淀粉酶基因的構建及其在大腸桿菌中的表達

1、淀粉酶基因的構建及其在大腸桿菌(amp+)中的表達一、相關背景淀粉酶是較早發(fā)現的酶類之一，早在1833年Payen和Persoz已 首次從麥芽的水抽提物中用酒精沉淀分離到淀粉酶。1894年高峰讓 吉從米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作為消化劑的酶，即高峰 淀粉酶。1919年法國Boidin和Effront首次用枯草桿菌生產淀粉酶。淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖 元等a - 1, 4-葡聚糖，水解a -1, 4-糖苷鍵的酶類的總稱?，F在淀 粉酶大致可分為四大類:第一類a-淀粉酶，廣泛分布于動物(唾液、 胰臟等)、植物(麥芽、山蓊菜)

2、及微生物。第二類。-淀粉酶(EC3.汀 2) 從底物非還原性末端順次水解每隔一個a -1,4糖苷鍵，切下的是麥 芽糖單位。第三類葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3),習慣上簡稱糖化酶， 從底物的非還原性末端順次水解a-1, 4糖苷鍵和分支的a-1,6鍵生 成葡萄糖。第四類解枝酶或異淀粉酶(EC3.2.1.9) 只水解糖原或支鏈 淀粉分支點a-1,6糖苷鍵，切下整個側枝。還有淀粉a-1, 6葡萄糖 酶是在分支點的葡萄糖單位僅一個時起作用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，通常通過淀粉酶催化水解 織物上的淀粉漿料，由于淀粉酶退漿機械作用小，水的用量少，可以 在低溫條件下達到退漿效果，具有鮮明的環(huán)保特

3、色。除此之外，不同性質的a-淀粉酶還具有許多不同的用途。耐熱 性以-淀粉酶，由于使用時溫度提高，液化完全，用酶量少，操作比 較容易，0-淀粉酶在食品工業(yè)中主要用于制造麥芽糖漿、啤酒、面 包、醬油等。在制醋工業(yè)中，常用價淀粉酶代替部分麩曲節(jié)省成本， 在白酒和其他工業(yè)中也可以用其作糖化劑。在醫(yī)藥工業(yè)上，0 -淀粉 酶的一個重要用途是制造麥芽糖，醫(yī)學上常用該酶和a -淀粉酶一道 作為消化劑使用。二、目前研究情況1 .國內外研究機構由于a-淀粉酶是具有重要應用價值的工業(yè)酶，國內外很多課題 組對它進行了研究。國內主要研究a-淀粉酶的生產菌株及其培養(yǎng)條 件；a-淀粉酶的結構以及應用性能，如耐熱性、耐酸性；

4、淀粉酶的 變性機理以及環(huán)境對 a-淀粉酶的影響；淀粉酶的固定化和動力性 質；對多種a-淀粉酶生產菌的一淀粉酶基因進行了克隆以及表達研 究。國外有代表性的研究單位有：加拿大的University of British Columbia,他們對人胰腺的a-淀粉酶結構和作用機理進行了深入的 研究；丹麥的Carlsberg實驗室主要研究大麥a-淀粉酶結構域與結 合位點；美國的Westenr Regional Research Center主要研究大麥 的a-淀粉酶與抗菌素的作用以及大麥一淀粉酶的活性位點。國內外a-淀粉酶研究方向第一利用傳統(tǒng)育種技術對生產菌進行改良；第二對不同來源的a - 淀粉酶的基因

5、進行克隆.表達及酶學性質研究；第三冬-淀粉酶結構 與功能關系的研究。三、實驗研究的目標構建出a-淀粉酶基因，并使其在大腸桿菌（amp+ ）中進行表達。 希望可以通過實驗對a -淀粉酶基因的一些功能進行研究。四、簡略研究步驟DNA提取 （電泳鑒定） PCR擴增（引物設計） （電泳鑒定） 電泳 目標帶回收 （電泳鑒定） 連接載體（質粒） 轉化大腸桿菌 菌體PCR檢測五、相關實驗詳細介紹DNA提取SDS法提取DNA（一）試劑及器材：母液：（1）1MTris-HCl：稱 Tris-Base 12.1g,雙蒸水溶解，定容至 100ml, 用濃 HCl 調 pH8.0（pH8.0）。（2）0.25M ED

6、TA：稱 Na2EDTA 2H2O9.3g,雙蒸水溶解，定容至 100ml, 用 NaOH 調 pH8.0 （pH8.0）。（3）2M NaCl :稱NaCl 11.6g ,雙蒸水溶解，定容至100ml。SDS bulfer：取母液中 1M Tris-HCl 10ml, 0.25M EDTA 20ml, 2M NaCl 25ml，定 容至100ml,加SDS2g混合。5M醋酸鉀：稱醋酸鉀49g,雙蒸水溶解，定容至100ml,乙酸調 pH4.8。TE： （10m M Tris-HCl, 0.1m MEDTA）1M Tris-HCl 1ml, 40 lEDTA 99ml雙蒸水。3M醋酸鈉（pH5.

7、2 ）：稱醋酸鈉3H2O 40.8g雙蒸水溶解定容，固 體 NaOH 調 pH 至 5.2。Tris-飽和酚。其它：離心機、研缽，7ml離心管，1.5ml離心管，大小槍頭，異 丙醇，75%乙醇等。（二）步驟：取濕菌體約400mg （ 5ml發(fā)醇液），8000rpm,離心5min,棄上清 將濕菌體放入研缽中，加液N2（-180C）約20ml研磨35次，2管 1.5ml離心管取粉末約0.5ml,各加700 H 預熱的SDSbuffer, 65C 保溫1h, 7000rpm離心6min取上清。加上清2/3體積（約500 H）的5M KAC溶液，4C,放置30min, 12000rpm，離心10min

8、,取上清加入等體積的異丙醇，-20C, 2小時以上，或過夜，4C, 8000rpm, 離心5min，收集DNA沉淀，75%乙醇洗滌2次，離心管口向下晾干， 50 l雙蒸水（即ddH2O ）溶解。Tris-飽和酚，抽提3次。加 1/10 體積的 3M NaAc （pH5.2） ,4C，放置 10min, 10000rpm, 離心10min,取上清。2倍酒精沉淀。75%酒精洗2次，涼干，50心 雙蒸水溶解。一般情況下，做前3步即可。2電泳（一）試劑及器材：50 xTAE Buffer pH8.5 1L（2M Tris-醋酸，100m MEDTA）稱 Tris-Base 242g, Na2 EDTA

9、 - 2H2O 37.2g 加 800ml 雙蒸水，充分 混勻攪拌，加57.1ml醋酸，加雙蒸水定容到1L,室溫保存。1 x TAE （取 20ml 50 xTAE+雙蒸水定容至 1L ）電泳儀、大小槍頭、離心管，溴化乙淀，mark（d2000 ）等。（二）步驟：取20ml （1xTAE ）液體，稱0.20g瓊脂糖，混合，加熱溶化, 倒入插有梳子的電泳槽中，冷卻、凝固，取出梳子，向槽中倒入TAE溶液至淹沒膠塊，樣品5l與1 pl溴汾蘭在塑料皮上混勻后點樣入膠孔內（注意不能有泡），加蓋， 通電，電壓100V，電流45mA, 40min后，關閉電源。打開蓋子，倒去TAE，取出膠塊，在EB中染色5m

10、in，后用蒸 餾水漂洗干凈，紫外分析儀中（ 260nm）,觀察電泳條帶。3 PCR擴增（一）試劑及器材：DNA提取物，Taq酶，Buffer,雙蒸無菌水（滅菌過濾）PCR儀, 電泳儀，離心機等。（二）步驟：PCR 擴增，先設定程序，94C, 3min。（94C, 30s; 55C, 30s; 72C, 1min）x30。72C, 5min。及94C, 5min。（93C, 50s; 46C,30s; 68C, 1.2min）x35。68C, 7min。將雙蒸無菌水201, Buffer 3 l,引物NS1頃l，引物NS2 1 H，dNTP 1 p l, DNA （模板）3 v l 及 Taq

11、酶 1 l 依次加入，（Taq 酶在冰上加入），總反應時間約2.5小時，反應結束后4C,冰箱保 存。（注意：加引物，dNTP及模板時需換槍頭）。1%瓊脂糖膠電泳作鑒定。剩余的再作電泳，用于回收擴增產物即目標DNA （1%膠更好，大孔梳 子）。4目標帶回收（一）試劑及器材：回收試劑盒，1xTAE Buffer （ pH8.5 ）,電泳儀、大小槍頭、離 心管，溴化乙淀，mark （ d2000 ）等。（二）步驟：PCR擴增產物，用大孔梳子膠做電泳，將目標帶用刀片切下 估稱重量（先稱小離心管重量，再稱放有膠帶的重量，兩次相差，即 為膠的重量），膠約0.1g加300 pl S1溶液，65C，保溫10

12、min, 融化完全。將300 p l的DNA瓊脂糖溶液加到一個回收純化柱上，并把柱 子裝在一干凈的2ml收集試管內，室溫下12000rpm離心1.5min。加500 p l W1洗滌緩沖液，洗滌柱子，靜置2min，室溫12000rpm 離心1.5分鐘。加500 plW1洗滌緩沖液，洗滌柱子，室溫12000rpm離心1.5 分鐘。將空柱室溫12000 rpm離心1.5分鐘，甩干殘余液體。將柱子裝在一個滅菌干凈的1.5ml離心管上，加20-30 p l T1 洗脫液在柱子中心，12000rpm,離心1.5分鐘，洗脫DNA。取3 p l收集的DNA做電泳鑒定，檢測是否回收到。5目的基因連接載體（一）

13、試劑及器材：solution2x buffer, T4DNA 連接酶,載體pMD18-T 質粒，純DNA 目標基因片段等。（二）步驟：取純化的DNA片段13 p （總量約30pL ）加質粒載體pMD18-T 1.0 p L （即 25ng ）, solution 6 p L（T4DNA 連接酶及 buffer）, 22C過 夜（連接）6轉化大腸桿菌a.感受態(tài)細胞的制備步驟：.將大腸桿菌接入100ml LB液體培養(yǎng)基中37C培養(yǎng)3小時， OD600=0.4 0.6 (109 個/ml )。.將菌液轉到50 ml預冷管中，冰浴10分鐘。(3)4C4000rpm離心10分鐘，收集菌體。管倒置1分鐘使

14、微量培養(yǎng)基流盡。每 50 ml 用 30 ml 預冷的 0.1M(pH7.2) CaCl2MgCl2 緩沖 液(80mM MgCl2,20mM CaCl2 )懸浮菌體.(6)4C4000rpm離心10分鐘，收集菌體，管倒置1分鐘使微量 培養(yǎng)基流盡。每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml冰預冷的0.1M CaCl2 ( pH7.2 ) 重懸菌體。加入終濃度15-20%甘油分裝于小離心管中(每管100-150 H)， -80C貯存?zhèn)溆?。b.感受態(tài)細胞的轉化試劑及器材：IPTG 200mg/mL, X-gal 20mg/mL, Amp 50mg/mL步驟：感受態(tài)細胞-80C取出1管(約150L),冰上液化

15、，目標基因 質粒全部加入感受態(tài)細胞，輕彈，插入冰上，冰浴30分鐘，42C熱 激90s,冷卻3-5分鐘，加LB(胰蛋白胨10g/L酵母粉5g/L,NaCl10g/L, pH7.0)培養(yǎng)其800 L,混勻，37C培養(yǎng)1小時(轉化)，取300皿 涂平板，37 C，過夜。7重組子的篩選挑單斑，加入amp終濃度為100 g/ml的液體培養(yǎng)基中16h。菌體PCR 檢測。實驗完成以后，對其結果進行分析，并對a-淀粉酶基因的一些功 能進行預測。參考文獻陳淘聲，胡學智.酶制劑生產技術M.北京：化學工業(yè)出版社，1994.梁建慶，葉志華，江秀梅,彭李嵐，張海濱.轉化條件對質粒DNA轉化大腸桿菌的影響.微生 物學雜志，2004,22 (4):1517張惠,程繼忠，李東，張桂梅,馮