5 ），并且在mRNA還沒有合成完時，翻譯就開始基因表達調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平，兩種方式：起始控制（啟動子），終止控制

4、（衰減子）原核具有SD序列，即同16S核糖體RNA 3末端堿基互補的序列操縱子結構第5頁，共35頁。外源基因在原核表達的條件通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指導宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白外源基因不能帶有間隔序列（內(nèi)含子），如cDNA或全合成的基因利用原核強啟動子及其兩側的調(diào)控SD序列與起始子密碼子ATG有合適的距離外源基因下游加上不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)正確的開放讀碼框架利用宿主調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因表達，防止產(chǎn)物毒害宿主第6頁，共35頁。外源基因在原核表達調(diào)控元件啟動子：能被RNA聚合酶識別、結合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列Pribnow box：-10區(qū)；TATAAT（與RNA聚合酶核

5、心酶結合，解旋DNA，合成RNA）-35區(qū)：TTGACA（與因子結合）代表強啟動子：乳糖啟動子（Lac）；色氨酸啟動子（Trp）；噬菌體左向啟動子（PL）；Trp-Lac雜合啟動子（Tac）；T7噬菌體啟動子第7頁，共35頁。第8頁，共35頁。乳糖操縱元 凡能與調(diào)控蛋白特異性結合、從而影響基因轉(zhuǎn)錄強弱的序列，不論其對基因轉(zhuǎn)錄的作用是減弱、阻止或增強、開放，都可稱為操縱子。 乳糖操縱元：轉(zhuǎn)錄負調(diào)控基因：操縱基因（O）；啟動子（P）；3個結構基因（Z、Y、A）誘導劑：IPTG第9頁，共35頁。乳糖操縱元基因圖和表達調(diào)控第10頁，共35頁。第11頁，共35頁。第12頁，共35頁。色氨酸操縱元 色氨酸

6、是構成蛋白質(zhì)的組分，一般的環(huán)境難以給細菌提供足夠的色氨酸，細菌要生存繁殖通常需要自己經(jīng)過許多步驟合成色氨酸，但是一旦環(huán)境能夠提供色氨酸時，細菌就會充分利用外界的色氨酸、減少或停止合成色氨酸，以減輕自己的負擔。細菌所以能做到這點是因為有色氨酸操縱元（trp operon）的調(diào)控。 第13頁，共35頁。兩種調(diào)控方式阻遏蛋白的負調(diào)控阻遏蛋白+色氨酸有活性的阻遏蛋白+操縱基因無活性的操縱基因衰減子依賴與色氨酸濃度或其他氨基酸濃度誘導物：-吲哚丙烯酸第14頁，共35頁。第15頁，共35頁。PL和PR啟動子噬菌體CI基因負調(diào)控溫度敏感的啟動子：3242原理：在42時，CI蛋白失活工作方式宿主合成CI蛋白載

7、體編碼CI蛋白第16頁，共35頁。核糖體結合位點（SD序列） 在mRNA分子中起始密碼子AUG上游8-13bp處有一段富含嘌呤核苷酸的順序，由3-9bp組成，它可以與30S亞基中的16S rRNA 3端富含嘧啶的尾部互補，形成氫鍵結合，因此有助于mRNA的翻譯從起始密碼子處開始。上述mRNA分子的序列特征1974年由J.Shine和L.Dalgarno發(fā)現(xiàn)，故稱為SD順序。第17頁，共35頁。第18頁，共35頁。大腸桿菌mRNAs的SD順序與16SrRNA的3-端的互補性16S rRNA 3 HOAUUCCUCCAUAG.5噬菌體MS2外殼蛋白 5.UCAACCGGAGUUUGAAGCAUG.

8、3復制酶 5.CAAACAUGAGGAUUACCCAUG.3噬菌體Cro 5.AUGUACUAAGGAGGUUGUAUG.3galE 5.AGCCUAAUGGAGCGAAUUAUG.3-內(nèi)酰胺酶 5UAUUGAAAAAGGAAGAGUAUG.3脂蛋白 5.AUCUAGAGGGUAUUAAUAAUG.3核糖體蛋白質(zhì)S12 5.AAAACCAGGAGCUAUUUAAUG.3RNA聚合酶5.AGCGAGCUGAGGAACCCUAUG.3trpE 5.CAAAAUUAGAGAAUAACAAUG.3第19頁，共35頁。終止子終止子（terminator，T）是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列兩類

9、終止子（按其作用是否需要因子的協(xié)助 ）不依賴因子（蛋白性終止因子）的終止子：在序列上有一些共通的特點，即有一段富含GC的反向重復序列，其后跟隨一段富含AT的序列，因而轉(zhuǎn)錄生成的mRNA的序列中能形成發(fā)夾式結構，后繼一連串U，正是RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄生成的這段mRNA的結構阻止RNA聚合酶繼續(xù)沿DNA移動、并使聚合酶從DNA鏈上脫落下來，終止轉(zhuǎn)錄。依賴因子的終止子，即其終止轉(zhuǎn)錄的作用需要因子的協(xié)同，或至少是受因子的影響?？菇K止因子：有的蛋白因子能作用于終止序列，減弱或取消終止子的作用 第20頁，共35頁。rrnB強終止子第21頁，共35頁。原核表達載體克隆載體：用于外源基因在宿主細胞中復制擴增（松弛

10、型復制子）表達載體：適用與在宿主細胞中表達外源基因融合表達非融合表達第22頁，共35頁。組建表達載體條件強啟動子兩側的調(diào)控序列選擇標記正確的讀碼框架合適的核糖體結合位點（SD序列）SD序列與起始密碼子ATG之間合適的距離質(zhì)粒的穩(wěn)定性被翻譯出的蛋白的性質(zhì)和穩(wěn)定性合適的宿主細胞第23頁，共35頁。融合型表達與天然表達融合型表達通常N-末端短的原核多肽（6His；GST；FLAG；MBP等），易親和純化具有真核抗原性抵御內(nèi)源性蛋白酶降解可作為信號肽，進行細胞內(nèi)定位天然型表達N-末端為Met接近與生物體內(nèi)的天然蛋白可應用與本身生物易被宿主蛋白酶降解第24頁，共35頁。代表載體pKK223來源于pBR3

11、22非融合型表達Tac啟動子pUC8多克隆位點rrnB rRNA轉(zhuǎn)錄終止子宿主：LacI宿主（JM105）IPTG誘導第25頁，共35頁。表達載體第26頁，共35頁。代表載體pIN分泌型表達脂蛋白基因啟動子（IPP）LacUV-5啟動子和操縱基因Lac阻遏子基因大腸桿菌分泌蛋白基因外膜蛋白基因（OmpA）片段三種密碼子讀碼框架的多克隆位點產(chǎn)物分泌至細胞間隙或培養(yǎng)基第27頁，共35頁。第28頁，共35頁。代表載體pGEX融合型表達融合谷胱肽巰基轉(zhuǎn)移酶Tac啟動子Lac操縱基因SD序列LacI阻遏蛋白基因親和層析純化融合蛋白凝血酶或Xa因子切割融合蛋白成完全天然蛋白第29頁，共35頁。第30頁，共35頁。外源基因的要求反轉(zhuǎn)錄制備cDNA人工合成基因PCR擴增目的基因第31頁，共35頁。提高外源基因表達水平的措施第32頁，共35頁。提高翻譯水平調(diào)整SD序列與起始密碼子AUG之間距離點突變改造堿基，尤其是起始密碼子緊隨的幾組密碼子，原因是改善翻譯起始和mRNA結構增強RNA的穩(wěn)定性，如插入“重復性基因外回文順序”使用原核偏愛密碼子第33頁，共35頁。減輕細胞代謝負荷誘導表達，使細菌生長與外源基因表達分開表