DNA提取試驗(yàn)報(bào)告0001

1、生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)（二）實(shí)驗(yàn)名稱：質(zhì)粒擴(kuò)增、提取和鑒定實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過對智力擴(kuò)增、提取和鑒定試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理介紹和實(shí)際操作，加深對分子生物學(xué)基本技術(shù)的理解和掌握。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、離心機(jī)、不同型號移液槍若干支、 磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、電爐、制冰機(jī)、瓊脂糖凝膠電泳儀、超凈工作臺等。實(shí)驗(yàn)原理：質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，通過對細(xì)菌、放線菌和真菌的培 養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)對質(zhì)粒的擴(kuò)增。經(jīng)過處理的線狀dna在外界環(huán)境恢復(fù)正常的時候不能夠復(fù)性而質(zhì)粒dna可以復(fù)性，從而可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒 dna和染色體dna的分離。限制性內(nèi)切酶能特意地結(jié)合于 一端被稱為限制性酶識別系列的dna系列之內(nèi)或

2、其附近的特異位點(diǎn)上，并切割dna。當(dāng)對提取的質(zhì)粒dna進(jìn)行電泳時，同一質(zhì)粒dna其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳 動速度快.實(shí)驗(yàn)步驟：一質(zhì)粒擴(kuò)增（1 ）普通lb固體培養(yǎng)基制備：制備lb培養(yǎng)基，倒入火菌瓶中tWj壓火菌，待完全冷卻后，保存?zhèn)溆谩＃?）將大腸桿菌接種于lb培養(yǎng)基中，37 c振蕩培養(yǎng)過夜（200轉(zhuǎn)/分）二質(zhì)粒dna的提取（堿法）1將菌液倒入1.5ml的微量離心管中，12000rpm離心一分30秒，棄去上清液，以得到較多的細(xì)菌沉淀；將微量離心管開口倒置在衛(wèi)生紙上，使離心管底部的液體流盡。3、加入100dl用冰預(yù)冷的溶液i,劇烈振蕩，將沉淀徹底懸浮，然后室溫放置5分 鐘。加入

3、200 dl現(xiàn)配的溶液ii ,蓋緊管口，輕輕快速顛倒離心管（不要振蕩，以避免dna斷裂），使混合物混勻，冰浴510分鐘.加入150dl預(yù)冷的溶液iii,蓋緊管口，溫和顛倒混勻，使粘稠地細(xì)菌裂解物均勻地分布于溶液iii 中，冰浴5分鐘。取上部水相，移入新的離心管，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇（也可同時加入1/10倍體積的醋酸鈉），震蕩混勻，室溫放置10分鐘沉淀雙鏈dna,然后4C , 12000rpm 離心10min 。棄去上清液，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使離心管底部的液體流盡后，加入預(yù)冷的 1ml 70% 乙醇.棄去上清液，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體流盡，置dna干燥510分鐘。吸除上清液，

4、將管口倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥.將沉淀溶于34Wte緩沖液或滅菌水（ph8.0 ）中，儲于-20 C冰箱中三dna酶切反應(yīng)將潔凈干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf 管(最好0.5ml )編號，用微量移液槍分別加入dna ( W)和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10 X緩沖液2u 1,將管內(nèi)溶液混勻后加入0.5 W酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可以用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的 時間，以免活性降低?；靹蚍磻?yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷?如插在泡沫塑料板上)，3

5、7 c水浴鍋保溫2-3小時，使酶切反應(yīng)完全。每管加入2u10.1mo1/1 edta (ph8.0),混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱之保存?zhèn)溆?。四dna的瓊脂糖凝膠電泳取5Xtbe緩沖液100ml加蒸儲水至1000ml ,配成0。5Xtbe稀釋緩沖液，待 用。膠液的制備：稱取3g瓊脂糖置于1000ml錐形瓶中，加入300ml 0 。 5Xtbe稀 釋緩沖液，加入微波爐里加熱至瓊脂糖全部融化 ，取出搖勻，此為1%瓊脂糖凝膠液。加熱過程 中要不時搖動，使其附于瓶蓋上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜，以減少水分蒸發(fā)。膠版的制備：想冷卻至50 -60 C的瓊脂糖膠液中加入澳化乙錠 (eb)溶液使其

6、終 濃度為0.5 u lg/ml。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則溶液 出現(xiàn)氣泡，待膠完全凝固后，拔出梳子注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0。5 u x tbe稀釋緩沖液至頁面恰好沒過膠板上表面加樣：取20 u 1的酶解液與2u l10 X載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中，每加完一個樣品要更換tip 頭以防止互相污染，注意上樣時要小心操做，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿電泳：加完樣后合上電泳槽蓋，立即接通電源，控制電壓保持在60 -80V,電流在40ma以上，當(dāng)澳酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿2cm時停止電泳觀察和拍照五實(shí)驗(yàn)結(jié)果六實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過本次試驗(yàn)加

7、深了對分子生物學(xué)以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的結(jié)果。結(jié)果顯示，第三條中酶切效果良好，rna被降解的很完全，第四根沒有被酶切，質(zhì)粒 dna跟rna同時存在，出現(xiàn)了兩條亮帶，質(zhì)粒dna跟rna分離效果較好。本實(shí)驗(yàn)需要細(xì)致認(rèn)真的完成，所以特別在凝膠電泳中要十分注意以下事項(xiàng)：(1)取出梳子之前，一定要耐心等待瓊脂糖凝膠的凝固，拔梳子是一定要手穩(wěn)，而且垂直拔出；(2)點(diǎn)樣要細(xì)心，槍頭不要碰到凝膠，以免點(diǎn)樣槍刺破凝膠；(3 ) 電泳時，電極一定要連接正確(4)染色劑澳化乙錠是強(qiáng)誘變劑，有致癌性和強(qiáng)毒性，使用時一定要帶一次性手套，使用后廢液不可不可隨意丟棄.生物科學(xué)071班 姓名：劉歡 學(xué)

8、號：20073305 篇二：dna的提取和電泳實(shí)驗(yàn)報(bào) 告基因組dna的提取和電泳(實(shí)驗(yàn)五)實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈊na提取的方法，以及瓊脂糖凝膠電泳分析dna技術(shù)。二、器材和試劑器材水平瓊脂糖電泳儀，離心機(jī)，水浴鍋，研缽，離心管、移液槍、水稻幼苗等試齊IJ1mol/l tris.cl(ph8.0)的配制：稱取 12.11g 的 tris,置于 80 ml 的ddh20,加入濃鹽酸(約4.2 ml )，調(diào)節(jié)ph值至8.0 ,定容至100 ml 。0.5 mol/l edta (ph8。 0)的配制：18。61g na2edta - 2h2o ,力口入 80 ml的ddh2o ,用naoh顆粒調(diào)

9、ph值至8。0 (約需2 g ),定容至100 ml 。提取緩沖液的配制 ：100 mmol/l tris 。 cl(ph8.0 ) , 20 mmol/ledta,500 mmol/l nacl,1.5 % sds4。80/4/16 氯仿：異戊醇：乙醇5. 6? loading buffer : 0.15 % 澳酚藍(lán)，0.15 %二甲苯青 ff,5 mmol/ledta,50% 甘油三、實(shí)驗(yàn)步驟在15ml的離心管中加入 5ml的提取緩沖液,60 C水浴預(yù)熱。植物葉1-2g,剪碎，在缽體中加入石英砂，加入預(yù)熱的提取緩沖液，磨成粉末狀，60 C水浴彳呆溫20 min ,其間不時緩慢搖動。5000

10、 rpm 離心5分鐘，仔細(xì)吸取上清液至另一離心管中，加入5 ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止皮膚損傷)，室溫下 靜置5 T0分鐘，使水相和有機(jī)相混勻。室溫下離心 5000 rpm 離心5分鐘。仔細(xì)吸取上清液至另一離心管中，加入一倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀沉淀.離心5000 rpm ,離心5 min ,棄去異丙醇，室溫晾干.視沉淀多少，加入1ml左右ddh2o溶解，可在60 c水浴中放置15分鐘以上助溶取dna樣品51,加入1科16 ? loading buffer, 混勻，加入0。7%的瓊脂糖 凝膠加樣孔中，電泳，檢測dna的分子大小。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論實(shí)驗(yàn)

11、分析：本次實(shí)驗(yàn)由于種種原因我是和植保102班的同學(xué)一起做的，我們組3人，實(shí)驗(yàn)過程比較嚴(yán)謹(jǐn)，受到了老師的表揚(yáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也很令人滿意。下面是實(shí)驗(yàn)過程中的注意點(diǎn)：1、研磨不能太久太用力，會導(dǎo)致dna片段斷掉。2、實(shí)驗(yàn)室的某些試劑，如氯仿，有毒性，應(yīng)帶手套進(jìn)行。電泳的時候不知是時間的原因還是都做得不錯，結(jié)果相差不是很遠(yuǎn)（如上圖），第五組和第六組是我們的，第六組是我自己加的。實(shí)驗(yàn)過程中要耐心細(xì)心，這樣才能得到滿意的結(jié) 果。園藝101石穎20100107011篇三：浙大生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告 dna的提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：生化實(shí)驗(yàn)甲指導(dǎo)老師：成績： 實(shí)驗(yàn)名稱：植物基因組dna的提取實(shí)驗(yàn)類型：生化定性實(shí)驗(yàn) 同組學(xué)生姓

12、名：及純度與含量的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?（必填） 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）八、討論、心得 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)并掌握植物基因組dna的提取原理和方法；2、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的原理和操作；3、學(xué)習(xí)并掌握對電泳檢測基因組dna結(jié)果的初步分析；4、學(xué)習(xí)紫外吸收法測定核酸基本原理和方法；5、學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收法測定基因組dna純度與含量的方法。二、實(shí)驗(yàn)基本原理 植物基因組dna的提取方法就其提取原理主要有二種：十六烷基三乙基澳化鏤（ctab）法、十二烷基硫

13、酸鈉（sds ）法。十六烷基三甲基澳化鏤和十二烷基硫酸鈉等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使dna得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸（dna、rna ）水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使dna沉淀，沉淀dna溶于te溶液中，即得植物基因組dna溶液.由于植物中的次生代謝產(chǎn)物一多酚類化合物可介導(dǎo) dna降解，而多糖的污染也是影響植物核酸純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及dna聚合酶等分子生物學(xué)酶類 的生物活性。傳統(tǒng)的ctab -dna提取法步驟多，較煩瑣,dn

14、a產(chǎn)率低,而且由于酚很難完全去 除，容易影響以后的酶切等工作的效率。sds法操作簡單，溫和，也可提取到較高分子量dna,但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多，這將直接影響dna的限制性核酸內(nèi)切酶酶切效果。由于植 物細(xì)胞勻漿含有多種酶類（尤其是氧化酶類）對dna的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中 需加入抗氧化劑或強(qiáng)還原劑（如疏基乙醇）以降低這些酶類的活性.本實(shí)驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉（sds ）法提取植物基因組 dna ,基因組dna提取后，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組 dna分子量大小、純度；用紫外吸收法測定基因組 dna純 度與含量.dna的瓊脂糖凝膠電泳鑒定：dna分子在瓊脂糖凝膠中有電荷效應(yīng)和分子篩效

15、應(yīng)。dna分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，它在電場中向正極移動.在一定的電場強(qiáng)度下,dna分子的遷移速度取決于分子篩效 應(yīng)，即具有不同的相對分子量的dna片段泳動速度不同。dna片斷在凝膠中當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料澳化乙錠（eb ）染色后，在紫外光下可見橙紅色帶 ，并可確定dna片斷在凝膠中 的位置。紫外吸收法測定基因組dna純度與含量核酸-dna和rna所含堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)（喋吟環(huán)和喀咤環(huán)）的共軻雙鍵具有紫外吸收的性質(zhì)，它們在260nm處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長進(jìn)行核酸含量的測定 。波長為260nm時，dna或rna的光密度的大小不僅與總含量有關(guān)，也與它們的不同構(gòu)型而有差異

16、。對標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1g / ml 時，dna鈉鹽的od260 =0。02 .當(dāng)od260 = 1時，雙鏈dna含量名勺為50科g / ml單鏈dna含量名勺為37g / mlrna含量名勺為40科g / ml寡核甘酸含量約為 30 dg / ml（由于底物不同有差異）1、核酸樣品dna、rna含量的測定：如用1cm光徑石英比色皿，用h2o稀釋dna或rna樣品n倍并以h2o為空白對照， 根據(jù)此時讀出的od260值即可計(jì)算出本品稀釋前dna的含量：dna （ g/ wD =50Xod260 讀數(shù) x dna 樣品稀釋倍數(shù) /1000rna（科g/ ） =40 x od260 讀數(shù)x rna

17、 樣品稀釋倍數(shù)/1000若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進(jìn)行定量，可使用澳化乙錠法或其他方法進(jìn)行估算。當(dāng)dna樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，會影響dna吸光度的準(zhǔn)確測定。 由于dna在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則 集中在230nm處。所以，一般情況下同時檢測同一樣品的od260、od280和od230 ,計(jì)算它們的比值來判斷核酸樣品的純度.2、核酸樣品純度判斷的一般標(biāo)準(zhǔn)：dna 純度：od260/od280 弋d 8,表示為純的 dna;od260/od2801.9,表示有 rna 污染；od260/od2801

18、。6,表示有蛋白質(zhì)、酚等?虧染. rna 純度:1 。 7 od260/od2802.0時，表示可能有異硫鼠酸殘存 .od230/od260 的比值應(yīng)在0。4-0。5之間，若比值較高說明有殘余的鹽和小分子 如核甘酸、氨基酸、酚等的存在。若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進(jìn)行定量；同時也會影響酶切和pcr的效果。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料：植物幼嫩葉子2、實(shí)驗(yàn)試劑(1 )基因組dna提取緩沖液(2)氯仿：異戊醇：乙醇抽提液(3) te緩沖液(4 )平衡酚：(5) rna 酶 a(6)酚/氯仿(7)氯仿/異戊醇(8 )異丙醇、無水乙醇、70 %乙醇.(9 ) 3mol/l

19、naac5 xtbe緩沖液(11 ) 6 x電泳上樣緩沖液1。0 %瓊脂糖凝膠ebdna 分子量 markers:125,564, 2027 , 2322 , 4361 , 6557 ,9416,23130bp。ddh2o ;四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、研體2、離心機(jī)、離心管（7ml、5ml ）及離心管架；3、微量移液器10ul、200ul、1000ul 及槍頭；4、恒溫水浴箱65 C5、制冰機(jī)；6、冰箱；7、恒溫水浴箱37 C ;8、微波爐；9、電泳儀及電泳槽；10、紫外檢測儀。11、紫外分光光度計(jì)；12、石英比色皿 （0。5cm光徑）或1cm光徑的微量石英比色皿（50ul、100ul ）。（二）

20、瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組dna1、制膠（1 %瓊脂糖凝膠）（此步驟由實(shí)驗(yàn)室老師準(zhǔn)備）在膠模上架好梳子。稱取01g瓊脂糖，置于250ml錐形并S中，加100ml 0.5 x tbe電 泳緩沖液，加熱熔化至無顆粒狀瓊脂糖，待其冷卻至5060 c后，加入eb ,使其終濃度為0.5mg/l,搖勻后立即倒入準(zhǔn)備好的膠模中，待膠凝固后，放入電泳槽中，倒入適量0。5xtbe （剛好淹過膠面），拔去梳子備用。（注:eb為誘變劑、致癌物，接觸凝膠必須戴手套 操作）2、加樣取5ul純化的dna原溶液樣品，與1ul 6 x電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加 入樣品槽中（注：勿劃破或戳穿加樣孔，勿帶入氣泡）。若d

21、na含量偏低，則可依上述比例增 加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要換槍頭以防互相污染。注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。3、電泳加完樣后，蓋上電泳槽蓋，立即接通電源，使電壓調(diào)到100v,恒壓電泳。當(dāng)澳酚藍(lán)條帶 移動到距凝膠前緣約 2cm時，停止電泳（約需3060min）.4、觀察和拍照取出膠塊置于紫外燈下觀察 ，dna存在處可顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光帶，再用成像儀進(jìn)行拍照，以便于分析。（注：紫外光對眼睛有害，觀察時戴上防護(hù)鏡或眼鏡，或隔著玻璃 或有機(jī)玻璃觀察）.紫外吸收法測定基因組 dna純度與含量將提取的植物基因組dna樣品吸取20ul,加到新的

22、5ml離心管中，再加一定量的ddh2o 或te緩沖液（ph 8 。 0）稀釋100倍，用0.5cm 光徑石英比色皿（約需1.6ml樣品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度計(jì)上測定230nm、260nm、280nm處的吸光度。計(jì)算植物基因組 dna樣品溶液的dna的含量以及dna樣品的純度。六、結(jié)果與分析（一）這是電泳后得到的照片，其中從右往左數(shù)第七條帶為我所做樣品的基因組（二）紫外吸收法測定基因組 dna純度與含量1、植物基因組dna樣品溶液的dna的含量：dna （科 g/ “）=959.328ng/ul2、植物基因組dna樣品溶液的dna的純度：od260/od280= 1.973、樣品純

23、度判斷 od260/od280 od260/od280 od260/od280od230/od260= 2。078,表示為純的dna;1.9 ,表示有rna 污染；線斗犬dna 開環(huán)dna 膠濃度的影響：濃度越低，相同核酸分子遷移越快，一般常用的凝膠濃度為1%2%;（4）電場強(qiáng)度的影響：電場強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著 電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，（一般5v/cm）（電場強(qiáng)度）。而對于大片段電泳，甚至用0.51。0v/cm 電泳過夜。進(jìn)行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠 。eb的影響：澳化乙錠（eb）插入雙鏈dna造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加. 電

24、泳緩沖液的影響：核酸電泳常采用tae、tbe、tpe三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利 弊。tae價(jià)格低廉，但緩沖能力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán) 。tpe在進(jìn)行dna回收時， 會使dna污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用tbe緩沖液。在緩沖液中加入 edta ,可 以鰲合二價(jià)離子，抑制dnase,保護(hù)dna。緩沖液ph常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負(fù)電， 向正極移動. 堿基組成與電泳溫度的影響：一般影響不大在dna提取過程中必須始終注意以下幾個關(guān)鍵問題：（1）dna的二級結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、低鹽濃度、有機(jī)溶劑、酰胺類、尿素等）的影響引起雙鏈解開，即變性”，因此抽提時避免使用

25、變性的條件.（2 ）抑制內(nèi)外源dnase的活力。dnase就象一把刀，它能把大分子的dna切成碎片， 所以要加以杜絕，現(xiàn)可以通過多種途徑來做到這一點(diǎn)：a、低溫操作；b、調(diào)節(jié)ph,使偏堿（ph8。0） ;c、抽提液中加表面活性劑；d、加螯合劑（edta ）除去酶的鋪助因子 （mg2+）,使酶活性喪失。（3）防止化學(xué)降解。如過酸或過堿以及其它化學(xué)因素，會使dna降解，一般綜合考慮，取ph8.0 左右為宜。（4）防止物理因素降解.如溫度太高或機(jī)械張力剪切等 ,dna分子特別大，極易被機(jī)械 張力拉斷，甚至在細(xì)管中稍急一些的流動也會使 dna斷裂，所以在抽提過程中要特別注意這一 點(diǎn)，操作過程要盡量簡便、

26、溫和、減少攪拌次數(shù)，也不要劇烈搖動。（5）植物的次生代謝物 （主要是胞質(zhì)內(nèi)的多酚類或色素類化合物 ）對核酸提取有干擾作 用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取 dna的材料，這是因幼嫩的 新生組織次生代謝物較少，dna含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鮮的。由結(jié)果可知，在加入rna酶的時候可適當(dāng)多加一點(diǎn)，以免造成得到的dna樣品含較多 rna雜質(zhì)。篇四:dna 提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告注：1、報(bào)告內(nèi)的項(xiàng)目或內(nèi)容設(shè)置，可根據(jù)實(shí)際情況加以調(diào)整和補(bǔ)充.2、學(xué)生提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告時間為實(shí)驗(yàn)后10日內(nèi)。篇五：dna提取及pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)報(bào)告pcr擴(kuò)增及dna瓊脂糖凝膠電泳劉琳1131428 環(huán)境科學(xué)一、

27、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握pcr擴(kuò)增的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。.對擴(kuò)增后的dna進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，并分析相應(yīng)結(jié)果。 二、實(shí)驗(yàn)原理pcr擴(kuò)增多聚酶鏈反應(yīng) （pcr ）技術(shù)的原理類似于 dna的天然復(fù)制過程。在微量離心管中加入適 量緩沖液，加入微量模板dna、四種脫氧核甘酸 （dntp ）、耐熱t(yī)aq聚合酶及兩個合成 dna 的引物，而后加熱使模板dna在高溫下（94C）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶 液溫度，使合成引物在低溫（55 C ）與模板dna互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72C）,在tap酶作用下，用四種dntp為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板dna的一

28、條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫退火和dna合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物dna重復(fù)合成，并在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物dna可作為后一循環(huán)的模板dna而參與dna的合成，使產(chǎn)物dna的量按指數(shù)方式擴(kuò)增。經(jīng)過3040個循環(huán)，dna擴(kuò)增即可完成。dna瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)dna分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，dna分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。dna分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的dna分子的遷移速度不同。該電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用dn

29、a分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。三、實(shí)驗(yàn)材料儀器：pcr擴(kuò)增儀、0.2ul薄壁管、1。5ml離心管、移液槍、槍頭、微波爐、電泳 儀、水平電泳槽、制膠版、紫外透射儀。試齊ij : tapdna聚合酶、dntp、buffer 、兩種引物、16s全長dna樣本、無菌ddh2o、模板dna 、tbe、瓊脂糖、eb、顯色齊U。四、實(shí)驗(yàn)步驟pcr擴(kuò)增本次試驗(yàn)選擇細(xì)菌16s rdna v3區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)計(jì)算，首先取1。5ml離心管按照2。5ul 10 x buffer 、1 ul dntp 、 0.5 ul 341gc、0。5 ul 534、0.125 ul taq 、19

30、.375u ddh2o 的比例配置足量的pcr反應(yīng)體系。分別向9個薄壁管中分別加入 24 ul的反應(yīng)體系，并分別添加8種不同白模版， 并于第9個薄壁管中加入無菌 ddh2o作為陰性對照。將薄壁管放入pcr擴(kuò)增儀中，按照預(yù)定程序進(jìn)行 pcr擴(kuò)增。其中循環(huán)過程需要達(dá)到3040次。程序如下：預(yù)變性：94 3min循環(huán)：94 C 變性30s55 C退火30s72 C延伸30s末次延伸:72 C 5minpcr擴(kuò)增完成后，將樣品取出并保存于15 C環(huán)境中。dna瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)1稱取0。2g瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的0。5Xtbe電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。搖勻，待冷

31、卻至60 C左右，在膠液內(nèi)加入適量的eb。取有機(jī)玻璃制膠板槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60 C左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面. TOC o 1-5 h z 待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入0.5 xtbe電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。取1科1緩沖?和5dl待測 dna樣品混合后，用移液槍滴加至凝膠的加樣孔中。接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過 5v/cm,開始電泳。點(diǎn)樣端放陰極端.根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)電壓使分帶清晰.觀察澳酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動。當(dāng)其移動至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳.7在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張

32、保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈，通過觀察孔進(jìn)行觀察.五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論如圖所示：從左至右，分別是模版1-8號，第9列為陰性對照。前8列均有明顯的條帶出現(xiàn)，而陰性對照無顯示，說明擴(kuò)增整體效果很好。圖中有上下兩條線，上面一條線所覆蓋的條帶基本可以代表擴(kuò)增的產(chǎn)生的片段位置，參照圖可以看出擴(kuò)增片段在200bp左右.在第9個陰性對照的第二條線處可以看到較為模糊的條帶，并非是出現(xiàn)假陰性，而是由于二聚物而產(chǎn)生的條帶.通過該條帶與最右側(cè)的marker 對比可知該片段出現(xiàn)在 100bp左右，并非由于實(shí)驗(yàn)操作等問題而產(chǎn)生的污染。實(shí)驗(yàn)的照片顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果有拖尾現(xiàn)象，但是并不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn).在實(shí)驗(yàn)過程中由于有些試劑加到了管壁上面，并沒有完全加入，可能會出現(xiàn)一些誤差.另外在第1列