BD破膜劑試劑手冊(cè)中文

1、破膜劑 試劑手冊(cè)BD Cytofix / Cytoperm 固定/滲透試劑盒手冊(cè)（目錄號(hào)554714）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiStop含有莫能菌素的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）（目錄號(hào)554715）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（含布雷菲德菌素A的BDGolgiPlug蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）（目錄號(hào)555028）Ficoll是Amersham Biosciences AB的注冊(cè)商標(biāo)。 Hypaque是Amersham Health AS的注冊(cè)商標(biāo)。 BD流式細(xì)胞儀是1流激光產(chǎn)品。 僅供研究使用。 不用于診斷或

2、治療程序。 2016年Becton，Dickinson和公司。 版權(quán)所有。 本出版物的任何部分不得以電子，機(jī)械，磁性，光學(xué)，化學(xué)，手冊(cè)或其他方式以任何形式或通過任何方式復(fù)制，傳播，轉(zhuǎn)錄，存儲(chǔ)在檢索系統(tǒng)中或翻譯成任何語言或計(jì)算機(jī)語言， 未經(jīng)BD Biosciences事先書面許可。 購買不包括或攜帶任何權(quán)利轉(zhuǎn)售或轉(zhuǎn)讓本產(chǎn)品作為獨(dú)立產(chǎn)品或另一產(chǎn)品的組成部分。 未經(jīng)Becton，Dickinson和Company明確書面許可，嚴(yán)禁使用本產(chǎn)品以外的許可使用。2016BD，BD徽標(biāo)和所有其他商標(biāo)均為Becton，Dickinson和Company的產(chǎn)權(quán)。目錄BD Cytofix / Cytoperm固定

3、/滲透試劑盒BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiPlug蛋白質(zhì)運(yùn)輸抑制劑）警告和注意事項(xiàng)一般程序 A.刺激細(xì)胞1.使用BD GolgiStop的程序 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（含有莫能菌素）2。 使用BD GolgiPlug 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的程序（含布雷菲德菌素A）B.方案：細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的多色染色1收集細(xì)胞2.阻止Fc受體3.細(xì)胞表面抗原染色4.固定和滲透細(xì)胞5.備選固定和滲透方案6細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色C.流式細(xì)胞分析。D.

4、染色控制陽性染色控制2. 陰性染色控制 a. 同種型對(duì)照b.配體阻斷控制。c. 未標(biāo)記的抗體阻斷控制。解決方案樣品數(shù)據(jù)備選方案全血活化和細(xì)胞內(nèi)染色。預(yù)期結(jié)果解決方案參考文獻(xiàn) BD Biosciences提供三個(gè)試劑盒，以簡化細(xì)胞的固定和透化，用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子的免疫熒光染色。 BD Cytofix / Cytoperm 固定/滲透試劑盒提供固定/透化溶液和滲透/洗滌溶液。 BD Cytofix / Cytoperm Plus Fixation / Permeabilization Kit（含有BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）提供了這兩種溶液加上含有莫能菌素的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，用于處

5、理新鮮移植或培養(yǎng)的細(xì)胞，以促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子的積累。 BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（含有BD GolgiPlug蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）提供了兩種溶液，另外還有一種含有布非司定A的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑。這些試劑盒提供足夠的兩種染色200個(gè)細(xì)胞樣品的溶液。BD Cytofix / Cytoperm 固定/滲透試劑盒（目錄號(hào)554714）該試劑盒能夠使細(xì)胞固定和透化，其是用熒光染料共軛熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體染色細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子所必需的。 該試劑盒提供兩種試劑，固定/滲透溶液和BD Perm / Wash 緩沖液。 細(xì)胞固定和透化后，用BD Perm / Wash 緩沖

6、液洗滌細(xì)胞并稀釋抗細(xì)胞因子抗體進(jìn)行染色。注意：用BD Perm / Wash 緩沖液稀釋抗細(xì)胞因子抗體很重要，而不是用標(biāo)準(zhǔn)染色緩沖液，以保持細(xì)胞內(nèi)染色的細(xì)胞處于透化狀態(tài)。試劑盒成分： 固定/滲透溶液（125mL） BD Perm / Wash 緩沖液，10X濃縮物含有胎牛血清（FBS）*和皂角苷（使用前在蒸餾水中稀釋1:10）（100mL）注1：雖然固定/滲透溶液和BD Perm / Wash 緩沖液含有防止污染的成分，建議使用無菌移液器除去溶液，使用后立即關(guān)閉瓶子。注2：BD Perm / Wash 緩沖液作為包含F(xiàn)BS *的10 *儲(chǔ)備溶液。 該產(chǎn)品的顏色可能因批次而異，并且可能含有可見的

7、沉淀物。 顏色變化和/或沉淀物不影響產(chǎn)品性能。 BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）（目錄號(hào)554715）除了固定/滲透溶液和BD Perm / Wash BD Cytofix / Cytoperm中包含的緩沖液固定/滲透試劑盒，BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒提供含有莫能菌素的BD GolgiStop蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑。BD GolgiStop離體添加到體外或體內(nèi)刺激的細(xì)胞阻斷其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。這導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞因子蛋白在高爾基復(fù)合體中的積累，從而增強(qiáng)細(xì)胞因子染色信號(hào)（見圖2-4）。BD

8、 GolgiStop試劑，至少能處理1升細(xì)胞密度高達(dá)210 6個(gè)細(xì)胞/ mL的培養(yǎng)細(xì)胞。試劑盒成分：固定/滲透溶液（125 mL）BD Perm / Wash緩沖液，10 X濃縮液含有FBS *和皂角苷（使用前在蒸餾水中稀釋1:10）（100mL）BD GolgiStop蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑含有莫能菌素（也作為單獨(dú)組分出售;目錄號(hào)554724）（0.7mL）注意：BD Perm / Wash緩沖液是包含F(xiàn)BS的10 X儲(chǔ)備溶液。該產(chǎn)品的顏色可能因批次而異，并且可能含有可見的沉淀物。顏色變化和/或沉淀物不影響產(chǎn)品性能。 *所有血清蛋白的來源均來自美國農(nóng)業(yè)部檢查的位于美國的屠宰場BD Cytofix /

9、 Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiPlug蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）（目錄號(hào)555028）除了固定/滲透溶液和BD Perm / Wash BD Cytofix / Cytoperm中包含的緩沖液固定/滲透試劑盒，該試劑盒提供了另一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BD GolgiPlug，含有brefeldin A.參見圖2-4。BD GolgiPlug試劑，至少能處理1升細(xì)胞密度高達(dá)210 6個(gè)細(xì)胞/ mL的培養(yǎng)細(xì)胞。試劑盒成分：固定/滲透溶液（125 mL）1.BD Perm / Wash緩沖液，10 X濃縮物含有FBS *和皂苷（稀釋1:10在蒸餾水中使用前）（100mL）BD G

10、olgiPlug蛋白質(zhì)運(yùn)輸抑制劑含有布雷菲德菌素A（也作為單獨(dú)成分出售;目錄號(hào)555029）（1mL）注意：BD Perm / Wash緩沖液是含F(xiàn)BS *的10 *儲(chǔ)備溶液。該產(chǎn)品的顏色可能因批次而異，并且可能含有可見的沉淀物。顏色變化和/或沉淀物不影響產(chǎn)品性能。 警告和注意事項(xiàng)危險(xiǎn)BD Cytofix / CytopermTM緩沖液（固定和滲透溶液;組分51-2090KZ）含有4.2甲醛（w / w）。危險(xiǎn)說明吸入有害。造成皮膚刺激。造成嚴(yán)重的眼睛損傷?？赡軐?dǎo)致皮膚過敏反應(yīng)。懷疑造成遺傳缺陷?？赡軐?dǎo)致癌癥。接觸途徑：吸入?？赡芤鸷粑来碳?。防范說明穿防護(hù)服/眼睛防護(hù)。戴防護(hù)手套。不要吸入

11、霧/蒸氣/噴霧。如進(jìn)入眼睛：用水小心沖洗數(shù)分鐘。去除隱形眼鏡，如果存在并且容易做到。繼續(xù)沖洗皮膚刺激或皮疹發(fā)生：求醫(yī)/咨詢。Danger BD GolgiStopTM蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（組分51-2092KZ）含有99.61乙醇（w / w）和0.26莫能菌素，mononatriumsalz（w / w）。危險(xiǎn)性說明高度易燃的液體和蒸氣。造成嚴(yán)重眼刺激。防范說明：遠(yuǎn)離熱源/火花/明火/熱表面。禁止抽煙。戴防護(hù)手套/防護(hù)眼睛。穿防護(hù)服。如果在皮膚（或頭發(fā)）上：立即脫掉所有受污染的衣服。用水淋浴沖洗皮膚。如進(jìn)入眼睛：用水小心沖洗數(shù)分鐘。去除隱形眼鏡，如果存在并且容易做到。繼續(xù)沖洗按照地方/地區(qū)/國家

12、/國際規(guī)定處置內(nèi)裝物/容器。 一般程序細(xì)胞刺激已經(jīng)報(bào)道了用于刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的各種體外方法.1-6多克隆激活劑可用于誘導(dǎo)和表征細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞。這些包括以下內(nèi)容：佛波酯和鈣離子載體或離子霉素，植物血凝素，葡萄球菌腸毒素B和針對(duì)TCR / CD3復(fù)合物亞單位的單克隆抗體（有或沒有針對(duì)共刺激受體如CD28的抗體）。注意：據(jù)報(bào)道，單獨(dú)使用PMA的細(xì)胞活化導(dǎo)致小鼠T細(xì)胞表面的CD4的表達(dá)瞬時(shí)喪失。據(jù)報(bào)道，用PMA和鈣離子載體一起活化細(xì)胞引起CD4表達(dá)的更大和持續(xù)的降低，（Cell activation with PMA and calcium ionophore together has bee

13、n reported to cause a greater and more sustained decrease in CD4 expression）以及小鼠胸腺細(xì)胞和小鼠和人外周T淋巴細(xì)胞中CD8表達(dá)的降低.使用BD GolgiStop蛋白質(zhì)運(yùn)輸抑制劑（含有莫能菌素）的程序。每6 mL細(xì)胞加入4ulBD BD GolgiStop并徹底混勻。建議BD GolgiStop不要在細(xì)胞培養(yǎng)中保持超過12小時(shí)。注意：建議進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究測定每個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的最佳孵育時(shí)間。使用BD GolgiPlug蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（含布雷菲德菌素A）的程序BD GolgiPlug含有在4下為固體的DMSO。使用前請(qǐng)務(wù)必在

14、室溫下解凍。每1 mL細(xì)胞培養(yǎng)物加入1uL BD GolgiPlug，并徹底混勻。建議BD GolgiPlug不要在細(xì)胞培養(yǎng)中保持超過12小時(shí)。注意：建議進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究以測定每個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的最佳孵育時(shí)間。B. 方案：細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的多色染色收細(xì)胞活細(xì)胞群體可以從體內(nèi)刺激的組織或用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑處理的體外刺激培養(yǎng)物制備。細(xì)胞應(yīng)該從含有BD GolgiStop或BD GolgiPlug的培養(yǎng)基中脫出來，然后重新懸浮在染色培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并轉(zhuǎn)移到塑料管或微孔板中進(jìn)行免疫熒光染色。在染色和存儲(chǔ)過程中細(xì)胞應(yīng)避光保護(hù)。嵌合Fc受體阻斷Fc受體的試劑可用于減少非特異性免疫熒光染色在小鼠系統(tǒng)中，對(duì)

15、于FcII/ III受體（BD Fc Block？;目錄號(hào)553142）特異的純化的2.4G2抗體可用于阻斷由Fc受體介導(dǎo)的熒光染料共軛熒光標(biāo)記的抗體的非特異性染色。用Fc Block阻斷小鼠Fc受體，在100l染色緩沖液中用1gBD Fc Block / 106細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞懸液，在4下15分鐘。然后可以將細(xì)胞洗滌并用特異于感興趣的細(xì)胞表面抗原的熒光染料共軛熒光標(biāo)記的抗體染色，該抗體應(yīng)該在染色緩沖液中適當(dāng)稀釋?？梢詫碜韵嗤锓N的10正常人血清或過量的不相關(guān)純化Ig的細(xì)胞和用同型作為免疫熒光染色的抗體來預(yù)先阻斷人細(xì)胞上的Fc受體。3.細(xì)胞表面抗原染色a.在50L染色緩沖液中用適量的針對(duì)細(xì)胞表

16、面抗原如CD3，CD4，CD8，CD14或CD19（30分鐘，4）特異性的熒光染料共軛熒光標(biāo)記的的單克隆抗體。 注意：此時(shí)可以進(jìn)行不同細(xì)胞表面抗原的多色染色，適當(dāng)調(diào)節(jié)補(bǔ)償最亮熒光信號(hào)。識(shí)別細(xì)胞表面標(biāo)記的一些抗體可能不結(jié)合固定/變性抗原.因此，建議染色細(xì)胞表面抗原時(shí)細(xì)胞是活的，未固定的細(xì)胞進(jìn)行固定/透化和染色細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子。改變細(xì)胞在染色細(xì)胞表面抗原之前固定的程序需要經(jīng)驗(yàn)地鑒定合適的抗體克隆。 b.用染色緩沖液（例如，250L/微孔板洗滌，每管用1mL洗滌）洗滌細(xì)胞2次，并通過離心（250 * g）沉淀。4.固化和滲透細(xì)胞a.徹底重懸細(xì)胞，每孔（或250L管）加入100L固定/滲透溶液，4下，2

17、0分鐘。 注意：在添加固定/滲透溶液之前可以通過渦旋來避免細(xì)胞聚集。b.在1X BD Perm / Wash緩沖液中洗滌細(xì)胞兩次（例如，用于在管中染色的1mL /孔洗滌緩沖液和微孔板中染色的洗滌終體積250L）和沉淀。注意：在洗滌過程中，必須保持BD Perm / Wash緩沖液中，以保持細(xì)胞透化。5.備選固定和滲透方案 1. 為后續(xù)細(xì)胞內(nèi)染色，固定和儲(chǔ)存細(xì)胞。 a.細(xì)胞的固定和儲(chǔ)存 1.在4下用4多聚甲醛溶液重懸100L細(xì)胞，10-20分鐘（或1mL / 107細(xì)胞進(jìn)行本體固定）。 2.在染色緩沖液中洗滌細(xì)胞2次。 3.將細(xì)胞懸浮在染色緩沖液中，在4下可儲(chǔ)存細(xì)胞72小時(shí)；或在90FCS /

18、10DMSO中儲(chǔ)存細(xì)胞，在-80下儲(chǔ)存更長時(shí)間。 b.滲透固定細(xì)胞 1.對(duì)于冷凍細(xì)胞，洗2 次除去DMSO。對(duì)于4的細(xì)胞，沉淀并除去染色緩沖液。 2.在BD Perm / Wash緩沖液中重懸細(xì)胞15分鐘。 3.通過離心沉淀。 4.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色 a.在50含有預(yù)定的最佳濃度的熒光染料共軛熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體或適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照的LBD Perm / Wash緩沖液中徹底重懸固/透化細(xì)胞。在黑暗中4孵育30分鐘。b.用1X BD Perm / Wash緩沖液洗滌細(xì)胞2次（每次用1mL洗滌染色管子和在微孔板中每孔終體積250L），并在流式細(xì)胞術(shù)分析前重懸于染色緩沖液中。C

19、.流式細(xì)胞分析用細(xì)胞表面染色做對(duì)照，設(shè)置PMT電壓和補(bǔ)償?；谕突蜃钄鄬?duì)照和未染色細(xì)胞設(shè)置象限標(biāo)記。注意：來源于人PBMC的活化的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的頻率可以針對(duì)取決于供體的特定細(xì)胞因子而廣泛變化。來自一個(gè)供體的冷凍保存細(xì)胞可用于縱向研究。 對(duì)于正確的流式細(xì)胞分析，通過該方法染色的細(xì)胞應(yīng)通過光學(xué)顯微鏡和/或流光散射圖檢查，以確認(rèn)其分散良好。為了群體頻率測量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在流式細(xì)胞術(shù)分析過程中應(yīng)該獲得足夠大的樣本量。可以在數(shù)據(jù)再分析時(shí)產(chǎn)生雙變量點(diǎn)圖或概率輪廓圖，以顯示各個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的共表達(dá)水平的頻率和模式。D.染色控制陽性染色控制 BD Biosciences熒光染

20、料共軛標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體的技術(shù)數(shù)據(jù)表提供了體外培養(yǎng)系統(tǒng)的具體實(shí)例，可檢測在特定時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的頻率。通過這些方法刺激的細(xì)胞可用作實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的陽性對(duì)照。細(xì)胞活化方案的特別重要的參數(shù)包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的使用和多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢查。免疫組織化學(xué)染色的發(fā)表報(bào)告和ELISPOT分析也可以提供關(guān)于產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的不同實(shí)驗(yàn)方案的有用信息。陰性染色控制 建議使用以下三種對(duì)照中的至少一種來區(qū)別特異性染色與人工染色。未染色細(xì)胞和同種型對(duì)照或阻斷控制的組合是最佳的?？蒲腥藛T可以選擇最適合其研究需要的染色控制。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)和阻斷對(duì)照的使用由C.Prussin和D.Metcalf.6詳細(xì)描述。a

21、.同型對(duì)照用匹配的沒有相關(guān)特異性的同型對(duì)照染色。1.將細(xì)胞沉淀重懸于50L含有與抗細(xì)胞因子抗體相當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照抗體濃度的BD Perm / Wash緩沖液2.在4下孵育30分鐘。3.使用上述程序洗滌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。b.配體阻斷控制用重組細(xì)胞因子預(yù)阻斷抗細(xì)胞因子抗體。1.用至少50L 4的BD Perm / Wash緩沖液將含有細(xì)胞因子的熒光染料標(biāo)記的抗體稀釋至適當(dāng)濃度，30分鐘。2.在50l預(yù)封閉標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體中重懸固定/透化細(xì)胞（在BD Perm / Wash緩沖液中），并在4下孵育30分鐘。3.使用上述程序洗滌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。C.未標(biāo)記的抗體阻斷對(duì)照用未標(biāo)記的抗體預(yù)孵育細(xì)胞。

22、1.BD Perm / Wash緩沖液含有未標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體，在25L該液中固定/透化細(xì)胞，稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，并?下孵育30分鐘。2.孵育后，在25L BD Perm / Wash緩沖液中以最優(yōu)濃度添加熒光染料標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體，（最終體積50L），并在4溫育30分鐘。3.使用上述程序洗滌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。方案：染色緩沖液不含Mg2 +或Ca2 +的Dulbeccos PBS（DPBS）1熱滅活FCS0.09（w / v）疊氮化鈉將緩沖液pH調(diào)至7.4-7.6，過濾（0.2微米孔隙膜），并在4下儲(chǔ)存樣品數(shù)據(jù)圖1. BD Cytofix / Cytoperm溶液對(duì)細(xì)胞光散射特性、細(xì)胞表

23、面抗原染色和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的影響。圖A和B分別顯示新鮮未經(jīng)處理的小鼠脾細(xì)胞和Ficoll分離的人外周血單核細(xì)胞的向前光散射和側(cè)光散射圖。圖C和D顯示了用固定/滲透溶液處理后的相同細(xì)胞（在圖A和B中）的向前光散射和側(cè)光散射圖。圖E和F分別是用抗CD4和抗CD8染色的小鼠和人細(xì)胞的實(shí)例，隨后用固定/滲透溶液孵育。圖G和H分別是在BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的存在下在培養(yǎng)物中被激活的小鼠和人細(xì)胞的實(shí)例。用PE-anti-CD4或PE-Cy5anti-CD3染色，然后用固定/滲透溶液孵育。然后用于細(xì)胞內(nèi)IL-2（小鼠）和IFN-（人）染色。圖2.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色信號(hào)

24、的影響。在有（右圖）或沒有（左圖）2M莫能菌素（又名BDGolgiStop蛋白運(yùn)輸抑制劑）的情況下，用PMA（50ng / mL）和鈣離子載體A23187（250ng / mL）刺激PMBC 6小時(shí)。收集細(xì)胞，用PE-Cy5抗人CD3（目錄號(hào)555334）染色，固定，透化，隨后用PE抗人IL-2（目錄號(hào)554566;頂圖），PE抗 - 人類TNF（目錄號(hào)554513;中圖）或FITC抗人IFN-（目錄號(hào)554551;底圖）。圖3. 比較BD GolgiPlug和BD GolgiStop對(duì)活化的小鼠脾細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子積累的影響。通過給該小鼠細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色來評(píng)估IL-2和TNF的產(chǎn)生，在有蛋白質(zhì)

25、運(yùn)輸抑制劑BD GolgiPlug或BD GolgiStop條件下，用固定的抗CD3（25g/ ml）+可溶性抗CD28（2g/ ml）活化該小鼠脾細(xì)胞4小時(shí)，在這種情況下，BD GolgiPlug和BD GolgiStop在誘導(dǎo)IL-2和TNF積累方面相當(dāng)有效。圖4. 比較BD GolgiPlug和BD GolgiStop對(duì)再活化的純化小鼠CD4 +細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子積累的影響。在BD GolgiPlug或BD GolgiStop存在下，將活化的小鼠CD4 +細(xì)胞用PMA（10ng / mL）加離子霉素（250ng / mL）再刺激5小時(shí)，并對(duì)所列細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。在這種情況下，BD G

26、olgiPlug更有效地誘導(dǎo)TNF積聚，而BD GolgiStop更有效地誘導(dǎo)IL-4和IL-10的積累。Ficol-hypaque分離液純化人類PBMC vs 全血圖5.相同供體中，活化的PBMC或活化的全血染色時(shí)，可檢測到產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率是相當(dāng)?shù)膶碜匀齻€(gè)供體中每一個(gè)純化的人PBMC（左圖）和全血（右圖），在2M BD GolgiStop的存在下，用PMA（50ng / mL）和離子載體A23187（1g/ mL）活化5小時(shí)，固定，透化并用PE-抗人IL-4（目錄號(hào)554485; 0.06g）和FITC-抗人IFN-（目錄號(hào)554700;0.25g）染色，根據(jù)BD Bioscienc

27、es細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色方案（標(biāo)準(zhǔn)或全血法）。備選方案激活和全血細(xì)胞內(nèi)染色1.用IMDM稀釋全血1：1?；旌虾?.將細(xì)胞活化劑或絲裂原加入稀釋的血液（例如，50ng / mL PMA Sigma，目錄號(hào)P-8139 +1g/ mL鈣離子載體A23187 Sigma，Cat.No.C-7522或PMA +1M離子霉素Sigma，目錄號(hào)I-0634 - 終濃度）。添加蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑：BD GolgiPlug 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（目錄號(hào)555029）1L溶液/ 1mL稀釋血液（又名布雷菲德菌素A，1.0g/ mL終濃度）或BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（目錄號(hào)554724）0.7L溶液/ 1

28、mL稀釋血液（又名莫能菌素，2.0M終濃度）。渦旋混合。等分成12 X75 mm塑料管，200L /管。在37的5CO 2中孵育4-6小時(shí)。必須研究最佳孵育時(shí)間，孵育時(shí)間不應(yīng)超過24小時(shí)。5.加2 mL 1 X BD PharmLyse （目錄號(hào)555899），渦旋，在室溫下在黑暗中孵育10分鐘。6.旋轉(zhuǎn)5分鐘，500 X g。7.吸出上清。用染色緩沖液洗1 X。以500 g旋轉(zhuǎn)5分鐘。吸出上清。8.在100L染色緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀，該緩沖液中含有最佳濃度的細(xì)胞表面抗原特異性的熒光染料共軛標(biāo)記抗體（如FITC-，PE-，PE-Cy5-抗CD3，CD4，CD8，CD14等）的。在黑暗中室溫孵育

29、15分鐘。在染色緩沖液中洗1 X。旋轉(zhuǎn)5分鐘，500 g。吸出上清。9.加500L固定/滲透溶液固定和滲透細(xì)胞。在黑暗中和在室溫條件下渦旋和孵育20分鐘。旋轉(zhuǎn)5分鐘，500 g。吸出上清。10.加入2 mL BD Perm / Wash緩沖液洗滌細(xì)胞。在黑暗中和在室溫條件下孵育10分鐘。旋轉(zhuǎn)5分鐘，500g。吸出上清。11.在100L BD Perm / Wash緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀，該緩沖液中含有最佳濃度的熒光染共軛標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體，該抗體用于細(xì)胞內(nèi)染色，（例如0.25g/試驗(yàn)）。請(qǐng)參閱技術(shù)數(shù)據(jù)表，了解抗體特異性推薦濃度。在黑暗中和室溫下染色30分鐘。12.加2 mL BD Perm /

30、 Wash緩沖液洗滌細(xì)胞。旋轉(zhuǎn)5分鐘，500g。吸出上清13.將細(xì)胞沉淀重懸于500L PBS / 2多聚甲醛溶液（渦旋，同時(shí)加入PBS / PFA）。14.流式細(xì)胞儀分析。預(yù)期結(jié)果 用PMA /離子霉素激活正常人血液 5小時(shí)，通?？蓹z測到產(chǎn)生的IL-2，IL-4，IFN-和TNF表達(dá)細(xì)胞的頻率（淋巴細(xì)胞門）。 用LPS激活正常人血液6小時(shí)，通常可檢測到產(chǎn)生IL-1，IL-6，IL-8和MIP-1表達(dá)細(xì)胞的頻率（單核細(xì)胞門）。注意：不同供體之間典型的細(xì)胞因子 - 生產(chǎn)細(xì)胞頻率有差異。解決方案染色緩沖液不含Mg2 +或Ca2 +的Dulbeccos PBS（DPBS）1熱滅活FCS0.09（w

31、/ v）疊氮化鈉調(diào)緩沖液pH至7.4-7.6，過濾（0.2微米孔隙膜），并在4下儲(chǔ)存IMDM（BioWhittaker-目錄號(hào)12-726Q）是有利于維持培養(yǎng)中全血細(xì)胞活力的細(xì)胞培養(yǎng)基。 參考文獻(xiàn) 1.Assenmacher，M.，J. Schmitz和A. Radbruch。 1994.流式細(xì)胞術(shù)測定活化的鼠T輔助淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞因子：干擾素-和白細(xì)胞介素-4表達(dá)細(xì)胞中白細(xì)胞介素-10的表達(dá)。歐元。 J.Immunol。 24：1097年至1101年。2. Elson，L.H.，T.B.Hampman，D.D.Metcalfe和C.Prussin。細(xì)胞因子產(chǎn)生的流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定人CD4 + CD27-淋巴細(xì)胞亞群內(nèi)的Th1，Th2和Th0細(xì)胞。 J.Immunol。 154：4294-4301。3. Sander，B.，J. Andersson和U. Andersson。 1991.通過免疫熒光和多聚甲醛皂苷程序評(píng)估細(xì)胞因子。免疫。 Rev. 119：65-93。4. Vikingson，A.，K. Pederson和D. Muller。 1994.通過流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)產(chǎn)生IFN-的淋巴細(xì)胞，并與IFN-的定量測量相關(guān)。 J.Immunol。冰毒。 173：219-228。5. Jung，T.，U. S