澤瀉翻譯定稿

1、響應(yīng)面分析法優(yōu)化澤瀉中澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯提取工藝A Yeong Lee1 Jun Yeon Park,1 Jin Mi Chun,1 Byeong Cheol Moon,1Byoung Kab Kang,2 Young Bae Seo3 Hyeun-Kyoo Shin,4 andHo Kyoung Kim1lHerbal Resources Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, Republic of Korea 2Brain Disease Research Center, Korea Ins

2、titute of Oriental Medicine, Daejeon,Republic of Korea 3Department of Herbalogy, College of Oriental Medicine, Daejeon University, Daejeon, Republic of Korea 4Herbal Medicine EBM Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon,Republic of Korea澤瀉為澤瀉科多年生草本東方澤瀉Alisma orientalis(Sam) Juz

3、ep.及其同種的干燥塊莖。 用于治療脂溢性皮炎、濕疹、煩渴和足部水腫。我們使用配有二極管陣列檢測器的高效液 相色譜測定了存在于樣本草藥中澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的濃度，鑒于澤瀉萜醇B和 澤瀉萜醇B乙酸酯的結(jié)構(gòu)，我們選擇了甲醇作為最佳溶劑。我們估計(jì)澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇 B乙酸酯在標(biāo)準(zhǔn)提取物和甲醇中的含量分別為0.0434%和0.2365%。為了優(yōu)化提取工藝，我們 采用響應(yīng)面分析法來預(yù)測澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的產(chǎn)率。該法是由15個實(shí)驗(yàn)組成的 一個中心復(fù)合設(shè)計(jì)。我們以提取時(shí)間、溶劑濃度和樣品重量作為提取參數(shù)。在提取時(shí)間81 分鐘、甲醇濃度76%、樣品重量1.25克時(shí)，澤瀉萜醇B衍生物的預(yù)測

4、濃度值為0.2388%。關(guān)鍵詞：澤瀉；瀉萜醇B；澤瀉萜醇B乙酸酯；HPLC-PDA ；優(yōu)化；響應(yīng)面分析刖言傳統(tǒng)草藥是人類歷史上文獻(xiàn)記載最全面的民間藥物之一。自古以來，許多東方國家已 經(jīng)使用傳統(tǒng)草藥治療大量疾病以及保持身體健康。1- 3但管許多傳統(tǒng)草藥具有臨床療效， 它們所包含的一系列復(fù)雜的化合物卻很少能被標(biāo)準(zhǔn)化認(rèn)知。液相色譜是一種分析復(fù)雜混合 物的強(qiáng)大工具。常用于分析那些從傳統(tǒng)草藥中發(fā)現(xiàn)的化合物。囹近年來，傳統(tǒng)中藥通過使用 以液相色譜為基礎(chǔ)的多種創(chuàng)新技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化認(rèn)知。這些新技術(shù)包括包括毛細(xì)管電泳 法、液質(zhì)聯(lián)用、膠束電動毛細(xì)管色譜法、高速逆流色譜法等等。36澤瀉為澤瀉科多年生草本東方澤瀉A

5、lisma orientalis(Sam.) Juzep.及其同種的干燥塊 莖。7-8這種草藥被用在一些東方制劑如Taeg-Sa-San和O-Ryeing-San1治療脂溢性皮炎、 濕疹、煩渴、足部水腫等。9 -11 此外，澤瀉是一種有名的東亞藥物，在中國、日本、韓國 和北美等地長期用來治療感染、炎癥、過敏、利尿、動脈粥樣硬化、高脂血癥、腎結(jié)石和 糖尿病等。W2 - M澤瀉含有三萜類成分，包括澤瀉萜醇A、B、C、澤瀉醇A 24-乙酸脂、澤瀉萜醇B 23- 乙酸脂、澤瀉醇、環(huán)氧澤瀉烯、表澤瀉秘以及糖類，如葡萄糖、果糖、蔗糖等等。8-9-12、 14 -16值得一提的是，澤瀉萜醇B乙酸酯是具有幾種

6、生物活性的重要化合物，包括抑制脂多 糖誘導(dǎo)mRNA對誘導(dǎo)性一氧化氮合酶和一氧化氮產(chǎn)物的表達(dá)。它同樣被發(fā)現(xiàn)能夠抑制補(bǔ)體 結(jié)合和抗體介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。3早期的幾份報(bào)告已經(jīng)使用HPLC-UV和HPLC-ESI-M S技術(shù)測出澤瀉中24-乙酰澤瀉萜醇 A，23-乙酰澤瀉萜醇B，23-乙酰澤瀉萜醇C和澤瀉醇各自的含量。9-13-14-17-18但尚無澤瀉 醇衍生物的最佳提取條件的研究。在本研究中，我們通過使用基于澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B 乙酸酯濃度的曲面模型來探索其最佳提取條件。實(shí)驗(yàn)植物材料澤瀉標(biāo)本收集于韓國順天市，由大田大學(xué)的Young Bae Seo教授進(jìn)行鑒定和干燥。澤 瀉(ALR 09)的憑證標(biāo)本被

7、存放在韓國東方藥物研究所(KIOM)草藥資源研究中心的標(biāo)本館?；瘜W(xué)物質(zhì)澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(圖1)購于和光化學(xué)純品實(shí)業(yè)公司(日本大阪)。高 效液相色譜級甲醇、乙醇、異丙醇，正己烷、二氯甲烷、乙腈和蒸餾水由J.T.Baker股份有 限公司(Phillipsburg,NJ,USA)制得。最佳溶劑的樣品制備使用攪拌機(jī)(Shini l實(shí)業(yè)有限公司，韓國京畿道)將澤瀉混合并磨成能通過相應(yīng)型號篩子 的粉末。為了確定最優(yōu)溶劑，將等份1.0克樣品粉末用25mL甲醇、乙醇、異丙醇、正己烷 和二氯甲烷等溶劑超聲提取2小時(shí)，并在50毫升容量瓶定容。注射前，用0.2微米膜過濾器 將2.0毫升溶液濾過(P

8、ALL Corporation, Ann Arbor, MI,USA。在三個獨(dú)立變量下對提取樣本 進(jìn)行分析。選擇最優(yōu)溶劑后，樣品通過響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。E圖1澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B壺酯的化黑構(gòu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析這個實(shí)驗(yàn)的三個測量變量分別為提取時(shí)間（X1）,甲醇濃度（X2）和樣品重量（X3）。我們 分配五個水平（2、1、0、1、2）給兩個因變量:澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的濃度（表1）。 實(shí)驗(yàn)的15個因素作為中心合成設(shè)計(jì)（CCD）的因素，符合n=2k+2k+n0，其中k是因素?cái)?shù)量。19-23 接下來，就截距、線性、平方和和交互作用按下述函數(shù)執(zhí)行回歸分析，其中P0，隊(duì)（i=1，2, 3）

9、，p.（i=1，2，3； j=1，2，3，i扇 OO圖2關(guān)于澤瀉萜醇B(前峰)和澤瀉萜醇B乙酸酯(后峰)最適分析色譜柱的色譜圖:XTerra RP18(A)，Atlantis dC18(C)和 Luna 5g C18 100A。(見聯(lián)機(jī)彩色圖形)。在同一條件下，澤瀉萜醇B乙酸酯保留時(shí)間分別為21，35和32分鐘左右。兩個標(biāo)準(zhǔn) 化合物在Atlantis dC18柱的條件下出現(xiàn)拖尾峰。在其他兩個色譜柱下峰形是好的。我們選 擇了 XTerra RP18柱，是因?yàn)樗梢詼p少分析時(shí)間。25-26我們的澤瀉樣本所含有的澤瀉萜 醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯在XTerra RP18色譜柱中大約15和21分鐘開始出峰

10、(圖3)。0.20-E I I I I I I | I I E I J I 1 I T J I I I II I I 3 J I I I | J I il I F0.005.0010.00i5.M 加 25.00 3DC0 ASM圖3澤瀉（A）,澤瀉萜醇B乙酸酯（B）,澤瀉萜醇B （C）在XTerra RP18色譜柱條件下的色譜圖。 （見聯(lián)機(jī)彩色圖形）澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的濃度變化范圍分別為0.4-120pg/mL和0.5-100pg/mLo其回歸方程（相關(guān)系數(shù)）通過計(jì)算分別為：y=76030.232 x +16057.012（R2=1.000）和 y=59806.416 x+9131

11、.577（R2=1.000）。（表 2）。澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的檢測限（LOD）分別為0.082pg/mL和0.114pg/mL。澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的定量限（LOQ）分別為0.249pg/mL和0.344pg/mL。兩標(biāo) 準(zhǔn)化合物日內(nèi)和日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于1.0%和5.0%（表3）。準(zhǔn)確度通過回收率 實(shí)驗(yàn)測定，該測試中我們添加了 12pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)澤瀉萜醇B和50ug/mL的澤瀉萜醇B乙 酸酯。澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的回收率平均值經(jīng)測定分別為103.6%和106.4%。 這證明該方法具有好的線性，精密度和準(zhǔn)確度。表2澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的線性和精密度

12、分析物回歸方程相關(guān)系數(shù)（R2）變化范圍（口g/mL）澤瀉萜醇BY=76030.232X+16057.0121.0000.4-120澤瀉萜醇B乙酸酯Y=59806416X+9131.5771.0000.5-100提取溶劑的優(yōu)化我們使用6個溶劑:甲醇、乙醇、異丙醇、正己烷、二氯甲烷和乙腈來測定澤瀉萜醇B 和澤瀉萜醇B乙酸酯的含量。為了選擇最佳的提取溶劑，我們計(jì)算了兩種化合物總提取濃 度。在二氯甲烷中，未檢測到澤瀉萜醇B，只能到檢測痕量的澤瀉萜醇B乙酸酯。乙醇和 乙腈溶劑中兩個化合物都具有很高的濃度。在甲醇中澤瀉萜醇B衍生物的濃度最高，大約 為0.2799%（表4）。提取溫度、時(shí)間、溶劑濃度、樣品重

13、量都影響天然產(chǎn)物的產(chǎn)率。特別是低濃度乙醇和水的混合溶劑通常用于提取天然產(chǎn)物。23通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，從各種醇類中選擇出 甲醇。甲醇提取物檢測到的澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的含量是最高的。擬合模型從澤瀉中提取的澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)值已列于表5中。這些 數(shù)據(jù)被用來計(jì)算二階多項(xiàng)式的系數(shù)，如表6所示。在這個模型中，各響應(yīng)變量的重要性隨 著回歸系數(shù)的增加和p值的降低而增大。R2的值總是在0和1之間，并且預(yù)測模型越有 預(yù)測性越強(qiáng)化，R2越接近1.00。28在本試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，通過使用雙組份的總值計(jì)算得出相關(guān) 系數(shù)R2的值為0.9922。F實(shí)驗(yàn)計(jì)算出較高的F值（F=56.40）和較低的P值（p0.

14、001）， 表明我們的模型顯著有效。這些值表明此二階多項(xiàng)式能夠充分代表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。表3澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯濃度的日內(nèi)和日間精密度的變異性濃度哽/mL檢測濃度（gg/mL日內(nèi)RSDa(%)準(zhǔn)確度b（%）日間檢測濃度（gg/mLRSD(%準(zhǔn)確度（%ABC1212.040.50100.3511.554.6696.236061.400.20102.3360.421.35100.70ABAd5051.570.44103.1350.911.02101.8210099.070.6999.0799.230.4299.23aRSD（%）=100 xSD/平均值b精確度（）=1-（實(shí)際濃度-測定濃度平均值）

15、/實(shí)際濃度x100cAB= “澤瀉萜醇B”的縮寫dABA= “澤瀉萜醇B乙酸酯”的縮寫表4不同溶劑中澤瀉中澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯含量溶劑澤瀉萜醇B含量（% ）澤瀉萜醇B乙酸酯含量(%均值標(biāo)準(zhǔn)差相對標(biāo)準(zhǔn)差均值標(biāo)準(zhǔn)差相對標(biāo)準(zhǔn)差甲醇0.04340.00030.80480.23650.00190.8095乙醇0.03940.00051.30310.23040.00451.9325異丙醇0.03480.00144.13570.22120.00391.7410乙月青0.04000.00092.32580.22990.00331.4517二氯甲烷N. D.a0.01510.001510.0894正已烷

16、0.01820.00063.13470.16640.00221.3147aN.D.=“未檢出”的縮寫響應(yīng)面分析法方程式(2)顯示了兩個化合物的含量與提取因素的關(guān)系Y=-0. 206851 - 0. 000309X1+0. 011077X2 -0. 004481X3+ 0. 000001680X2- 0.000005017X1X2 -0. 000063629X22+ 0. 000077500X3X1 +0. 000211X3X2 - 0.004952X23(2)表5三個實(shí)驗(yàn)變量和響應(yīng)變量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的中心復(fù)合設(shè)計(jì)矩陣序號X1 （分）X2（%）X3 （克）澤瀉萜醇B澤瀉萜醇B乙總產(chǎn)率（）（%）酸酯（

17、）60 （-1）25 （-1）1.0（-1）0.00060.00170.00231（0.0001）（0.0001）（0.0002）60 （-1）25 （-1）2.0（1）0.00060.00190.00252（0.0001）（0.0001）（0.0003）60 （-1）75（1）1.0（-1）0.03330.19660.23003（0.0017）（0.0059）（0.0075）60 （-1）75（1）2.0（1）0.03510.20170.23684（0.0012）（0.0065）（0.0074）120 （1）25 （-1）1.0（-1）0.00050.00230.00285（0.0001）（

18、0.0001）（0.0001）120 （1）25 （-1）2.0（1）0.000110.00270.00386（0.0001）（0.0005）（0.0001）120 （1）75（1）1.0（-1）0.02930.18220.21157（0.0016）（0.0062）（0.0074）8120 （1）75（1）2.0（1）0.03250.19440.2269（0.0010）（0.0016）（0.0023）9150 （2）50（0）1.5（0）0.02260.13830.1609（0.0014）（0.0098）（0.0106）30（-2）50（0）2.5（0）0.02500.15650.181410

19、（0.0014）（0.0092）（0.0112）90（0）100 （2）1.5（0）0.03120.20940.240511（0.0011）（0.0024）（0.0033）1290（0）0（-2）1.5（0）N.D.aN.D.N.D.1390（0）50（0）2.5（2）0.02100.12970.1506（0.0011）（0.0076）（0.0087）90（0）50（0）0.5（-2）0.02060.14910.169714（0.0010）（0.0048）（0.0055）90（0）50（0）1.5（0）0.02260.14810.170715（0.0012）（0.0080）（0.0091）aN

20、.D.=“未檢出“”的縮寫表6提取條件下獨(dú)立變量Y的回歸模型變異分析變量DF平方和R2F值P值線性30.1018210.8520145.290.0002*二次項(xiàng)30.0165740.138723.650.0052*矢積30.0001800.00150.260.8537總模型90.1185750.992256.400.0007*P 值 0.01.*P值 0.001每個相關(guān)系數(shù)的顯著性通過Students t實(shí)驗(yàn)和P值來檢驗(yàn)。相關(guān)系數(shù)的顯著性隨吞值的 增大以及P值的減小而增大。23 對于提取濃度來說，線性和二次項(xiàng)都是顯著的。甲醇濃度 對于澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯的產(chǎn)率具有顯著的負(fù)二次效應(yīng)，盡管

21、這個效應(yīng)未通過顯 著性檢驗(yàn)。提取時(shí)間未表現(xiàn)出顯著的影響。(表7)圖4為澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯產(chǎn)率相對于提取時(shí)間(X1)，提取濃度(X2)和樣品重 量(X3)的響應(yīng)曲面圖。圖4A，B顯示澤瀉萜醇B衍生物的含量在高濃度甲醇中呈現(xiàn)增加的趨 勢。圖4C顯示含量與提取時(shí)間和樣品重量無較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。通過使用響應(yīng)面分析法，我們所預(yù)測的澤瀉萜醇B衍生物的最大含量為0.2388%，提取 時(shí)間81分鐘，甲醇濃度76%，樣品質(zhì)量1.52克。而實(shí)際最大含量是在提取時(shí)間為90分鐘， 甲醇濃度為100%，樣品質(zhì)量為1.5克的條件下測得的，為0.2405%。盡管預(yù)測的提取濃度和 實(shí)驗(yàn)值有輕微的差異，但是預(yù)測的提取時(shí)間

22、和樣品重量值和實(shí)驗(yàn)值很接近。表7 CCD實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸結(jié)果參數(shù)參數(shù)估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差t-值P-值截距-0.2068510.106497-1.940.1240X1-0.0003090.0011350.270.7989X20.0110770.0014047.890.0014X3-0.0044810.068080-0.070.9507X1X10.0000016800.0000051200.330.7593X1X2-0.0000050170.0000072050.700.5246X2X2-0.0000636290.000009578-6.640.0027X3X10.0000775000.0003600.22

23、0.8402X3X20.0002110.0004320.490.6510X3X3-0.0049520.018533-0.270.8015*P 值 0.01OGCO30-0=0025圖4澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯產(chǎn)率的響應(yīng)曲面圖參數(shù)X1 （提取時(shí)間），X2 （提取濃度）和職3（樣品重量）關(guān)于（聯(lián)機(jī)彩色圖譜）結(jié)論我們使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了澤瀉萜醇B衍生品的提取條件。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突貧w系數(shù)為 0.9922，顯著性水平低于0.05%。提取濃度和線性及二次項(xiàng)具有顯著的關(guān)聯(lián)性，其他的參數(shù) 關(guān)聯(lián)不顯著。通過響應(yīng)面分析法，我們所預(yù)測到澤瀉萜醇最大的含量0.2388%，最佳提取 條件為：提取時(shí)間81分鐘，甲醇濃度7

24、6%，樣品重量1.52克。盡管預(yù)測的甲醇濃度和實(shí)驗(yàn) 值有輕微的差異，但是預(yù)測的提取時(shí)間和樣品重量和實(shí)驗(yàn)值很接近。我們研究發(fā)現(xiàn)甲醇的 濃度對從澤瀉中所提取的澤瀉萜醇B和澤瀉萜醇B乙酸酯含量具有直接影響。致謝本研究由東方藥物研究所“基礎(chǔ)中草藥資源實(shí)際應(yīng)用的建設(shè)” （K10020）和“優(yōu)質(zhì)草 藥選材和質(zhì)量控制的研究”項(xiàng)目支持。該項(xiàng)目是由韓國教育科學(xué)技術(shù)部和衛(wèi)生福利部提供 資金支持。參考文獻(xiàn)Hu, Y. M.; Wu, G. H.; Sze, S. C.-W.; Ye, W.; Tong, Y. Quality Assessment of Cortex Phellodendriby high-Perf

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